專利名稱：基于實(shí)時(shí)熒光pcr的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種染色體非整倍體的定量檢測(cè)試劑盒，尤其是涉及一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
染色體(chromosome)是遺傳物質(zhì)的載體，真核細(xì)胞的基因(gene)大部分存在于染色體上，并隨著染色體的傳遞而傳遞。染色體的數(shù)目與形態(tài)結(jié)構(gòu)具有物種特異性，即在同一物種中，染色體的數(shù)目與形態(tài)結(jié)構(gòu)是恒定的，如此得以維持該物種的特征。染色體如果發(fā)生了異常，將會(huì)導(dǎo)致許多基因的劑量變化如增加或減少，進(jìn)而導(dǎo)致出現(xiàn)多種畸形的綜合征， 稱之為染色體綜合征。
染色體異常包括結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常，數(shù)目異常又分為整倍體改變和非整倍體改變。染色體結(jié)構(gòu)變異所造成的表型改變往往較輕且不固定。整倍體改變往往是高度致死的， 患病胎兒無法存活至出生。而非整體在新生兒中出現(xiàn)的比例高，造成的病征嚴(yán)重，且目前尚沒有有效的治療手段。
一個(gè)體細(xì)胞的染色體數(shù)目增加或減少了一條或數(shù)條，稱之為染色體非整倍體 (chromosomal aneuploidy)，這是臨床上最常見的人類染色體畸變類型。迄今為止，在人類 22條常染色體中只發(fā)現(xiàn)21三體，18三體和13三體這三種類型的非整倍體活產(chǎn)兒，而其他常染色體非整倍體胎兒均在妊娠早期自發(fā)性流產(chǎn)。對(duì)于非整倍體胎兒目前最為有效的控制方法只能是通過產(chǎn)前診斷確診后采取中止妊娠的方法預(yù)防患病胎兒的出生。因此染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷一直是醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)。
目前，染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷以細(xì)胞生物學(xué)方法為主要手段，分子細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)方法互為有效補(bǔ)充。
細(xì)胞生物學(xué)方法主要指染色體組型分析(karyotyping)，也稱核型分析。目的是對(duì)待測(cè)細(xì)胞的全部染色體按大小、形態(tài)特征等排列后形成的核型(karyotype)進(jìn)行數(shù)目與形態(tài)的分析，以確定是否與正常核型完全一致。染色體組型分析不僅可以診斷整條染色體的丟失和增加，還可以檢測(cè)缺失、重復(fù)、易位、重組等染色體結(jié)構(gòu)異常，并且具有直觀的形態(tài)結(jié)果和很高的可信度，因此三十多年來，此項(xiàng)技術(shù)沒有太大的改變卻仍然是國(guó)內(nèi)外染色體異常的產(chǎn)前診斷金標(biāo)準(zhǔn)，并有許多相應(yīng)的試劑盒面世。雖然如此，這項(xiàng)技術(shù)卻有明顯的不足之處。首先，從樣品采集至結(jié)果輸出，整個(gè)診斷過程需要大約兩周時(shí)間，容易給受檢對(duì)象造成較大的心理負(fù)擔(dān)；其次，雖然有商品化的試劑盒與相關(guān)軟件的幫助，這項(xiàng)技術(shù)仍需要較為專業(yè)的從業(yè)人員進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、結(jié)果判斷等工作；第三，存在細(xì)胞培養(yǎng)失敗、母源細(xì)胞污染等較多不確定因素。這些不足之處決定了染色體組型分析是一個(gè)耗時(shí)、高成本、低通量的診斷技術(shù)。
上世紀(jì)末，分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)結(jié)合形成了許多分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。這些分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)作為傳統(tǒng)染色體組型分析的有效補(bǔ)充，主要具有快速、低成本、高通量等特點(diǎn)。但是由于許多方法面世的時(shí)間并不長(zhǎng)，因此仍然需要更大量的臨床評(píng)價(jià)和進(jìn)一步的完善。熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization, FISH)(Nederlof PM, van der Flier S, Wiegant J, et al. Cytometry, 1990,11 :126-31)和比較基因組雜交技術(shù)(Comparative genome hybridization, CGH) (Barrett IJ, Lomax BL, Loukianova T，et al. Arch Pathol Lab Med,2001,125 :81-4) 1 是分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的典型。它們的原理都是利用熒光標(biāo)記的DNA探針與處于中期或間期的羊水細(xì)胞內(nèi)染色體DNA雜交，然后通過熒光顯微鏡等儀器觀察熒光的分布和數(shù)量來判斷染色體異常的情況。這兩項(xiàng)分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于確定未知區(qū)域的染色體重復(fù)和缺失、染色體不平衡片段的識(shí)別以及染色體重排的發(fā)現(xiàn)等染色體結(jié)構(gòu)異常的研究中。然而相對(duì)于發(fā)生異常頻率最高的整條染色體數(shù)目發(fā)生變化的非整倍體檢測(cè)來說，采用這兩項(xiàng)技術(shù)的綜合成本較高，給患者造成了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)， 也影響了自身在臨床上的廣泛應(yīng)用。
PCR技術(shù)的出現(xiàn)使分子生物學(xué)邁入一個(gè)新的時(shí)代。基于PCR技術(shù)的診斷方法也以其操作簡(jiǎn)便、低成本、高通量、易自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)弓I起人們的廣泛興趣。最早應(yīng)用于染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷的這類方法是定量PCR(Quantitative PCR) (Von Eggeling F，F(xiàn)reytag Μ, Fahsold R, et al. Hum Genet，1993，91 :567-70)，這項(xiàng)技術(shù)的原理是選取特定染色體上的短串聯(lián)重復(fù)序列(Small-tandem-r印eat，STR)的兩端序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)STR序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析。該方法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性高，無需細(xì)胞培養(yǎng)，診斷可在一天內(nèi)完成。它的不足之處在于有的同源染色體可能含有相同長(zhǎng)度的STR序列，因此一個(gè)STR序列對(duì)于精確診斷就有所不足，通常會(huì)同時(shí)對(duì)一個(gè)染色體上的4個(gè)或以上STR序列進(jìn)行分析。這就增加了擴(kuò)增反應(yīng)的重?cái)?shù)，增加了擴(kuò)增的難度。 同時(shí)，不同人種的STR序列也有差別，適合于某一人種的STR診斷組合并不一定適合另一人種，因此需要重新設(shè)計(jì)擴(kuò)增位點(diǎn)，增加了實(shí)驗(yàn)難度。
近幾年來，一種新的多重探針連接再擴(kuò)增技術(shù)(Multiplex ligation-d印endent probe amplification, MLPA) (Schouten JP, McElgunn CJ, Waaij er R, et al. Nucleic Acids Res, 2002, 30 :e57)以其耗時(shí)短和較高的準(zhǔn)確性贏得了診斷界的青睞，與QF-PCR — 樣獲得了廣泛的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)一些醫(yī)院在近幾年也弓I入了該技術(shù)用于傳統(tǒng)染色體組型分析方法的輔助分析。該方法的創(chuàng)新之處在于采用雜交連接的方法將不同染色體間數(shù)目的比例轉(zhuǎn)化為不同雜交探針數(shù)目的比例，并使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，消除了因?yàn)椴煌飻U(kuò)增效率不同而引起的誤差，大大增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。并且通過stuffer序列和核酸測(cè)序儀的使用，大大提高了分析的通量，從而可以在一條染色體上分析多個(gè)位點(diǎn)，也增加了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但是，由于雜交探針的長(zhǎng)度較長(zhǎng)，超過了化學(xué)合成的范圍，只能通過M13噬菌體克隆獲得，增加了技術(shù)難度和成本。同時(shí)PCR產(chǎn)物的后處理使得PCR產(chǎn)物造成的交叉污染難以避免。測(cè)序儀器分析同樣增加了儀器、試劑的成本和工作量。以上因素限制了這項(xiàng)技術(shù)臨床的普及。
