專利名稱：一種基于家蠶桿狀病毒多角體溶解特性的融合蛋白純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于家蠶桿狀病毒多角體溶解特性的融合蛋白的表達(dá)、純化方法，還涉及一種用于實(shí)施上述融合蛋白表達(dá)、純化方法的高效融合表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
在生命科學(xué)研究和生物制品的生產(chǎn)過(guò)程中，利用表達(dá)載體制備重組蛋白時(shí)最重要的技術(shù)之一，獲得大量有活性的重組蛋白是進(jìn)行生物制品研究和生產(chǎn)的必要條件。構(gòu)建有效的表達(dá)載體是表達(dá)目的基因的基本要求，同時(shí)也是影響基因表達(dá)水平及蛋白活性的重要因素?，F(xiàn)有的表達(dá)載體主要有非融合型表達(dá)載體和融合型表達(dá)載體兩大類(lèi)，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)選擇適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行表達(dá)。一般來(lái)說(shuō)，非融合型表達(dá)載體雖然能較好的保持外源蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但其表達(dá)量較低、外源蛋白分離純化困難，回收率低，分離純化工藝復(fù)雜，工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)的成本較高；融合型表達(dá)載體雖然表達(dá)量相對(duì)較高、可以通過(guò)分離 /純化標(biāo)簽等進(jìn)行分離純化，但由于融合了一段外源蛋白往往會(huì)影響所表達(dá)外源蛋白的活性，影響重組蛋白的功能。因此，表達(dá)效率高、易于純化、生物活性好的重組蛋白生產(chǎn)方法成為關(guān)鍵。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種快速簡(jiǎn)便的蛋白純化方法，將家蠶多角體基因(Polh) 與目的蛋白基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，并在二者之間引入一個(gè)蛋白酶酶切位點(diǎn)，使其在原核表達(dá)菌中融合表達(dá)；利用多角體蛋白在堿性條件下溶解而中性條件下沉淀的溶解度特性，通過(guò)不同PH值緩沖液對(duì)誘導(dǎo)菌體超聲后的沉淀進(jìn)行洗滌，將最后收集所得沉淀用高 PH的緩沖液溶解，離心后將收集的上清PH值調(diào)回到中性條件，離心收集沉淀即為分離純化得到的融合蛋白；特異性蛋白酶酶切純化后融合蛋白的多角體蛋白標(biāo)簽，再通過(guò)鎳柱分離純化得到目的蛋白，建立了原核表達(dá)的基于家蠶多角體蛋白溶解度特性的融合蛋白純化方法。
本發(fā)明具體技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供一種在原核表達(dá)載體中表達(dá)外源蛋白的方法，其特征在于將家蠶多角體基因(Polt1)與外源目的蛋白基因置于同一閱讀框中進(jìn)行融合表達(dá)，所述家蠶多角體基因與外源目的蛋白基因之間包括編碼蛋白酶酶切位點(diǎn)的linker。
本發(fā)明所述的表達(dá)外源蛋白的方法，其特征在于所述的家蠶多角體基因、編碼蛋白酶酶切位點(diǎn)的linker以及外源目的蛋白基因三者之間可操作性的連接。
本發(fā)明所述的表達(dá)外源蛋白的方法，其特征在于所述的家蠶多角體基因還帶有純化和/或鑒定標(biāo)簽。
本發(fā)明所述的表達(dá)外源蛋白的方法，其特征在于用針對(duì)linker編碼酶切位點(diǎn)的蛋白酶切割所表達(dá)的融合蛋白，能夠產(chǎn)生外源目的蛋白。
優(yōu)選地，上述的蛋白酶酶切位點(diǎn)為T(mén)EV蛋白酶酶切位點(diǎn)。
本發(fā)明還提供一種核酸構(gòu)建體，其包括一個(gè)與啟動(dòng)子可操作性連接、并由該啟動(dòng)子控制的閱讀框，所述的閱讀框包括家蠶多角體基因(Polh)、編碼蛋白酶酶切位點(diǎn)的 linker以及多克隆位點(diǎn)(用于插入外源目的蛋白基因)。
本發(fā)明所述的核酸構(gòu)建體，其特征在于所述外源蛋白基因通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)與所述核酸構(gòu)建體的其它部分可操作性地連接。
本發(fā)明所述的核酸構(gòu)建體，其特征在于所述的家蠶多角體基因還帶有純化和/或鑒定標(biāo)簽。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述的核酸構(gòu)建體的蛋白酶酶切位點(diǎn)為T(mén)EV蛋白酶酶切位點(diǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明所述的核酸構(gòu)建體的載體或細(xì)胞，以及利用本發(fā)明所述的核酸構(gòu)建體或載體、細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的方法。
