專利名稱：Y染色體復合擴增銀染試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于體外一次性擴增Y染色體上的多個DNA目的片段的試劑盒。
背景技術：
人體的23對染色體中，決定性別的染色體叫做性染色體。性染色體分為X、Y兩種。Y染色體是男性特有的，男性有帶X、Y兩種染色體的精子，女性只有帶X染色體的卵子。當帶Y染色體的精子與X染色體的卵子相結合受孕，產生的個體就是男性；而帶X染色體的精子與帶X染色體的卵子相結合，產生的個體則是女性。所以Y染色體只能由男性遺傳，Y染色體的遺傳標記也就隨父系代代相傳。與常染色體相比，Y染色體上的遺傳標記不存在重組與交換。Y染色體遺傳標記的特點可以運用到刑事案件的偵破上。對于個人識別的優(yōu)點在于1.對陰道分泌物與精液構成的混合斑，分析Y染色體遺傳標記可以不受女性成份的干擾。陰道分泌物與精液構成的混合斑痕(以下簡稱混合斑)是性犯罪案件最常見的法醫(yī)物證檢材。混合斑由兩個人甚至多個人的體液構成，混合斑中陰道分泌物的量遠遠高于精液成份。國內外DNA實驗室采用的遺傳標記大多定位于常染色體，用常染色體DNA遺傳標記分型時，大量陰道分泌物成份常常干擾和掩蓋對精液成份的檢測。因此，混合斑的個人識別是法醫(yī)學迫切需要解決的難題。相比之下，檢測Y染色體特異遺傳標記時，由于陰道脫落上皮細胞不含這類遺傳標記，陰道脫落上皮細胞含量多少將不會影響檢測結果。更重要的是，Y染色體特異遺傳標記可實現僅對精液成份分型，結果可與犯罪嫌疑人直接比較，解釋結果更為簡單。
2.用Y染色體遺傳標記檢測輪奸案的混合斑，可推知罪犯的最少人數，為偵察提供線索。
3.男性嫌疑人在逃的案件，可利用嫌疑人父系親屬的DNA進行Y染色體遺傳標記分析。
Y染色體遺傳標記對于親權鑒定的優(yōu)點在于1.父親已死亡或失蹤，可通過父系親屬Y染色體遺傳標記進行父權鑒定2.可對兄弟、叔侄及爺孫隔代關系進行鑒定。
然而，人類Y染色體非重組區(qū)遺傳標記很少，這是Y染色體遺傳標記未能廣泛應用的主要原因。所幸的是，“人類基因組計劃”研究中發(fā)現了一類具有Y染色體特異性的DNA短串聯(lián)重復序列(以下簡稱Y染色體特異STR基因座)，為法醫(yī)學個人識別與親權鑒定帶來了新的希望，可以提供新的技術解決方案和新的檢測手段。認識到Y染色體特異STR基因座的重要性，1996年和2000年在德國柏林分別召開了第一屆和第二屆國際法醫(yī)Y染色體特異STR基因座分型協(xié)調會議。目前，Y染色體特異STR基因座是美國及歐洲國家法醫(yī)學研究的重點之一。然而，與常染色體相比，極少有Y染色體特異STR基因座分型的商品試劑出現。原因在于Y染色體的結構中，長臂DNA有大量大片段重復，要求PCR反應條件比常染色體高得多；用對常染色體的方法進行Y染色體特異STR復合擴增極為困難。另一方面，除擬常染區(qū)外，Y染色體非重組區(qū)中的某些基因座與X染色體仍有部分同源序列，這些基因座在一定的PCR反應條件下不具男性特異性，進一步增加了設計Y染色體特異STR復合擴增體系的難度。
聚合酶鏈式反應(PCR)技術是目前常用體外DNA擴增技術。
在PCR反應時，首先需要一段長約17-20余個堿基的寡核苷酸片段作為引物(primer)，該引物是按照欲檢測的DNA片段的兩個5′端的堿基順序合成的，PCR擴增的特異性取決于引物與模板的特異結合。整個擴增過程分三步(1)變性加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；(2)退火突然變溫后模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合，也存在兩條模板鏈之間的結合，但由于引物的高濃度，結構簡單等特點，主要的結合發(fā)生在模板與引物之間；(3)延伸在DNA聚合酶及鎂離子等存在的條件下，從引物的3′端開始，結合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新DNA鏈。上述三步為一循環(huán)，從理論上講，每經過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經過n個循環(huán)后DNA可擴增2n-2n倍。
目前國內外實驗室對Y染色體STR遺傳標記所采用的最主要的方法還是對其單個STR基因座進行PCR擴增，例如我們實驗室侯一平等人在《ForensicScience Internetional》2001年第118(2-3)期中發(fā)表的《Allele sequencesof six new Y-STR loci and haplotypes in the Chinese Han population》文章中所介紹的方法。單個Y染色體STR基因座擴增較多個Y染色體STR基因座同時擴增(復合擴增)容易，條件較簡單。但是，復合擴增有著單個基因座擴增所不具備的優(yōu)勢，一次能同時能同時擴增多個基因座，省時、經濟。所以Y染色體STR基因座的復合擴增一直是國內外相關實驗室研究的重點。目前，國內外對于Y染色體STR基因座的復合擴增的研究一直處于探索之中，雖然國外已有Y染色體STR基因座的試劑盒出售使用，但它們是基于熒光檢測為基礎的，即采用熒光標記引物、通過DNA自動測序儀進通過自動測序儀進行檢測的方式。例如，Bulter JM等在《Forensic Science Internetional》2002年第129(1)期中發(fā)表的《A novel multiplex for simultaneousamplification of 20 Y chromosome STR markers》文章中所介紹的即是這種方法。而我們的試劑盒的檢測原理與他們不同，我們是以銀染法為基礎設計的。他們檢測的是DNA的單鏈結構(標記熒光的鏈)，而我們檢測的是DNA的雙鏈結構，目前國內外尚未報道相關技術與產品。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種可同時擴增四個基因座、擴增效率高、便于實驗室操作和便于檢測擴增效果的Y染色體復合擴增銀染試劑盒。