實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(Real-time PCR)使PCR技術(shù)擺脫了瓊脂糖與毛細(xì)管電泳的束縛，邁上一個(gè)新的階梯。它的基本原理是通過熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針或嵌入式熒光染料結(jié)合相關(guān)儀器實(shí)時(shí)獲得PCR擴(kuò)增反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線，通過Ct值(產(chǎn)物熒光值到達(dá)設(shè)定閾值所需的反應(yīng)循環(huán)數(shù))即可獲得初始模板的相對(duì)或絕對(duì)數(shù)量信息。無需電泳等PCR產(chǎn)物后處理步驟，且由于擴(kuò)增初始誤差未被放大，因此比終產(chǎn)物定量的方法更加準(zhǔn)確。實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)(Zimmermann B, Holzgreve W, Wenzel F, et al.Clin Chem, 2002 ；48 :362-3)就是這樣一種用于染色體非整倍體檢測(cè)的技術(shù)。它的原理是設(shè)計(jì)兩對(duì)引物和標(biāo)記不同熒光基團(tuán)的探針分別針對(duì)待檢測(cè)的染色體上的序列和對(duì)照染色體上的序列(通常為看家基因序列，發(fā)生數(shù)目異常的概率極小)。通過對(duì)擴(kuò)增后兩個(gè)探針指示的Ct值進(jìn)行比較從而判斷染色體數(shù)目異常情況。此方法簡(jiǎn)單、快速，但也存在一些缺點(diǎn)。由于不同引物擴(kuò)增效率不可能完全相同并且會(huì)相互影響，因此表現(xiàn)在Ct值上的誤差較大。以三體為例，異常染色體的數(shù)目?jī)H為正常染色體數(shù)目的1. 5倍，理論上Ct值僅相差0. 6， 這樣小的差別對(duì)于誤差極為敏感。同時(shí)，因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)范圍的影響，同一反應(yīng)中共存的熒光基團(tuán)的種類有限，使得該方法一般只能針對(duì)染色體上的單一序列。而拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)是近年來發(fā)現(xiàn)的人類基因組中普遍存在的現(xiàn)象，它指的是基因組DNA中大于11Λ的片段缺失或重復(fù)現(xiàn)象，保守估計(jì)至少10%的人類基因組序列存在這樣的現(xiàn)象。這樣就可能存在這樣的情況某個(gè)正常胎兒的相關(guān)染色體檢測(cè)區(qū)域恰好多一拷貝重復(fù)或某個(gè)患病胎兒多余的染色體恰好缺失這么一個(gè)檢測(cè)區(qū)域，這樣就造成了錯(cuò)誤的診斷結(jié)果。綜上所述原因，此方法快速廉價(jià)，但準(zhǔn)確性不高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的診斷結(jié)果。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、靈敏、特異，用于臨床染色體非整倍體疾病檢測(cè)的基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用多重雜交探針與對(duì)應(yīng)待檢染色體上的DNA序列雜交，再經(jīng)連接酶連接后，對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。并且通過檢測(cè)探針和實(shí)時(shí)熒光PCR儀指示對(duì)應(yīng)染色體的相對(duì)數(shù)量變化情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)非整倍體的檢測(cè)。
本發(fā)明設(shè)有盒體、雜交連接試劑、擴(kuò)增試劑和參照試劑；所述雜交連接試劑、擴(kuò)增試劑和參照試劑設(shè)在盒體內(nèi)；
所述雜交連接試劑包括LDR混合液、CA連接緩沖液和CA連接酶；所述LDR混合液即96條雜交探針混合液，每條雜交探針5fmol ；所述CA連接緩沖液即商品化的1 X Taq DNA 連接酶緩沖液；所述CA連接酶即IU Taq DNA連接酶。
所述96條雜交探針序列為
Hyb-I5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggcgaaacaaaggca acgcgtctttccac-3‘
Hyb-2 :5‘ -agccaggcagtctgtatcttgcaaaaacatccactctgcctctagattggatcttgctg gcac-3‘
Hyb-3 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggccttgctgcattt acagggtattc attaag-3‘
Hyb-4 :5‘ -tgaaattgtgccttgcctgagtgagcttcataaagcgtacacttctagattggatcttg ctggcac-3‘
Hyb-5 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggctggaaggcctcc taagaggactcaaa-3‘
Hyb-6 :5‘ -gtgtcacctccccagagaactctcacatcatgccgcattctgtccctctagattggatc ttgctggcac-3‘
Hyb-7 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccggggattctaccagaa aggaatgaagaacagaac-3‘
Hyb-8 5 ‘ -cttcaggaattgagtcacaatgcagacaaatatctagattggatcttgctggca c-3'
Hyb-9 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccggggctagacgagtgc tacgagcgct-3‘
Hyb-IO 5' -tcagtcgcgagacagacggggcgcagaagcggcggatgtattctagattggatcttgctggcac-3‘
Hyb-Il 5 ccctggttgtgtgg-3
Hyb-12 5 tgctggcac-3‘
Hyb-13 -gtggacactgtg-3'
Hyb-14 5gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggcttgaatgcctg actccttaatgccaatcatttcttcacttctctgggacacccagtctagattggatct gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggctcaggaccttg -tacacctctggattcattgtctctcacagattctagattggatcttgctggca gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggggctctggacca aaagcagaagagaggtgtcaggaactgtttgatgcacatctagattggatcttgctggc-3'
Hyb-15 :5‘-tccgggcatac-3‘
Hyb-16 -cac-3‘
Hyb-17 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagtaatgatgcct gtctgagcattgtgcata-3‘
Hyb-18 5' -gtttgatgtgccatagacaaggtggagagagtgaaacatttgccatgtctagattgga tcttgctggcac-3‘
Hyb-19 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagtgatgacattc tgcccaagtaacccctac-3‘
Hyb-20 :5‘ -tgcgcctgctacatgtctctcttccaggtgaacggcatgtcatgtctagattggatct tgctggcac-3‘
Hyb-21 5' ccagccccgtt-3‘
Hyb-22 5'"gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagtcagaggataa -cacgtcagtttctacgtctgcaacgggaagagaaagcgaagtctagattggatcttgctggcac-3‘
Hyb-23 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagcgagtgtgcta ctcaactcagga gattt-3‘
Hyb-24 5' -ggagacaaactgaacttccggcagaaacttctgaatctgattctagattggatcttgc tggcac-3‘
Hyb-25 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagaactttaccag ctgtgggttcatgca-3‘
Hyb-26 :5‘ -gcagatccagaagggtagttatcctgatgcgattttgtctagattggatcttgctggcac~3 ‘
Hyb-27 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcacagcagccacct atgggaatgatg-3'
Hyb-28 5' -ggtcaagttaaccaaggcaatcatatgatgggtcagagaccatgtctagattggatct tgctggcac-3‘
Hyb-29 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagtcccaaagctc aggattcttcgaaaagtt-3‘
Hyb-30 5' -gagaaaattgatgacttcaaagctgaagactttcagatctagattggatcttgctggc ac~3 ‘
Hyb-31 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcaccacgctctcac aacatgccttcaga-3‘
Hyb-32 :5‘ -tggaatggtaggtgggggtcctcctgcaccgcacatgccatgtctagattggatcttg ctggcac-3‘
Hyb-33 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgatctctgaag tgaagatggatg cag-3‘
Hyb-34 :5 ‘ -aattccgacatgactcaggatatgaagttcatcattctagattggatcttgctggca c-3'