本發(fā)明還提供一種所述方法表達(dá)的外源蛋白的純化方法，其特征在于將所表達(dá)的融合蛋白沉淀溶解于強(qiáng)堿性溶液中，離心收集上清，然后將PH值調(diào)至6. 0-8. 0的近中性，離心收集沉淀即為純化后的融合蛋白，所述的強(qiáng)堿性溶液PH值為11-14。
本發(fā)明所述的外源蛋白的純化方法，其特征在于將所表達(dá)的融合蛋白沉淀溶解于強(qiáng)堿性溶液之前，先用弱堿性溶液洗滌沉淀1-3次，所述弱堿性溶液的pH值為8. 0-10. 0。
本發(fā)明所述的外源蛋白的純化方法，其特征在于將純化后的融合蛋白用針對(duì) linker編碼酶切位點(diǎn)的蛋白酶進(jìn)行切割，分離純化所述外源目的蛋白。
本發(fā)明所述的外源蛋白的純化方法，其特征在于還包括將融合蛋白用所述蛋白酶切割后，對(duì)蛋白酶切割產(chǎn)物進(jìn)行鑒定的步驟。
本發(fā)明所述的外源蛋白純化方法，其特征在于通過(guò)相應(yīng)于所述家蠶多角體基因上純化鑒定標(biāo)簽的純化方法分離所述外源蛋白和家蠶多角體蛋白。
有益的技術(shù)效果
與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明所述方法耗時(shí)短，表達(dá)量高，易于純化，所用儀器少且簡(jiǎn)單，更有利于大規(guī)模生產(chǎn)；同時(shí)本發(fā)明所述方法表達(dá)、純化的目的蛋白可通過(guò)酶切除去融合的蛋白，從而更有利于保持目的蛋白的活性。


從下面給出的說(shuō)明結(jié)合附圖，本發(fā)明的上面和其它目的的和特征將變得明了。其中
圖1顯示了重組質(zhì)粒pET-28a_PoIh-EGFP的構(gòu)建策略。
圖2顯示了融合蛋白Polh-EGFP在E. coli BL21中的表達(dá)情況。M.低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)后空載體；2.未誘導(dǎo)重組菌；3.誘導(dǎo)池后重組菌；4.誘導(dǎo)證后重組菌； 5.超聲波裂解后的上清；6.超聲波裂解后的沉淀；箭頭所示為融合蛋白。
圖3顯示了通過(guò)緩沖液pH值變化與離心的方法純化融合蛋白的結(jié)果圖。M.低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)后重組菌；2.超聲波破碎后沉淀；3. pH 7.5PBS洗滌一次后樣品； 4. pH 9. 0 PBS洗滌2次后樣品；5. pH 10. 0 PBS洗滌2次后樣品；6. pH 11. 5PBS溶解沉淀離心后上清樣品；7.將上清pH調(diào)到7. 5離心后沉淀樣品；箭頭所示為融合蛋白。
圖4顯示了融合蛋白Polh-EGFP經(jīng)TEV酶酶切后結(jié)果圖。M.低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1.酶切前純化的融合蛋白Polh-EGFP ；2.酶切30min后結(jié)果；3.酶切Ih后結(jié)果；4.酶切Ih后離心得到的沉淀；5.酶切Ih后離心得到的上清。
圖5顯示了以多角體蛋白多克隆抗體做一抗，Western blot分析酶切后蛋白的鑒定圖。M.低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3為SDS-PAGE分析；1’、2’、3’為以EGFP小鼠單抗為一抗的^festern blot分析；1 ”、2”、3”為以Polh小鼠多克隆抗體為一抗的^festern blot分析；1、1，、1”.酶切前樣品；2、2，、2”、3、3，、3”.酶切后樣品。
圖6顯示了 TEV酶酶切后EGFP的純化結(jié)果圖。M.低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1.酶切前純化的融合蛋白Polh-EGFP ;2.酶切30min后結(jié)果；3.酶切后結(jié)合在鎳柱上洗脫下來(lái)的蛋白樣品；4.酶切后未螯合在鎳柱上的流出液。
圖7顯示了以His-Tag小鼠單克隆抗體做一抗，Western blot分析發(fā)病細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)蛋白。(A). SDS-PAGE ； (B). Western blot分析；Μ.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1、1’ .正常細(xì)胞對(duì)照；2、2’ .接種重組病毒vBmBmBI-Ι的發(fā)病細(xì)胞；3、3’接種重組病毒vBmPolh-BI-1 的發(fā)病細(xì)胞。
圖8顯示W(wǎng)estern blot分析蠶蛹表達(dá)目標(biāo)蛋白(A). SDS-PAGE ； (B). Wfesternblot分析；M.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；Al、Bi.細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)照；A2、B2.接種重組病毒 vBm-Polh-BmBI-1的發(fā)病細(xì)胞；A3、A4、A5、A6、B3、B4、B5、B6、4只不同發(fā)病幼蟲(chóng)的血淋巴； A7、B7.發(fā)病幼蟲(chóng)；A8、B8.發(fā)病蠶蛹；箭頭所示為多角體蛋白一抗雜交出的融合蛋白條帶。
