與黃瓜抗白粉病緊密連鎖的兩個snp標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種與黃瓜抗白粉病緊 密連鎖的SNP標記。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜（Cucumis sativus L.)是萌蘆科（Cucurbitaceae)甜瓜屬（Cucumis) - 年生蔓生草本植物，原產(chǎn)溫暖濕潤的喜馬拉雅山南麓的印度北部地區(qū)，傳入我國栽培已 有2000多年的歷史。黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之 一。據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO)統(tǒng)計，2012年我國黃瓜栽培總面積達115. 25萬公頃，年產(chǎn)量達 4804. 88萬噸，分別占世界總量的54. 63%和73. 77%。黃瓜生產(chǎn)中面臨多種病害威脅，其 中白粉病是最為嚴重的病害之一，常造成嚴重的產(chǎn)量與質(zhì)量損失。黃瓜白粉病由專性寄生 菌（Podosphaera xanthii)引起的真菌性病害，主要侵染植株的葉片和莖。白粉病在黃瓜 田間生長的各個時期均可發(fā)生，在苗期發(fā)病可造成黃瓜生長減弱，在開花期發(fā)病可導(dǎo)致后 期黃瓜減產(chǎn)20?40 %，在結(jié)瓜期發(fā)病，會導(dǎo)致植株葉片枯黃，果實生長緩慢，植株早衰，嚴 重影響果實的品質(zhì)和產(chǎn)量。使用化學(xué)藥劑防治不僅浪費人力物力，污染環(huán)境，還使果實農(nóng)藥 殘留增加。傳統(tǒng)抗病育種周期長，需要大量及多代配置雜交組合及接種白粉病觀察。
[0003] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子育種技術(shù)大大加快了抗病育種的進程，顯 著縮短了抗病新品系的選育周期。分子育種的前提是獲得與目標性狀密切相關(guān)的分子標 記或功能基因。利用分子標記輔助選擇目標性狀，可提高選擇效率，縮短育種周期。雖然 白粉病是重要的病害之一，然而對于抗白粉病基因的定位研宄相對薄弱。目前的報道主要 集中于抗白粉病QTL鑒定，尚未有SNP標記用于黃瓜育種性狀輔助選擇的報道。Sakata 等（2006)檢測到6個與黃瓜抗白粉病相關(guān)的QTL(Chrl、Chr5、Chrl6、Chr7)(所用標記： STS)。Hofstede和de Ruiter等（2008)檢測到兩個黃瓜抗白粉病QTL，分別為與葉片抗性 相關(guān)的pm-Ι，以及與下胚軸抗性有關(guān)的pm-h (所用標記：SSR)。Zhang等（2011)鑒定到三 個位于 Chr5 的 QTLs (pm5. 1，pm5. 2and pm5. 3)，以及 1 個位于 Chr6 的 QTL(pm6. 1)(所用標 記：SSR)。He等（2013)使用WI 2757和True Lemon獲得的F2:3群體對黃瓜白粉病基因進 行定位，構(gòu)建了包含七個連鎖群共610. 4cM的連鎖圖譜，在第5連鎖群上檢測到兩個主效 QTL(pm5. 1，pm5. 2)與兩個微效 QTL(pm3. 1，pm4. 1)(所用標記：SSR)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種與黃瓜抗白粉病QTL緊密連鎖的SNP標記及提供用于擴增上述 SNP標記的引物對。
[0005] 本發(fā)明所述的兩個與黃瓜抗白粉病緊密連鎖的SNP標記，是Chr6SNP-pmO 1 和Chr6SNP-pm02,其中Chr6SNP-pm01位于黃瓜基因組第6號染色體4, 450, 551處 Chr6SNP-pm021位于黃瓜基因組第6號染色體6, 822, 412處。Chr6SNP-pm01處堿基為G的 黃瓜高抗白粉病，此處為A的黃瓜高感白粉病。Chr6SNP-pm02處堿基為C的黃瓜高抗白粉 病，此處為T的黃瓜高感白粉病。
[0006] 本發(fā)明還提供了一組用于檢測上述與黃瓜抗白粉病相關(guān)的SNP的dCAPS標記的 引物對，包括 Chr6SNP-pmO 1 的上游引物 5 ' -GGTCGCTTAAGAGCAGTTCAATTTA-3 ' (SEQ ID NO. 1)，反向引物 5' -GTCGAAATGACTCAACAACG-3' (SEQ ID NO. 2) ;Chr6SNP-pm02 的正向引 物 5 ' -TCCATCCGCTTATCAATC-3' (SEQ ID NO. 3)，反向引物 5 ' -TGGCGGTGCTGCCGCCGCTCCA CTT-3r (SEQ ID NO.4)〇