Hyb-35 :5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgtcttgtaatt aaaccgtgattcttgaaag-3'
Hyb-36 :5' -gtgtaggtttgattactaggagataccaccgacatttttctctagattggatcttgct ggcac-3'
Hyb-37 -.5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgagtgagatca cagaatcttcaatagacacatc-3'
Hyb-38 :5' -ggccacaccatctttgtcagcagtcacattgcccaagtctcatgtctagattggatct tgctggcac-3'
Hyb-39 :5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtcaatgatgtat atgtgggatatgaaagcg-3'
Hyb-40 -.5' -tagagctggcagattcaaatcctcaaaacacaatatattctagattggatcttgctgg cac-3'
Hyb-41 -.5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgcagagaggag gaaatggccaccatggaga-3'
Hyb-42 :5' -acaaggtgatctgcgccctggtcctggtgtccatgctggccatgtctagattggatct tgctggcac-3'
Hyb-43 -.5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtggtcttcaaaa ctgctgtggtccttgtgt-3'
Hyb-44 -.5' -ataaagatggttccaaacagaagaagaaacttgtaagatctagattggatcttgctgg cac-3'
Hyb-45 :5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgccacgcatga actctgtgagcgatt-3'
Hyb-46 :5' -tgcccgaatcatgttgtccctcagtcgaactcctgctgcatgtctagattggatcttg ctggcac-3'Hyb-47 -.5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgcggtgaagat catagagctgtcgca-3'Hyb-48 :5 ' -gaccacggccaaggtttccttcaacaaaccggtctagattggatcttgctggca c-3'Hyb-49 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggccgcagcct gaggaagtctttcg-3'Hyb-50 :5' _ccagcctcttctccgactgatatctagattggatcttgctggcac_3'Hyb-51 -.5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggagatgggaa ctgcaaagaagttcc-3'Hyb-52 :5 ' -cagagtatctctctctgtcaacaagcatgtagtctagattggatcttgctggca c-3'Hyb-53 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggtcacccctc ccagtctacccatc-3'Hyb-54 :5' _cagccttcatgattcattcctgtgtcaatctagattggatcttgctggcac_3'Hyb-55 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggacatatgga ggtgacgctcgtgtc-3'Hyb-56 :5' _ccagcagtagtaggacatggccttagtctagattggatcttgctggcac_3'Hyb-57 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggtttccgcaa ccctcagaaacttct-3'Hyb-58 :5' _ccaaagtgattacttgcagggagtttctagattggatcttgctggcac_3'Hyb-59 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggaccaggccc agtaggtgaaaaagg-3'Hyb-60 -.5' -catacaaggtgtggcaggaaatccatctagattggatcttgctggcac-3'Hyb-61 -.5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggatagaatgt tggccttgcagcatttg-3'Hyb-62 5 ' -gtgtcatatgcagtagccagtggataaactaatctagattggatcttgctggca c-3'Hyb-63 -.5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggatgaataag gcttcctttgggcctc-3'Hyb-64 :5' _cttggtcagccttccctgttctctctagattggatcttgctggcac_3'Hyb-65 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcaagctcttcc ttcctttgcactgaaagct-3'Hyb-bD -.5' -gtaactctaagtatcagtgtgaaacgggagaaaacagtaaatctagattggatcttgc tggcac-3'Hyb-67 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcattccgctgc ccgtgcttcggtagctt~3'Hyb-68 :5 ' -aagtctttgcctcagcttttttccttgcagccgcttctagattggatcttgctggcac-3'
Hyb-69 :5‘ -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcaatgttgttg aagatgttgtcatagaggagg-3‘
Hyb-70 5 ‘ -atgttcagtgctcagatatcttagaagaggcagattctagattggatcttgctggca c-3'
Hyb-71 acaacaggttgta-3‘
Hyb-72
Hyb-73 tgtgatcgtagcagg-3
Hyb-74 :5‘
Hyb-75 :5‘-tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcatgcaactgg-cagggatgactgtacgaaagccacacacttctagattggatcttgctggcac-3‘ -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcacgttcgtaa-gagccaatgtttttgcctggtgtctagattggatcttgctggcac-3‘ ■tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcaatttaaacg tttgcaaagtggcgtgcc-3‘
Hyb-76 5' -ccttggcctcacaggcaaagaataacttaaaagctgatctagattggatcttgctggc ac~3 ‘
Hyb-77 :5‘ -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcagcatggcct gtaatttctgtgcctcct-3‘
Hyb-78 :5' -ggaagaatggccatttttcggcttctagattggatcttgctggcac-3‘
Hyb-79 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcaagcatctag gtaggtctttgtagccaatgttacc-3'
Hyb-80 :5' _cgattgtcctacagctttgtccagttctagattggatcttgctggcac_3'
Hyb-81 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtacattgtc actgcaaatcgacacctat-3'
Hyb-82 :5' _taatgggtctcacctcccaactgcttcccctctagattggatcttgctggcac_3'■tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtagttcgtc
Hyb-83 :5 accgatgtgtg-3'
Hyb-84 :5
Hyb-85 :5-caacggacgcaagatcgagctggctgtcttctagattggatcttgctggcac-3' ■tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtggagcatt cagacttgtctttcagca-3'
Hyb-86 :5' -aggactggtctttctatctcttgtactacactgaattctctagattggatcttgctgg cac-3'
Hyb-87 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtcctccact cggaaggactatcctg-3'
Hyb-88 5 ' -ctgccaagagggtcaagttggacagtgtcagagtctagattggatcttgctggca c-3'
Hyb-89 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtgagacctc gttgactggtg-3'
Hyb-90 :5'cac-3‘-gactcaacagtctgcaagtaactttaaggagcaatccctctagattggatcttgctgg
Hyb-915' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtagacacag agtgtgacctcaccgac-3‘
Hyb-92 5 ‘ -gagattgtgaaggatgtgaagcagacgtactttctagattggatcttgctggca c-3'