具體實(shí)施方式
為了構(gòu)建含Polh基因的重組質(zhì)粒，合成了擴(kuò)增Polh基因ORF序列的PCR引物，并且利用從感染野生BmNPV的發(fā)病細(xì)胞中提取的病毒基因組做模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到Polh 基因序列；PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體都用核酸酶切酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，將酶切回收的產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化E. coli TGl感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組質(zhì)粒并鑒定。
為了構(gòu)建含與Polh融合的目的基因重組質(zhì)粒，合成擴(kuò)增目的基因ORF序列的PCR 引物擴(kuò)增得到目的基因序列；PCR產(chǎn)物與Polh基因的重組質(zhì)粒都用核酸酶切酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，將酶切回收的產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化E. coli TGl感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組質(zhì)粒并鑒定，將鑒定成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌進(jìn)行原核表達(dá)。
為了純化得到融合蛋白，首先收集誘導(dǎo)后重組表達(dá)菌進(jìn)行超聲破碎，收集超聲后的沉淀，用不同PH的緩沖溶液重懸洗滌，將最后收集所得沉淀用高PH的PBS重懸，在4°C下攪拌。ISOOOrpm離心，收集上清；將上清的pH值調(diào)回到偏中性的條件，離心收集沉淀，沉淀便是分離純化得到的融合蛋白。
為了純化目的基因，先根據(jù)TEV酶說(shuō)明書(shū)將融合蛋白酶切，酶切后離心收集上清和沉淀并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；用M-NTA親合層析柱分離酶切后各蛋白，收集流出液與洗脫液；監(jiān)測(cè)OD28tl ；將流出液和洗脫的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
具體實(shí)施例1
1.克隆實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
本發(fā)明以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為例，在pET_28a載體的BamH I和EcoR I 酶切位點(diǎn)之間插入Polh基因；在設(shè)計(jì)EGFP上游引物時(shí)在起始密碼子ATG前加入TEV酶序列，在連有Polh基因的pET-28a載體的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)間插入TEV-EGFP序列， 得到重組質(zhì)粒pET-28a-PoIh-EGFP。
2. pET-28a-PoIh-EGFP 的載體構(gòu)建
根據(jù)家蠶Polh基因的ORF序列設(shè)計(jì)上游引物Pl和下游引物P2，分別包含BamH I 酶切位點(diǎn)、EcoR I酶切位點(diǎn)。具體序列如下
P1 5，-GCG |GGATCC[ ATGCCGAATTATTCATAC-3，
(方框內(nèi)為BamH I酶切位點(diǎn))
P2 5 ’ -GC |GAATTC丨 ATACGCCGGACCAGTGAAC-3 ’
(方框內(nèi)為EcoRI酶切位點(diǎn))
以野生家蠶桿狀病毒基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度設(shè)置在59°C .具體程序如下94°C預(yù)變性5 min;94°C變性45 s，59°C退火45 s，72°C延伸45 s，循環(huán)30次；最后72°C延伸10 min ；PCR產(chǎn)物和載體pET_28a都用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，將酶切回收的產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化E. coli TGl感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切進(jìn)行鑒定，挑選重組質(zhì)粒pET-28a-Polh.