[0007] 本發(fā)明還公開了所述的SNP及衍生的dCAPS引物在黃瓜抗白粉病分子標記輔助育 種中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，具體方法是：
[0009] 1)提取待檢測黃瓜基因組DNA ;
[0010] 2)以待檢測黃瓜基因組DNA為模板，利用上述SNP衍生的dCAPS引物引物對，進行 PCR擴增反應(yīng)；
[0011] 3)使用AluI限制性內(nèi)切酶酶切Chr6SNP-pm01引物對所擴增的PCR產(chǎn)物，使用 DdeI限制性內(nèi)切酶酶切Chr6SNP-pm02引物對所擴增的PCR產(chǎn)物酶切；
[0012] 4)經(jīng)上述限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，如條帶與Jin5-508 - 致，則為抗白粉病品系；如條帶與D8 -致，則為感白粉病品系。
[0013] 本發(fā)明利用變異組學(xué)與群體遺傳學(xué)的方法篩選到與黃瓜抗白粉病緊密連鎖的SNP 標記，通過測序和轉(zhuǎn)化為dCAPS標記的方法檢測黃瓜基因型，根據(jù)基因型即可判斷黃瓜抗 白粉病差異性，從而加速黃瓜抗白粉病品系選育進程。同時，這兩個SNP標記也為黃瓜抗白 粉病基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0014] 圖1是親本及各級病葉（Pl :感白粉病親本，P2 :抗白粉病親本JIN5-508)
[0015] 圖2是部分SSR標記親本間（Pl :感白粉病親本，P2 :抗白粉病親本JIN5-508)聚 丙烯酰胺凝膠電泳多態(tài)性。
[0016] 圖3是SSR標記在F2中的聚丙烯酰胺凝膠電泳多態(tài)性檢測。
[0017] 圖4是SNP標記在親本間的瓊脂糖凝膠電泳多態(tài)性檢測。
[0018] 圖5是Chr6SNP-pm01 (圖5左）和Chr6SNP-pm02 (圖5右）在F2中的瓊脂糖凝 膠電泳多態(tài)性檢測。
[0019] 圖6是基于？2重組株對黃瓜抗白粉病QTL進行精細定位（X :重組株）。
[0020] 圖7是Chr6SNP-pm01在八個黃瓜品系中的瓊脂糖凝膠電泳多態(tài)性檢測（Pl:感 白粉病親本，P2 :抗白粉病親本 JIN5-508, 1:LL017,2:CJ223,3:EP56,4:SD41 ;5:R210， 6:EP112,7:GY114,8:JD65)。
[0021] 圖8是Chr6SNP-pm02在八個黃瓜品系中的瓊脂糖凝膠電泳多態(tài)性檢測（PI:感 白粉病親本，P2 :抗白粉病親本 JIN5-508, 1:LL017,2:CJ223,3:EP56,4:SD41 ;5:R210， 6:EP112,7:GY114,8:JD65)。
【具體實施方式】
[0022] 實施例一
[0023] -、遺傳分離群體的構(gòu)建與交換單株的鑒定
[0024] UF2群體的構(gòu)建
[0025] D8(母本），高感白粉病自交系；引自美國北卡羅來納大學(xué)，莖桿粗壯，節(jié)間長 到12-14節(jié)時頂端以一束雌花封頂而停止生長，葉片暗綠色，果實短，果肉厚，果皮暗綠 色JIN5-508 (父本），高抗白粉??；為蔓生品系，植株高大，節(jié)間長，系從國內(nèi)品種"津春5 號"（天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司）連續(xù)自交分離8代，在每一個子代中選擇高抗白粉 病的植株，自交至第8代性狀不再分離而獲得的高抗黃瓜白粉病、長果型自交系。本實施案 例利用這兩個親本配置了雜交組合F 1, F1自交產(chǎn)生F 2群體。在121株F 2群體中，鑒定白粉 病病情指數(shù)。病情指數(shù)的鑒定方法參照Qi等（2010)的實驗標準進行：
[0026] 如圖 1 :
[0027] 0級：整張葉片無粉斑；
[0028] 1級：有少數(shù)粉斑，但粉斑面積少于葉片面積的1/3 ;
[0029] 2級：粉斑增多占全葉面積的1/3-2/3 ;
[0030] 3級：粉斑逐漸連接成片，所占面積超過葉面積的2/3 ;
[0031] 4級：粉斑鋪滿整張葉片，碰觸葉片，白粉振落；
[0032] 5級：粉斑布滿整張葉片，葉片開始黃化，逐漸枯死。
[0033] 計算病情指數(shù)：
[0034] 公式為：DI =Σ (sini)/5NX100
[0035] DI =病情指數(shù)，si =發(fā)病級別，n