Hyb-93 5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtcagagatt tcccaagaagctgatgaca-3‘
Hyb-94 5 ‘ -tggcaatggaaaaagggaaatatgttggtgaactctagattggatcttgctggca
Hyb-95 :5‘ -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtcccctcct ggagactgtct-3‘
Hyb-96 :5‘ _cctccttcaggcccaacgagtttgagtcatctagattggatcttgctggcac_3‘
所述擴(kuò)增試劑包括CA PCR混合液A、CA PCR混合液B和CA酶混合液；所述CA PCR 混合液 A 包括商品化的 IXPCR 緩沖液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTPO. 4mM, ΙμΜ 引物-Fl，lyM 引物-R，0. 2 μ M 探針 _A，0. 2 μ M 探針-B，0. 2 μ M 探針-C，0. M μ M 探針-D，0. ΜμΜ探針-Ε，0. ΜμΜ探針-F ；所述CAPCR混合液B包括IXPCR緩沖液， 3. OmMMgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM, 1 μ M 弓|物-F2，1 μ M 弓|物-R，0. 2 μ M 探針-八，0.2口] 探針-8，0力]\1探針-C，0. 24 μ M探針 _D，0. 24 μ M探針 _Ε，0· 24 μ M探針-F ； 所述CA酶混合液包括IU TaqHS, 0. OlU UNG。
所述引物及探針序列為
引物-Fl 5'-gggttccctaagggttgga-3‘
引物-F2 5'-tgctgggacgcattgttgata-3‘
引物-R 5'-gtgccagcaagatccaatctaga-3‘
探針-A 5'-hex-acgggagcctcaccggg-nh2-3 ‘
探針-B 5'-fam-cggccactccgagggca-nh2-3 ‘
探針-C 5'-Cy5-GATGGCAGCCTCACAGGT—P04-3
探針-D 5'-CCGGTGAGGCTCCCGT-dabcyl-3‘
探針-E 5'-GCCCTCGGAGTGGCCG-dabcyl-3‘
探針-F 5'-CCTGTGAGGCTGCCATC-dabcyl-3‘
所述參照試劑包括ca正常對(duì)照和ca陰性對(duì)照所述CA陰性對(duì)照可選自H20、Tris-HCl緩沖液、生理鹽水等中的一種。
所述檢測(cè)探針可以是目前用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的各類探針，可選自TaqMan探針、分子信標(biāo)、改良分子信標(biāo)、雙鏈熒光置換探針、LightCycler探針等中的一種。
所述針對(duì)每條染色體可以設(shè)計(jì)8對(duì)雜交探針，也可以是其他重?cái)?shù)的雜交探針。
所述連接酶可以是Ligase-65，也可以是T4-DNALigase 或E. coli DNA Ligase 等其他DNA連接酶。
所述buffer可以是IX PCRbuffer，也可以是其它類型的PCR緩沖液(buffer)。
本發(fā)明所述試劑盒的具體操作步驟如下
本發(fā)明所述試劑盒的具體操作步驟包括雜交連接反應(yīng)階段、實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)階段和結(jié)果判讀階段。
I.第一階段——雜交連接反應(yīng)階段1)試劑準(zhǔn)備——配液區(qū)①首先將雜交連接試劑和參照試劑從冰箱取出并平衡至室溫。雜交連接反應(yīng)液 配液標(biāo)準(zhǔn)為取nXO. 5 ii L LDR混合液、nX4uL CA連接緩沖液和0. 5 u LCA連接酶加入 到1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。配好的雜交連接反應(yīng)液必須貯存 在-20°C并在4h內(nèi)使用。②將配制好的雜交連接反應(yīng)管裝入凹凸袋轉(zhuǎn)移至模板間。貯存在-20°C直至樣品 變性處理完畢。2)樣品DNA變性及加樣——雜交連接區(qū)①用微量加液器向每支200 ii L離心管(Axygen)中加入相應(yīng)20ng/y L的樣品DNA 5iiL。立即蓋嚴(yán)管蓋，于98°C變性5min。②加入雜交連接反應(yīng)液。樣品DNA變性完畢后，雜交連接反應(yīng)液以每管5 y L分裝 于步驟①的反應(yīng)管中，并用加液器反復(fù)吹吸混勻。③雜交連接程序可為片段化及變性98°C5min;中止(加入雜交連接反應(yīng)液)25°C預(yù)變性95 °C 2min ；雜交連接循環(huán)程序(6個(gè)循環(huán))70°C 2min ；68 °C 2min ；66 °C 2min ；64°C 2min ；62 °C 2min ；終止60°Cn .第二階段一實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)階段1)試劑準(zhǔn)備——配液區(qū)①首先將擴(kuò)增試劑從冰箱取出并平衡至室溫。PCR反應(yīng)液配液標(biāo)準(zhǔn)為取 nX19.8u LCAPCR混合液A和n X 0. 2 y L CA酶混合液加入到1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù) 秒，3000rpm離心數(shù)秒；另取nX 19. 8 y LCAPCR混合液B和nXO. 2 y L CA酶混合液加入到另 一 1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。配好的PCR反應(yīng)液必須貯存在_20°C 并在4h內(nèi)使用。②PCR反應(yīng)液的分裝。PCR反應(yīng)液A/B分別以每管20 y L分裝于PCR薄壁反應(yīng)管。③將配制好的PCR反應(yīng)管裝入凹凸袋轉(zhuǎn)移至模板間。貯存在-20°C直至樣品雜交 連接完畢。2)樣品的加樣——模板間①雜交連接后的產(chǎn)物需稀釋5倍，即用微量加液器向每支已雜交連接的200 y L離 心管(Axygen)中加入40 y L超純水，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。②用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)的已稀釋的雜交連接產(chǎn)物 5iiL。立即蓋嚴(yán)管蓋。③將已加入模板的PCR薄壁反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增區(qū)。
3) PCR擴(kuò)增-擴(kuò)增區(qū)
①PCR擴(kuò)增程序可為
第一步50°C2min，95°C 3min ；
第二步95°C15s，55°C 20s，72°C 20s，45 個(gè)循環(huán)，55°C 20s 處收集熒光信號(hào)，熒光通道選用FAM、HEX和Cy5。
②程序運(yùn)行完畢，將PCR薄壁反應(yīng)管(閉管)取出放入凹凸袋，將封口封嚴(yán)，按污染源處理。
III 第三階段——數(shù)據(jù)分析階段
數(shù)據(jù)分析閾值應(yīng)處于檢測(cè)標(biāo)本熒光值的對(duì)數(shù)上升區(qū)，采集該閾值對(duì)應(yīng)的Ct值并按以下公式計(jì)算出Δ Δ Ct值
A 管檢測(cè)目標(biāo) Δ CtFAM = Ct應(yīng)-(CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3
正常參照Δ CtFAM = CtFAM- (CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3
Δ Δ CtFAM =目標(biāo) Δ CtFAM"參照 Δ CtFAM
同理，ΔΔ CtHEX =目標(biāo) Δ CtHEX-參照 Δ CtHEX
Δ Δ Ctcy5 =目標(biāo) Δ Ctcy5-參照 Δ Ctcy5
B 管檢測(cè)目標(biāo) Δ CtFAM = CtFAM"CtCY5
正常參照Δ CtFAM = CtFAM-CtCY5
Δ Δ CtFAM =目標(biāo) Δ CtFAM-參照 Δ CtFAM
同理，ΔΔ CtHEX =目標(biāo) Δ CtHEX-參照 Δ CtHEX
每個(gè)反應(yīng)設(shè)立2 3個(gè)平行管，取平均值進(jìn)行分析。
正常標(biāo)本即野生型在各體系及各通道中的Δ ACt值范圍如下
反應(yīng)體系A(chǔ)和B中Δ Δ Ct值的正常參照范圍均為士0. 3。
Ct值以儀器自動(dòng)判讀所得為準(zhǔn)，當(dāng)儀器給出的Ct值不在檢測(cè)標(biāo)本熒光值的對(duì)數(shù)上升區(qū)時(shí)，可通過調(diào)整基線方法獲得Ct值。
以下給出結(jié)果判讀
1)Α 管
CY5通道的Δ Δ CT值小于等于_0. 4的標(biāo)本可判斷為21三體；
FAM通道的Δ Δ CT值小于等于-0. 4的標(biāo)本可判斷為18三體；
HEX通道的Δ Δ CT值小于等于-0. 4的標(biāo)本可判斷為13三體；
各通道的Δ ACT值介于-0.3和0.3之間的標(biāo)本可判斷為正常，如果各通道的 Δ ACT值介于-0. 3和-0. 4或大于0. 3之間的標(biāo)本需要重新檢測(cè)。
2) B 管
首先通過FAM通道的信號(hào)判斷標(biāo)本性別有信號(hào)升起且CT值小于等于30的為男性，無信號(hào)升起或有微弱信號(hào)(CT值為0或大于等于35的為女性)；
其次，針對(duì)男性標(biāo)本，結(jié)果判斷如下
FAM通道的Δ Δ CT值小于等于_0. 4標(biāo)本可判斷為47，XYY ；
HEX通道的Δ Δ CT值小于等于-0. 4的標(biāo)本可判斷為47，XXY ；
兩通道的Δ ACT值介于-0.3和0.3之間的標(biāo)本可判斷為ΧΥ，如果兩通道的 Δ Δ CT值介于-0. 3和-0. 4之間或者大于0. 3的標(biāo)本需要重新檢測(cè)。
針對(duì)女性標(biāo)本，結(jié)果判斷如下
HEX通道的Δ Δ CT值小于等于-0. 4的標(biāo)本可判斷為47，XXX ；