本發(fā)明已增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為例，根據(jù)EGFP的ORF序列信息設(shè)計(jì)引物
P3 5' -TAT 丨GAATTC! GAAAACCTGTATTTTCAGGGCGTGAGCAAGGGCGAGGA-3，(方框內(nèi)為EcoR I酶切位點(diǎn)，下劃線為T(mén)EV酶切位點(diǎn)序列)P4 :5’ -GCG |CTCGAG| TTACTTGTACAGCTCGTC-3，(方框內(nèi)為 Xho I 酶切位點(diǎn))
以pEGFP-Cl質(zhì)粒為模板，用所設(shè)計(jì)的引物P3和P4擴(kuò)增特異性片段，具體程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s，55 °C退火30s，72 °C延伸45s，循環(huán)30次；最后72°C延伸 IOmin0 PCR產(chǎn)物和載體pETj8a-Polh都用EcoR I和Β ο I進(jìn)行雙酶切，將酶切回收的產(chǎn)物用T4DNA連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化E. coli TGl感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用PCR和雙酶切進(jìn)行鑒定，挑選重組質(zhì)粒pET-28a-PoIh-EGFP，將重組好的質(zhì)粒交由北京英駿有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果顯示克隆得到的序列預(yù)期的相同，說(shuō)明重組成功。
3.重組蛋白Polh-EGFP的表達(dá)與純化
將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pETj8a-Polh-EGFP轉(zhuǎn)化E. coli BL21Mar感受態(tài)細(xì)胞， 在含50mg/mL卡那青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)至0D_ ^ 0. 5，加終濃度為 lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，收集菌體經(jīng)洗滌后加PBS超聲破碎，收集超聲后的沉淀，pH 8. 0、pH 9. 0、ρΗ 10. O的PBS先后重懸，4°C攪拌30min,洗滌結(jié)束后6000rpm離心IOmin,收集沉淀，重復(fù)3次；將收集所得沉淀用pH 11.5的PBS重懸，在4°C下攪拌30min，ISOOOrpm 離心15min，收集上清；將上清的pH值調(diào)回到8. 0,6000rpm離心收集沉淀。每次離心得到的沉淀都用相同體積緩沖液重懸，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)各步驟樣品的蛋白濃度，計(jì)算融合蛋白純化的得率。由附圖3所示，重組菌超聲后的沉淀在經(jīng)過(guò)不同pH的PBS洗滌， 雜蛋白逐步減少，最后得到一條比較明顯的條帶，誘導(dǎo)菌液洗滌后蛋白濃度5. OlmgBSA/mL, 最終PH調(diào)到8. O離心得到的沉淀重懸后測(cè)得蛋白濃度為1. 35mgBSA/mL，最終算得融合蛋白的得率為79. 3%。
4. TEV酶酶切結(jié)果及鑒定
將純化后的融合蛋白重懸到(MH2O中，用hvitrogen公司的TEV酶進(jìn)行酶切，酶切體系為
融合蛋白0.2 mL20xTEV Buffer75 μ 15 μL 10 μL 1.2mL0.1 MDTTAcTEV ProteaseddH20Total1.5 mL
混勻，30°C反應(yīng)lh。
圖4所示酶切后出現(xiàn)明顯的3條條帶，60kD大小的條帶與融合蛋白Polh-EGFP的大小一致，33kD大小的條帶與融合His-Tag的Polh大小一致，27kD大小的條帶則與EGFP 的大小一致。
分別以EGFP小鼠單抗和Polh多克隆抗體做為一抗對(duì)純化的融合蛋白和酶切后的蛋白做Wfestern blot分析，如圖5所示EGFP抗體能雜交到60kD左右和27kD左右的特異性條帶，而Polh抗體能雜交到60kD左右和33kD左右的特異性條帶。Western blot結(jié)果可以充分說(shuō)明60kD的條帶為未酶切的融合蛋白，33kD條帶的為融合HIS-Tag的PoIh，而26. 9kD 的條帶為EGFP。
5. TEV酶酶切后EGFP的純化
酶切后離心收集上清和沉淀并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；沉淀加溶解液(6M尿素、0.5M NaCl、20mM Tris (pH 7. 4))在 4°C攪拌 30min，溶解后用 0. 45 μ m 濾膜過(guò)濾；過(guò)濾后的溶液與經(jīng)過(guò) Binding buffer (20mM imidazole、6M 尿素、0· 5M NaCl、20mM Tris (pH 7. 4))平衡的Ni-NTA親合層析柱填料混勻，于0°C結(jié)合30min，收集流出液；最后用Elution buffer (500mM imidazole、6M 尿素、0· 5M NaCl、20mM Tris (pH 7· 4))洗脫結(jié)合的蛋白，監(jiān)測(cè)0擬80 ；將流出液和洗脫的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。如圖6所示90. 3kD的蛋白和 47kD的蛋白帶有His-Tag可以與鎳柱結(jié)合，因此高濃度咪唑洗脫能洗脫出這兩種蛋白，而 43. 3kD的蛋白未能結(jié)合，能在流出液中檢測(cè)到，因此我們可以利用這種方法將43. 3kD的蛋白分離出來(lái)。
具體實(shí)施例2
1.克隆實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
本發(fā)明以抗凋亡因子-I(BI-I)為例，在pFastBac HTb載體的BamH I和EcoR I 酶切位點(diǎn)之間插入Polh基因；在設(shè)計(jì)BI-I上游引物時(shí)在起始密碼子ATG前加入TEV酶序列，在連有Polh基因的pFastBac HTb載體的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)間插入TEV-BI-I 序列，得到重組質(zhì)粒pFastBac HTb-Polh-BI-I0
2. pFastBac HTb-Polh-BI-l 的載體構(gòu)建
根據(jù)家蠶Polh基因的ORF序列設(shè)計(jì)上游引物Pl和下游引物P2，分別包含BamH I 酶切位點(diǎn)、EcoR I酶切位點(diǎn)。具體序列如下
P1 5，-GCG |GGATCC[ ATGCCGAATTATTCATAC-3，
(方框內(nèi)為BamHI酶切位點(diǎn))
P2 5 ’ -GC ^}AATTC[ ATACGCCGGACCAGTGAAC-3 ’
(方框內(nèi)為EcoRI酶切位點(diǎn))
以野生家蠶桿狀病毒基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度設(shè)置在59°C .具體程序如下94°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s，59°C退火45s，72°C延伸45s，循環(huán)30次；最后 72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物和載體pET_28a都用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，將酶切回收的產(chǎn)物用T4DNA連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化E. coli TGl感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切進(jìn)行鑒定，挑選重組質(zhì)粒pFastBac HTb-Polh.
本發(fā)明以抗凋亡因子-I(BI-I)為例，根據(jù)BI-I的ORF序列信息設(shè)計(jì)引物P3 5 ’ -GCGCGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCATGAATACAATAAAT-3’
(方框內(nèi)為EcoRI酶切位點(diǎn)，下劃線為T(mén)EV酶切位點(diǎn)序列)
P4 :5’ -GAGACTCGAGTTAATCACGCTTGCG-3’
(方框內(nèi)為Β ο I酶切位點(diǎn))
以蠶蛹cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)的引物P3和P4擴(kuò)增特異性片段，具體程序?yàn)?5°C 預(yù)變性5min ；95°C變性45s，57°C退火30s, 72°C延伸45s，循環(huán)30次；最后72°C延伸IOmin。 PCR產(chǎn)物和載體pFastBac HTb-Polh都用EcoR I和Β ο I進(jìn)行雙酶切，將酶切回收的產(chǎn)物用T4DNA連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化E. coli TGl感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用PCR和雙酶切進(jìn)行鑒定，挑選重組質(zhì)粒pFastBac HTb-Polh-BI-I，將重組好的質(zhì)粒交由北京英駿有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果顯示克隆得到的序列預(yù)期的相同，說(shuō)明重組成功。