HEX通道的Δ Δ CT值大于等于0. 6的標(biāo)本可判斷為45，XO ；
HEX通道的Δ Δ CT值介于_0. 3禾Π 0. 3之間的標(biāo)本可判斷為XX，如果HEX通道的 Δ Δ CT值介于0. 3和0. 6之間或-0. 3和-0. 4之間的標(biāo)本需要重新檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染、試劑污染、樣品交叉污染會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；試劑運(yùn)輸、保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確會(huì)引起試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果。


圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)組成示意圖。
圖2為實(shí)時(shí)熒光多重探針連接再擴(kuò)增技術(shù)原理圖。A 雜交探針分別與對(duì)應(yīng)的染色體上序列雜交。B 充分雜交后利用連接酶使左側(cè)探針與右側(cè)探針連接成完整的可擴(kuò)增的雜交探針。C 利用一對(duì)通用引物擴(kuò)增雜交探針，采用不同熒光標(biāo)記的檢測(cè)探針指示不同染色體序列的擴(kuò)增情況，由實(shí)時(shí)熒光PCR儀記錄擴(kuò)增曲線。
圖3為唐氏綜合征與正常對(duì)照區(qū)分圖。橫坐標(biāo)為閾值(％)，縱坐標(biāo)為ACt值?？招恼叫未?2份唐氏綜合征標(biāo)本，實(shí)心三角形代表100份正常對(duì)照。
圖4為200例正常人和47例染色體異常標(biāo)本(包括23例21三體，3例13三體， 3例18三體，8例ΧΧΥ，1例XYY和9例X)的檢測(cè)對(duì)照區(qū)分圖。橫坐標(biāo)為標(biāo)本類型，縱坐標(biāo)為Δ Δ Ct值。
具體實(shí)施方式
參見圖1，本發(fā)明實(shí)施例設(shè)有盒體1、雜交連接試劑、擴(kuò)增試劑和參照試劑；所述雜交連接試劑、擴(kuò)增試劑和參照試劑設(shè)在盒體1內(nèi)。
所述雜交連接試劑包括LDR混合液21、CA連接Buffer混合液22和CA連接酶23 ； 所述LDR混合液21即96條雜交探針混合液，每種雜交探針均為5fmol，所述CA連接緩沖液 22 即為商品化的 IXTaq DNALigase Buffer ；所述 CA 連接酶 23 即 IU Taq DNALigase ；
所述擴(kuò)增試劑包括CA PCR混合液A 31、CA PCR混合液B 32和CA酶混合液33 ；所述 CAPCR 混合液 A31 包括商品化的 1 XPCRbuffer，3. OmMMgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4πιΜ，1μΜ引物-Fl，lyM引物-R，0. 2μΜ探針-Α，0. 2μΜ探針-Β，0. 2μΜ探針-C， 0. 24μΜ探針-D，0. 24μΜ探針_Ε，0. 24 μ M探針-F ；所述CAPCR混合液B 32包括商品化的 IXPCR buffer, 3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM, 1 μ M 弓|物-F2，1 μ M 引物-札0.2 4] 探針-六，0.2 4]\1探針-8，0.2 4]\1探針-C，0. ΜμΜ探針_D，0. ΜμΜ探針-Ε， 0. 24 μ M探針-F ；所述CA酶混合液33包括IU TaqHS，0. OlU UNG。
所述參照試劑包括CA正常對(duì)照41和CA陰性對(duì)照42 ；所述CA正常對(duì)照41為正常人DNA，所述CA陰性對(duì)照42可選自H20、Tris-HCl緩沖液、生理鹽水等中的一種。
所述檢測(cè)探針可以是目前用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的各類探針，如TaqMan探針、分子信標(biāo)、改良分子信標(biāo)、雙鏈熒光置換探針、LightCycler探針等。
所述針對(duì)每條染色體可以設(shè)計(jì)8對(duì)雜交探針，也可以是其他重?cái)?shù)的雜交探針。
所述連接酶可以是Ligase-65，也可以是T4-DNALigase 或E. coli DNA Ligase 等其他DNA連接酶。
所述buffer可以是1 XPCR buffer,也可以是其它類型的PCR緩沖液(buffer)。
以下給出具體實(shí)施例
實(shí)施例1 實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)能力的考察
本發(fā)明公開一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒。該試劑盒采用雜交連接反應(yīng)結(jié)合實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，建立了常見染色體非整倍體的快速檢測(cè)體系。該體系由雜交連接和實(shí)時(shí)PCR兩部分組成。以第一管檢測(cè)13、18和21號(hào)染色體的信號(hào)的體系為例對(duì)本試劑盒的發(fā)明原理做如下說明在雜交連接體系中，雜交探針與基因組模板上互補(bǔ)序列充分雜交并利用連接酶將左側(cè)探針與右側(cè)探針連接為一條完整的可供擴(kuò)增的雜交探針， 如圖2-A和圖2-B。后續(xù)的實(shí)時(shí)PCR體系則通過該反應(yīng)管對(duì)連接后的雜交探針進(jìn)行擴(kuò)增，并利用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的檢測(cè)探針指示不同組的可供擴(kuò)增雜交探針數(shù)量，即間接指示了對(duì)應(yīng)染色體的數(shù)目如圖2-C。最后利用一定的數(shù)據(jù)分析方法對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR儀記錄的擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析即可獲得染色體非整倍體的信息。
以唐氏綜合征為例考察實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)能力。 唐氏綜合征也稱先天愚型，主要核型為47，XX(XY), +210據(jù)統(tǒng)計(jì)新生兒中此病的發(fā)病率約 1/500 1/1000。我國(guó)目前約有60萬以上21三體綜合征患兒，并以每年27000例左右的速度增加。智力發(fā)育不全是本病最突出的癥狀，患者智商僅在25 50之間?；颊呔哂刑厥獾拿嫒?，40%的患者具有先天性心臟病，并且其白血病，白內(nèi)障，呼吸道疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)都較正常人要高。男性患者常有隱睪，無生育能力；女性患者通常無月經(jīng)，偶有生育能力，并有可能將此病遺傳給下一代。
為了考察實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒在非整倍體產(chǎn)前診斷的臨床應(yīng)用潛力，我們對(duì)唐氏綜合征臨床標(biāo)本和正常對(duì)照進(jìn)行了病例-對(duì)照試驗(yàn) (case-control study)。32份非整倍體DNA均提取自唐氏綜合征患者的外周血白細(xì)胞，為廈門市婦幼保健院所提供。100份正常DNA對(duì)照樣品提取自正常人外周血白細(xì)胞，為廈門市中心血站所提供。樣品的使用均獲得相關(guān)責(zé)任人的同意。所有血液樣品均使用Qiagen公司的DNeaSyTMBl00d Kit并遵照其說明書的提取方式提取DNA。提取后的DNA采用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行OD26tl測(cè)定并計(jì)算濃度。最終DNA以20ng/ μ L濃度分裝于_20°C保存待用。
雜交連接反應(yīng)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行。
1.5yL全血DNA置于200yL離心管(Axygen)中，98 °C加熱變性5min，降溫至 25 °C。
2. 0. 5 μ L雜交探針混合液與4μ L Ligase緩沖液、0. 5 μ L Taq連接酶振蕩混勻后加入離心管內(nèi)與5 μ L全血DNA混合組成雜交反應(yīng)體系，再次振蕩混勻。
3.雜交反應(yīng)體系95°C變性2min，雜交循環(huán)程序(6個(gè)循環(huán))70°C 2min ；68°C 2min ；66°C 2min ；64°C 2min ；62°C 2min，溫度降至 60°C，雜交連接反應(yīng)完成。
實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)均在Mx3005P五色實(shí)時(shí)熒光PCR儀(Stratagene)上進(jìn)行。 25μ L 反應(yīng)體系 A 內(nèi)含 10mmol/L Tris-HCl (ρΗ 8. 6)，50mmol/L KCl, IU TaqHS (Takara), 0. 0IUUNG, 3mmol/L Mg2+，dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM, 0. 2 μ M 探針 _Α，0. 2 μ M 探針-B，0· 2μ M探針-C，0· 24 μ M 探針 _D，0. 24 μ M 探針 _Ε，0· 24 μ M 探針-F，1 μ M 弓丨物 _F1，ΙμΜ引物-R。5 μ L連接反應(yīng)的產(chǎn)物作為擴(kuò)增的模板。反應(yīng)程序如下50°C溫育aiiin，95°C 預(yù)變性:3min ；95°C變性15s，55°C退火20s，72°C延伸20s，45個(gè)循環(huán)，在退火階段采集FAM、 HEX和Cy5通道的熒光信號(hào)。
數(shù)據(jù)分析將擴(kuò)增曲線的終點(diǎn)熒光值平均分為十份分別設(shè)定為閾值，采集不同閾值對(duì)應(yīng)的Ct值并按以下公式計(jì)算出Δ Ct值
Δ Ctcy5 = Ctcy5- (CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3.