3.重組Bacmid的鑒定
將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pFastBac HTb-Polh-BI-I轉(zhuǎn)化E. coli BmDHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，在含50 μ g/mL卡那青霉素、7 μ g/mL慶大霉素、10 μ g/mL四環(huán)素、40 μ g/mL IPTG、 200 μ g/mL x-gal的LB固體培養(yǎng)基中37°C，培養(yǎng)48h，挑取白色單菌落搖菌培養(yǎng)后提取重組 Bacmid，通過(guò)pUC/M13擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR鑒定。
4. Polh-BI-I融合蛋白的表達(dá)
轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞鋪到細(xì)胞培養(yǎng)碟上，在0. 5mL含血清不含抗生素的正常生長(zhǎng)的Sf-900 SFM(IX)無(wú)血清培養(yǎng)基中27°C培養(yǎng)過(guò)夜，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為90% ；對(duì)于每碟細(xì)胞，使用IOOyL Sf-900 SFM (1 X)無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基稀釋0. 8 1. O μ g重組Bacmid， 使用100 μ L Sf-900 SFM(IX)無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋8 μ L脂質(zhì)體2000試劑，在5min內(nèi)同稀釋的重組Bacmid混合，在室溫保溫20min ；移去細(xì)胞培養(yǎng)碟中含血清的正常培養(yǎng)基，加入 0. 5mL無(wú)血清培養(yǎng)基(不用將細(xì)胞吹起)，直接將復(fù)合物加入到每碟中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)碟混勻，在室溫下放置4- ；移去含脂質(zhì)體2000的無(wú)血清培養(yǎng)基，每碟加入ImL含血清的正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在27°C，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72h ；待細(xì)胞發(fā)病后，漂浮著發(fā)病細(xì)胞的培養(yǎng)基在4°C下IOOOrpm離心lOmin，取含有重組病毒的上清。按照OMEGA bio-tek公司的Viral DNA Kit說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組。以提取的病毒基因組為模板，以M13F和M13R、M13F和目的基因上游、目的基因下游和M13R為引物進(jìn)行PCR鑒定；取ImL發(fā)病細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞沉淀。將沉淀用PH 7. 4的PBS洗滌重懸，樣品分別與2 X SDS上樣緩沖液混合，煮沸l(wèi)Omin， 進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析；由于利用pFastBac HTb作為轉(zhuǎn)移載體，因此表達(dá)的目標(biāo)蛋8白將融合6 XHis Tag，我們用His-Tag小鼠單克隆抗體做一抗進(jìn)行Wfestern blot分析；取當(dāng)年春蠶繭，用刀片削去蠶繭后，用10 μ L重組病毒VBmPolh-BmBI-I貯存液于蛹背側(cè)腹間節(jié)穿刺接種。接種后的家蠶蛹于^_28°C、通風(fēng)透光場(chǎng)所放置，接種4 后，5d后隨機(jī)取50 頭蠶蛹，于勻漿器中勻漿，產(chǎn)生的勻漿液以16000rpm于4°C高速離心30min，用一次性醫(yī)用注射器吸取脂質(zhì)層下的上清液，分裝，上清置于-20°C保存?zhèn)溆茫瑫r(shí)以野生桿狀病毒接種家蠶蛹作為陰性對(duì)照；用Polh多克隆抗體為一抗，用Westernblot檢測(cè)發(fā)病家蠶及蠶蛹中 Polh-BmBI-I 的表達(dá)。
用His標(biāo)簽的單克隆抗體做Western blot分析，結(jié)果可知(圖7)作為陰性對(duì)照的正常細(xì)胞和接種重組病毒vBmBmBI-Ι的發(fā)病細(xì)胞并沒(méi)有雜交出明顯的條帶，而接種重組病毒病毒VBmPolh-BmBI-I的發(fā)病細(xì)胞在59kD左右雜交出一條很明顯的條帶，多角體蛋白 (29kD), BmBI-I (26. 4kD)及6XHis Tag(3. 6kD)三者表達(dá)的融合蛋白分子量約為59kD，與預(yù)計(jì)的分子量相同。以上結(jié)果可以看出融合Polh基因的BmBI-I基因在家蠶細(xì)胞中成功得到表達(dá)。