每個(gè)反應(yīng)設(shè)立2 3個(gè)平行管，取平均值進(jìn)行分析。
結(jié)果如圖3所示，在很寬的范圍內(nèi)，32份唐氏綜合癥標(biāo)本與100份正常對(duì)照沒有交疊，可以顯著區(qū)分，說明此項(xiàng)技術(shù)可以很好地進(jìn)行非整倍體檢測(cè)。
實(shí)施例2 染色體非整倍體的檢測(cè)
目前，在人類常染色體中只發(fā)現(xiàn)21三體，18三體和13三體這三種類型的非整倍體活產(chǎn)兒，而其他常染色體非整倍體胎兒均在妊娠早期自發(fā)性流產(chǎn)。人類的性染色體較易發(fā)生非整倍體變異，如常見的有核型為47，XXX、47，XXY,47, XYY和45，X等情況。為了評(píng)估實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒在非整倍體產(chǎn)前診斷的臨床應(yīng)用潛力，我們對(duì)以上幾種常見的染色體非整倍體臨床標(biāo)本和正常對(duì)照進(jìn)行了病例-對(duì)照試驗(yàn)(case-control study)。試驗(yàn)共收集到的47份染色體非整倍體DNA均提取自染色體非整倍體患者的外周血白細(xì)胞，200份正常DNA對(duì)照樣品提取自正常人外周血白細(xì)胞。所有血液樣品均使用Qiagen 公司的DNeaSyTMBl00d Kit并遵照其說明書的提取方式提取DNA。提取后的DNA采用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行OD26tl測(cè)定并計(jì)算濃度。最終DNA以20ng/ μ L濃度分裝于_20°C保存待用。
雜交連接反應(yīng)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行。
1.5yL全血DNA置于200yL離心管(Axygen)中，98 °C加熱變性5min，降溫至 25 °C。
2. 0. 5 μ L雜交探針混合液與4 μ L連接酶緩沖液、0. 5 μ L Taq連接酶振蕩混勻后加入離心管內(nèi)與5 μ L全血DNA混合組成雜交反應(yīng)體系，再次振蕩混勻。
3.雜交反應(yīng)體系95°C變性2min，雜交循環(huán)程序(6個(gè)循環(huán))70°C 2min ；68°C 2min ；66°C 2min ；64°C 2min ；62°C 2min，溫度降至 60°C，雜交連接反應(yīng)完成。
實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)均在美國(guó)Bio-Rad公司的熒光定量PCR儀(CFX96)上進(jìn)行。 25μ L 反應(yīng)體系 A 內(nèi)含 10mmol/L Tris-HCl (ρΗ 8. 6)，50mmol/L KCl, IU TaqHS (Takara), 0. 0IUUNG, 3mmol/L Mg2+，dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM, 0. 2 μ M 探針 _Α，0. 2 μ M 探針-B，0· 2μ M探針-C，0· 24 μ M 探針 _D，0. 24 μ M 探針 _Ε，0· 24 μ M 探針-F，1 μ M 弓丨物 _F1， 1口皿引物-1 。5μ L連接反應(yīng)的產(chǎn)物作為擴(kuò)增的模板。25yL反應(yīng)體系B內(nèi)含IOmmol/ L Tris-HCKpH 8. 6)，50mmol/L KCl, IU TaqHS (Takara) ,0. OlU UNG,3mmol/L Mg2+, dATP、 dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM，0. 2 μ M 探針-A, 0. 2 μ M 探針-B，0. 2 μ M 探針-C，0. 24 μ M 探針-D，0. 24 μ M探針-Ε，0. 24 μ M探針-F，1 μ M引物-F2，1 μ M引物-R。5 μ L連接反應(yīng)的產(chǎn)物作為擴(kuò)增的模板。反應(yīng)程序如下50°C溫育anin，95°C預(yù)變性:3min ；95°C變性15s，55°C 退火20s，72°C延伸20s，45個(gè)循環(huán)，在退火階段采集FAM、HEX和Cy5通道的熒光信號(hào)。
數(shù)據(jù)分析閾值應(yīng)處于檢測(cè)標(biāo)本熒光值的對(duì)數(shù)上升區(qū)，采集該閾值對(duì)應(yīng)的Ct值并按以下公式計(jì)算出Δ Δ Ct值
A 管檢測(cè)目標(biāo) Δ CtFAM = Ct應(yīng)-(CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3
正常參照Λ CtFAM = CtFAM- (CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3
Δ Δ CtFAM =目標(biāo) Δ CtFAM_ 參照 Δ CtFAM
同理，ΔΔ CtHEX =目標(biāo) Δ CtHEX-參照 Δ CtHEX
Δ Δ Ctcy5 =目標(biāo) Δ Ctcy5-參照 Δ Ctcy5
B 管檢測(cè)目標(biāo) Δ CtFAM = CtFAM-CtCY5
正常參照Δ CtFAM = CtFAM-CtCY5
Δ Δ CtFAM =目標(biāo) Δ CtFAM_ 參照 Δ CtFAM
同理，ΔΔ CtHEX =目標(biāo) Δ CtHEX_ 參照 Δ CtHEX
每個(gè)反應(yīng)設(shè)立2 3個(gè)平行管，取平均值進(jìn)行分析。
結(jié)果如圖4所示，47份非整倍體標(biāo)本與200份正常對(duì)照在A體系和B體系均沒有交疊，可以顯著區(qū)分，說明此項(xiàng)技術(shù)可以很好地進(jìn)行非整倍體檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，其特征在于設(shè)有盒體、雜交連接試劑、擴(kuò)增試劑和參照試劑；所述雜交連接試劑、擴(kuò)增試劑和參照試劑設(shè)在盒體內(nèi)；所述雜交連接試劑包括LDR混合液、CA連接緩沖液和CA連接酶；所述LDR混合液即96 條雜交探針混合液，每條雜交探針5fmol ；所述CA連接緩沖液即商品化的1 X Taq DNA連接酶緩沖液；所述CA連接酶即IU Taq DNA連接酶； 所述96條雜交探針序列為Hyb-I 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggcgaaacaaaggcaacgc gtctttccac-3‘Hyb-2 5 ‘ -agccaggcagtctgtatcttgcaaaaacatccactctgcctctagattggatcttgctggcac-3^Hyb-3 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggccttgctgcatttacag ggtattc attaag-3‘Hyb-4 :5 ‘ -tgaaattgtgccttgcctgagtgagcttcataaagcgtacacttctagattggatcttgctgg cac-3‘Hyb-5 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggctggaaggcctcctaag aggactcaaa-3‘Hyb-6 :5‘ -gtgtcacctccccagagaactctcacatcatgccgcattctgtccctctagattggatcttgc tggcac-3‘Hyb-7 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccggggattctaccagaaagga atgaagaacagaac-3‘Hyb-8 5' -cttcaggaattgagtcacaatgcagacaaatatctagattggatcttgctggcac-3'Hyb-9 -.5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccggggctagacgagtgctacg agcgct-3'Hyb-10 -.5' -tcagtcgcgagacagacggggcgcagaagcggcggatgtattctagattggatcttgctggc ac~3'Hyb-11 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggcttgaatgcctgccct ggttgtgtgg-3'Hyb-12 :5' -actccttaatgccaatcatttcttcacttctctgggacacccagtctagattggatcttgct ggcac-3'Hyb-13 -.5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggctcaggaccttggtgg acactgtg-3'Hyb-14 :5' -tacacctctggattcattgtctctcacagattctagattggatcttgctggcac-3'Hyb-15 -.5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggggctctggaccatccg ggcatac-3'Hyb-16 5-aaagcagaagagaggtgtcaggaactgtttgatgcacatctagattggatcttgctggcac-3^Hyb-17 :5' -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagtaatgatgcctgtct gagcattgtgcata-3'Hyb-18 -.5' -gtttgatgtgccatagacaaggtggagagagtgaaacatttgccatgtctagattggatcttgctggcac-3‘Hyb-19 :5 ‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagtgatgacattctgcc caagtaacccctac-3‘Hyb-20 :5 ‘ -tgcgcctgctacatgtctctcttccaggtgaacggcatgtcatgtctagattggatcttgct ggcac-3‘Hyb-21 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagtcagaggataaccag ccccgtt-3‘Hyb-22 5' -cacgtcagtttctacgtctgcaacgggaagagaaagcgaagtctagattggatcttgctggc ac~3 ‘Hyb-23 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagcgagtgtgctactca actcagga gattt-3‘Hyb-24 5' -ggagacaaactgaacttccggcagaaacttctgaatctgattctagattggatcttgctggcac~3 ‘Hyb-25 gggttcatgca-3 ‘ Hyb-26 5c-3'"gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagaactttaccagctgt -gcagatccagaagggtagttatcctgatgcgattttgtctagattggatcttgctggcaHyb-27 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcacagcagccacctatgggaatgatg-3‘Hyb-28 5' -ggtcaagttaaccaaggcaatcatatgatgggtcagagaccatgtctagattggatcttgctggcac-3‘"gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcagtcccaaagctcaggaHyb-29 5' ttcttcgaaaagtt-3 ‘Hyb-30 5 ‘ -gagaaaattgatgacttcaaagctgaagactttcagatctagattggatcttgctggcaHyb-31 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagcggccactccgagggcaccacgctctcacaaca tgccttcaga-3‘Hyb-32 :5‘ -tggaatggtaggtgggggtcctcctgcaccgcacatgccatgtctagattggatcttgctggcac-31Hyb-33 5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgatctctgaagtgaagatggatg cag-3‘ Hyb-34 5-aattccgacatgactcaggatatgaagttcatcattctagattggatcttgctggcac-3'Hyb-35 :5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgtcttgtaattaaac cgtgattcttgaaag-3'Hyb-36 :5' -gtgtaggtttgattactaggagataccaccgacatttttctctagattggatcttgctggcaHyb-37 -.5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgagtgagatcacaga atcttcaatagacacatc-3'Hyb-38 :5 ‘ -ggccacaccatctttgtcagcagtcacattgcccaagtctcatgtctagattggatcttgct ggcac-3‘Hyb-39 5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtcaatgatgtatatgt gggatatgaaagcg-3‘Hyb-40 5 ‘ -tagagctggcagattcaaatcctcaaaacacaatatattctagattggatcttgctggcaHyb-41 5 ‘ -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgcagagaggaggaaa tggccaccatggaga-3‘Hyb-42 :5‘ -acaaggtgatctgcgccctggtcctggtgtccatgctggccatgtctagattggatcttgct ggcac-3‘Hyb-43 5' -gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtggtcttcaaaactgc tgtggtccttgtgt-3'Hyb-44 5 ‘ -ataaagatggttccaaacagaagaagaaacttgtaagatctagattggatcttgctggcaHyb-45 :5' tgtgagcgatt-3 ‘ Hyb-46 :5‘ cac-3‘Hyb-47 :5‘ gagctgtcgca-3 ‘ Hyb-48 :5' Hyb-49 :5' aagtctttcg-3' Hyb-50 :5' Hyb-51 :5' aaagaagttcc-31 Hyb-52 :5' Hyb-53 :5' tctacccatc-3' Hyb-54 :5' Hyb-55 :5' acgctcgtgtc-31 Hyb-56 :5' Hyb-57 :5' cagaaacttct-31 Hyb-58 :5' Hyb-59 :5' ggtgaaaaagg-31"gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgccacgcatgaactc-tgcccgaatcatgttgtccctcagtcgaactcctgctgcatgtctagattggatcttgctgg"gggttccctaagggttggacctcactcaggatggcagcctcacaggtgcggtgaagatcata-gaccacggccaaggtttccttcaacaaaccggtctagattggatcttgctggcac-3' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggccgcagcctgagg-ccagcctcttctccgactgatatctagattggatcttgctggcac-3' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggagatgggaactgc-cagagtatctctctctgtcaacaagcatgtagtctagattggatcttgctggcac-3' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggtcacccctcccag-cagccttcatgattcattcctgtgtcaatctagattggatcttgctggcac-3' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggacatatggaggtg-ccagcagtagtaggacatggccttagtctagattggatcttgctggcac-3' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggtttccgcaaccct-ccaaagtgattacttgcagggagtttctagattggatcttgctggcac-3' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggaccaggcccagtaHyb-60 5' -catacaaggtgtggcaggaaatccatctagattggatcttgctggcac-3'Hyb-61 5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggatagaatgttggc cttgcagcatttg-3‘Hyb-62 5 ‘ -gtgtcatatgcagtagccagtggataaactaatctagattggatcttgctggcac-3‘Hyb-63 5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagaacgggagcctcaccgggatgaataaggctt cctttgggcctc-3‘Hyb-64 :5‘ -cttggtcagccttccctgttctctctagattggatcttgctggcac-3‘Hyb-65 5 ‘ -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcaagctcttccttcc tttgcactgaaagct-3‘Hyb-66 5' -gtaactctaagtatcagtgtgaaacgggagaaaacagtaaatctagattggatcttgctggc ac~3 ‘Hyb-67 :5 ‘ -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcattccgctgcccgt gcttcggtagctt~3‘Hyb-68 5 ‘ -aagtctttgcctcagcttttttccttgcagccgcttctagattggatcttgctggcaHyb-69 5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcaatgttgttgaaga tgttgtcatagaggagg-3'Hyb-70 5 ' -atgttcagtgctcagatatcttagaagaggcagattctagattggatcttgctggcaHyb-71 -.5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcatgcaactggacaacaggttgta-3' Hyb-72 :5' Hyb-73 :5' atcgtagcagg-3 Hyb-74 :5' Hyb-75 :5'-cagggatgactgtacgaaagccacacacttctagattggatcttgctggcac-3' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcacgttcgtaatgtg-gagccaatgtttttgcctggtgtctagattggatcttgctggcac-3' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcaatttaaacgtttg caaagtggcgtgcc-3'Hyb-76 5 ' -ccttggcctcacaggcaaagaataacttaaaagctgatctagattggatcttgctggcaHyb-77 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcagcatggcctgtaa tttctgtgcctcct-3'Hyb-78 :5' -ggaagaatggccatttttcggcttctagattggatcttgctggcac-3' Hyb-79 -.5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagacggccactccgagggcaagcatctaggtag gtctttgtagccaatgttacc-3'Hyb-80 :5' -cgattgtcctacagctttgtccagttctagattggatcttgctggcac-3' Hyb-81 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtacattgtcactg caaatcgacacctat-3'Hyb-82 :5' -taatgggtctcacctcccaactgcttcccctctagattggatcttgctggcac-3' Hyb-83 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtagttcgtcaccg atgtgtg-3'Hyb-84 5' -caacggacgcaagatcgagctggctgtcttctagattggatcttgctggcac-3‘Hyb-85 5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtggagcattcaga cttgtctttcagca-3‘Hyb-86 5 ‘ -aggactggtctttctatctcttgtactacactgaattctctagattggatcttgctggcaHyb-87 :5 ‘ -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtcctccactcgga aggactatcctg-3‘Hyb-88 5' -ctgccaagagggtcaagttggacagtgtcagagtctagattggatcttgctggcac-3‘Hyb-89 5 ‘ -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtgagacctcgttg actggtg-3'Hyb-90 5 ' -gactcaacagtctgcaagtaactttaaggagcaatccctctagattggatcttgctggcac-3'Hyb-91 5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtagacacagagtg tgacctcaccgac-3'Hyb-92 -.5' -gagattgtgaaggatgtgaagcagacgtactttctagattggatcttgctggcac-3'Hyb-93 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtcagagatttccc aagaagctgatgaca-3'Hyb-94 -.5' -tggcaatggaaaaagggaaatatgttggtgaactctagattggatcttgctggcac-3'Hyb-95 :5' -tgctgggacgcattgttgatacctcactcagagatggcagcctcacaggtcccctcctggag actgtct-3'Hyb-96 5' -cctccttcaggcccaacgagtttgagtcatctagattggatcttgctggcac-3'所述擴(kuò)增試劑包括CAPCR混合液A、CAPCR混合液B和CA酶混合液；所述CAPCR混合液 A 包括商品化的 1 XPCR 緩沖液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTPO. 4mM, 1 μ M 引物-Fl，lyM 引物-R，0. 