重組病毒VBmPolh-BmBI-I感染家蠶五齢幼蟲(chóng)5d后出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀。提取家蠶全蛋白、4只不同家蠶血淋巴以及蠶蛹總蛋白以Polh多克隆抗體做SDS-PAGE和Wfestern blot分析，如圖8(B)可知發(fā)病細(xì)胞、五齡幼蟲(chóng)及蠶蛹中都能檢測(cè)一條約59kD的明顯條帶， 其大小與Polh-BmBI-I融合蛋白分子量大小相同，細(xì)胞培養(yǎng)基空白對(duì)照中沒(méi)有這條帶，表明融合Polh基因的BmBI-I基因在家蠶中成功得到表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種在原核表達(dá)載體中表達(dá)外源蛋白的方法，其特征在于將家蠶多角體基因 (Polh)與外源目的蛋白基因置于同一閱讀框中進(jìn)行融合表達(dá)，所述家蠶多角體基因與外源目的蛋白基因之間包括編碼蛋白酶酶切位點(diǎn)的linker ；所述的家蠶多角體基因、編碼蛋白酶酶切位點(diǎn)的linker以及外源目的蛋白基因三者之間可操作性的連接；所述的家蠶多角體基因還帶有純化和/或鑒定標(biāo)簽；用針對(duì)linker編碼酶切位點(diǎn)的蛋白酶切割所表達(dá)的融合蛋白，能夠產(chǎn)生外源目的蛋白。
2.—種核酸構(gòu)建體，其包括一個(gè)與啟動(dòng)子可操作性連接、并由該啟動(dòng)子控制的閱讀框， 所述的閱讀框包括家蠶多角體基因(Polh)、編碼蛋白酶酶切位點(diǎn)的linker以及外源目的蛋白基因；所述外源蛋白基因通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)與所述核酸構(gòu)建體的其它部分可操作性地連接；所述的家蠶多角體基因還帶有純化和/或鑒定標(biāo)簽。
3.利用權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體構(gòu)建的原核或真核表達(dá)載體。
4.利用權(quán)利要求3所述的載體建立的細(xì)胞。
5.利用權(quán)利要求3所述的載體或權(quán)利要求4所述的細(xì)胞表達(dá)外源目的蛋白的方法。
6.一種如權(quán)利要求1_2，4或5之一所述方法表達(dá)的外源蛋白的純化方法，其特征在于 將所表達(dá)的融合蛋白沉淀溶解于強(qiáng)堿性溶液中，離心收集上清，然后將PH值調(diào)至6. 0-8. O 的近中性，離心收集沉淀即為純化后的融合蛋白，所述的強(qiáng)堿性溶液PH值為11-14。
7.如權(quán)利要求5所述的外源蛋白的純化方法，其特征在于將所表達(dá)的融合蛋白沉淀溶解于強(qiáng)堿性溶液之前，先用弱堿性溶液洗滌沉淀1-3次，所述弱堿性溶液的pH值為 8. 0-10. O。
8.如權(quán)利要求5或6所述的外源蛋白的純化方法，其特征在于將純化后的融合蛋白用針對(duì)linker編碼酶切位點(diǎn)的蛋白酶進(jìn)行切割，分離純化所述外源目的蛋白。
9.如權(quán)利要求7或8所述的外源蛋白純化方法，其特征在于通過(guò)相應(yīng)于所述家蠶多角體基因上純化和/或鑒定標(biāo)簽的純化方法分離純化所述外源蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于家蠶桿狀病毒多角體溶解特性的融合蛋白的表達(dá)、純化方法和用于實(shí)施上述融合蛋白表達(dá)、純化方法的高效融合表達(dá)載體。本發(fā)明將家蠶多角體基因(Polh)與目的蛋白基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，并在二者之間引入一個(gè)蛋白酶酶切位點(diǎn)，使其在原核表達(dá)菌中融合表達(dá)；利用多角體蛋白在堿性條件下溶解而中性條件下沉淀的溶解度特性，通過(guò)不同pH值緩沖液對(duì)誘導(dǎo)菌體超聲后的沉淀進(jìn)行洗滌，將最后收集所得沉淀用高pH的緩沖液溶解，離心后將收集的上清pH值調(diào)回到中性條件，離心收集沉淀即為分離純化得到的融合蛋白；特異性蛋白酶酶切純化后融合蛋白的多角體蛋白標(biāo)簽，再通過(guò)鎳柱分離純化得到目的蛋白，建立了原核表達(dá)的基于家蠶多角體蛋白溶解度特性的融合蛋白純化方法。
文檔編號(hào)C12N15/79GK102517319SQ201110443268
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者張耀洲, 白舒婉, 舒特俊, 陳劍清, 陳昊 申請(qǐng)人:天津耀宇生物技術(shù)有限公司