2μΜ探針-Α，0. 2μΜ探針 _Β，0· 2μΜ探針-C，0· 24 μ M 探針-D, 0. 24μΜ探針-Ε, 0. 24μΜ探針-F ；所述CAPCR混合液B包括IXPCR緩沖液，3. OmMMgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM，1 μ M 引物-F2，1 μ M 引物-R，0. 2 μ M探針-A，0. 2 μ M 探針-B，0. 2 μ M探針-C，0. 24μΜ探針_D，0. 24 μ M探針_Ε，0. 24 μ M探針-F ；所述CA酶混合液包括 IU TaqHS, 0. OlU UNG ；所述引物及探針序列為引物-Fl5'-gggttccctaagggttgga-3‘引物-F25'-tgctgggacgcattgttgata-3‘引物-r 5'-gtgccagcaagatccaatctaga-3‘探針-a 5'-hex-acgggagcctcaccggg-nh2-3探針-b 5'-fam-cggccactccgagggca-nh2-3探針-c 5'-Cy5-GATGGCAGCCTCACAGGT—PO4探針-D 5'-CCGGTGAGGCTCCCGT-dabcyl-3‘探針-e 5'-GCCCTCGGAGTGGCCG-dabcyl-3‘探針-f 5'-CCTGTGAGGCTGCCATC-dabcyl-3‘所述參照試劑包括CA正常對(duì)照和CA陰性對(duì)照；所述CA正常對(duì)照為正常人DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述CA陰性對(duì)照選自H20、Tris-HCl緩沖液、生理鹽水中的一種。
3.如權(quán)利要求1所述的基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)探針是目前用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的各類探針。
4.如權(quán)利要求1所述的基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)探針選自TaqMan探針、分子信標(biāo)、改良分子信標(biāo)、雙鏈熒光置換探針、 LightCycler探針中的一種。
5.如權(quán)利要求1所述的基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，其特征在于每條染色體設(shè)計(jì)8對(duì)雜交探針，或是其他重?cái)?shù)的雜交探針。
6.如權(quán)利要求1所述的基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述連接酶是 Ligase-65、T4-DNA Ligase、Ε· coli DNA Ligase 中的一種。
7.如權(quán)利要求1所述的基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述緩沖液為1XPCR緩沖液，或其它類型的PCR緩沖液。
8.如權(quán)利要求1所述的基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒的具體操作步驟如下所述試劑盒的具體操作步驟包括雜交連接反應(yīng)階段、實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)階段和結(jié)果判讀階段I.第一階段——雜交連接反應(yīng)階段1)試劑準(zhǔn)備一配液區(qū)①首先將雜交連接試劑和參照試劑從冰箱取出并平衡至室溫，雜交連接反應(yīng)液配液標(biāo)準(zhǔn)為取η X 0. 5 μ L LDR混合液、η X 4 μ L CA連接緩沖液和0. 5 μ LCA連接酶加入到1. 5mL 離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒，配好的雜交連接反應(yīng)液必須貯存在_20°C并在4h內(nèi)使用；②將配制好的雜交連接反應(yīng)管裝入凹凸袋轉(zhuǎn)移至模板間，貯存在-20°C直至樣品變性處理完畢；2)樣品DNA變性及加樣——雜交連接區(qū)①用微量加液器向每支200μL離心管(Axygen)中加入相應(yīng)20ng/μ L的樣品DNA 5 μ L，立即蓋嚴(yán)管蓋，于98°C變性5min ；②加入雜交連接反應(yīng)液，樣品DNA變性完畢后，雜交連接反應(yīng)液以每管5μ L分裝于步驟①的反應(yīng)管中，并用加液器反復(fù)吹吸混勻；③雜交連接程序可為片段化及變性98°C 5min ；中止(加入雜交連接反應(yīng)液)25°C預(yù)變性95 °C 2min ；雜交連接循環(huán)程序(6個(gè)循環(huán))70°C 2min ；.68 °C 2min ； 66 °C 2min ； 64°C 2min ； 62 °C 2min ；終止60°CΠ .第二階段——實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)階段1)試劑準(zhǔn)備一配液區(qū)①首先將擴(kuò)增試劑從冰箱取出并平衡至室溫，PCR反應(yīng)液配液標(biāo)準(zhǔn)為取 nX 19. 8 μ LCAPCR混合液A和ηΧΟ. 2 μ L CA酶混合液加入到1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒；另取ηX 19. 8 μ L CAPCR混合液B和ηΧΟ. 2 μ L CA酶混合液加入到另一 1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒，配好的PCR反應(yīng)液必須貯存在-20°C并在4h內(nèi)使用；②PCR反應(yīng)液的分裝，PCR反應(yīng)液A/B分別以每管20μ L分裝于PCR薄壁反應(yīng)管；③將配制好的PCR反應(yīng)管裝入凹凸袋轉(zhuǎn)移至模板間，貯存在-20°C直至樣品雜交連接完畢；2)樣品的加樣——模板間；①雜交連接后的產(chǎn)物需稀釋5倍，即用微量加液器向每支已雜交連接的200μ L離心管中加入40 μ L超純水，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒；②用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)的已稀釋的雜交連接產(chǎn)物5μ L ；立即蓋嚴(yán)管蓋；③將已加入模板的PCR薄壁反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增區(qū)；3)PCR擴(kuò)增-擴(kuò)增區(qū)①PCR擴(kuò)增程序可為 第一步50°C 2min，95°C 3min ；第二步95°C 15s，55°C 20s, 72°C 20s，45個(gè)循環(huán)，55°C 20s處收集熒光信號(hào)，熒光通道選用FAM、HEX和Cy5 ；②程序運(yùn)行完畢，將PCR薄壁反應(yīng)管(閉管)取出放入凹凸袋，將封口封嚴(yán)，按污染源處理；III 第三階段——數(shù)據(jù)分析階段數(shù)據(jù)分析閾值應(yīng)處于檢測(cè)標(biāo)本熒光值的對(duì)數(shù)上升區(qū)，采集該閾值對(duì)應(yīng)的Ct值并按以下公式計(jì)算出Δ Δ Ct值A(chǔ) 管檢測(cè)目標(biāo) Δ CtFAM = CtFAM- (CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3正常參照 ACtFAM = CtFAM- (CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3Δ Δ CtFAM =目標(biāo) Δ CtFAM-參照 Δ CtFAM同理，Δ Δ Ct觀=目標(biāo)ACtHEX-參照ACtHEXΔ Δ Ctcy5 =目標(biāo) Δ Ctcy5-參照 Δ Ctcy5B 管檢測(cè)目標(biāo) Δ CtFAM = CtFAM-CtCY5正常參照 Δ CtFAM = CtFAM-CtCY5Δ Δ CtFAM =目標(biāo) Δ CtFAM-參照 Δ CtFAM同理，Δ Δ Ct觀=目標(biāo)ACtHEX-參照ACtHEX每個(gè)反應(yīng)設(shè)立2 3個(gè)平行管，取平均值進(jìn)行分析；正常標(biāo)本即野生型在各體系及各通道中的Δ Δ Ct值范圍如下反應(yīng)體系A(chǔ)和B中Δ ACt值的正常參照范圍均為士0. 3 ；Ct值以儀器自動(dòng)判讀所得為準(zhǔn)，當(dāng)儀器給出的Ct值不在檢測(cè)標(biāo)本熒光值的對(duì)數(shù)上升區(qū)時(shí)，通過調(diào)整基線方法獲得Ct值。
全文摘要
基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，涉及一種染色體非整倍體的定量檢測(cè)試劑盒。提供一種快速、靈敏、特異，用于臨床染色體非整倍體疾病檢測(cè)的基于實(shí)時(shí)熒光PCR的染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒。設(shè)有盒體、雜交連接試劑、擴(kuò)增試劑和參照試劑；所述雜交連接試劑、擴(kuò)增試劑和參照試劑設(shè)在盒體內(nèi)；所述雜交連接試劑包括LDR混合液、CA連接緩沖液和CA連接酶；所述擴(kuò)增試劑包括CA PCR混合液A、CA PCR混合液B和CA酶混合液；所述參照試劑包括CA正常對(duì)照和CA陰性對(duì)照。該體系由雜交連接和實(shí)時(shí)PCR兩部分組成。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102517390SQ20111043786
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者夏敏, 李慶閣, 王小波, 郭奇?zhèn)? 黃秋英 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)