本發(fā)明的Y染色體復合擴增銀染試劑盒由分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2以及人工等位基因分型標準物構成，其中短引物YPA為非人類的基因組序列(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)；短引物YPB為非人類的基因組序列
(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)；A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2為分別在能夠與人類的A基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2為分別在能夠與人類的B基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2為分別在能夠與人類的C基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2為分別在能夠與人類的D基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；人工等位基因分型標準物共包括了A基因座分型標準物、B基因座分型標準物、C基因座分型標準物和D基因座分型標準物A基因座分型標準物為A基因座的長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一。
B基因座分型標準物為B基因座的長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一。
C基因座分型標準物為C基因座的長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一。
D基因座分型標準物為D基因座的長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一。
各組份的用量比為短引物YPA0.25～0.35ml(400nM)、短引物YPB0.25～0.35ml(400nM)、緩沖液(無Mgcl2)3.5～4.0ml、DNA聚合酶3000u(3u/μl)、Mgcl22.5～3.5ml(2.25mM)、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2各0.25～0.35ml(40nM)、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2各0.25～0.35ml(40nM)、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2各0.25～0.35ml(40nM)、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2各0.25～0.35ml(40nM)、人工等位基因分型標準物4ml(40nM)，在人工等位基因分型標準物中，A基因座分型標準物1ml(40nM)、B基因座分型標準物1ml(40nM)、C基因座分型標準物1ml(40nM)、D基因座分型標準物1ml(40nM)。
在本發(fā)明的試劑盒中，引物的設計是極其關鍵的，其基本思路是選取一對非人類基因組的短DNA片段作為上述短引物YPA和YPB，并在能與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物(P1、P2)之5′端分別加上該對短引物，從而得到長引物YPA-P1和YPB-P2。此處，能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2亦即是可以與待擴增基因座的人類基因組結合的原始引物。由于復合擴增反應是同時對四個基因座A、B、C、D進行的PCR擴增，相對于不同基因座來說，能夠與該基因座的人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2是不同的，與之相對應，四個待擴增基因座A、B、C、D的長引物YPA-P1和YPB-P2也因P1、P2的不同而不相同。在進行復合擴增反應時，可以同時在PCR反應體系中加入本試劑盒中分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、分型標準物和分別針對四個待擴增基因座A、B、C、D的長引物YPA-P1、YPB-P2，并加入常規(guī)PCR反應所需的單核苷酸。由于各個待擴增基因座A、B、C、D的人類基因組序列中并不含有短引物YPA、YPB所對應的序列，所以在該反應體系進行第一輪PCR反應時(經歷前述變性、退火、延伸的一次循環(huán)過程)，短引物YPA、YPB并不會與人類基因組序列結合，所擴增的DNA片段還是由長引物YPA-P1、YPB-P2中所含的原來的引物對P1、P2所決定。但是，第一輪反應結束后，在待擴增基因座將會產生同時具有目的基因片段和非人類基因組序列YPA、YPB的擴增產物。在PCR反應體系進行第二輪PCR反應(即經歷變性、退火、延伸的第二次循環(huán)過程)時，上述同時具有目的基因片段和非人類基因組序列YPA、YPB的產物被進一步擴增，擴增所用引物仍然是長引物YPA-P1、YPB-P2，反應完成后，所得到的產物同時具有目的基因片段和與短引物對YPA、YPB配對的非人類基因組序列。在本發(fā)明中，我們將上述以長引物作為反應引物的第一輪和第二輪PCR反應稱之為第一階段的反應，即復合擴增過程中第一階段的聚合酶鏈反應。換句話說，復合擴增過程中第一階段的聚合酶鏈反應包括了上述第一輪和第二輪反應。該階段反應所得到的擴增產物同時具有目的基因片段和與短引物對(YPA、YPB)配對的非人類基因組序列，此處將其稱之為復合擴增第一階段的產物。從第三輪PCR反應開始，由于對于各個基因座已經具有上述第一階段的產物，這樣，短引物YPA、YPB就可以作為上述各個擴增基因座的引物，PCR反應就能以上述第一階段的產物為模板進行擴增。與此相類似，在第三輪之后的各輪PCR反應中，均能夠以短引物對(YPA、YPB)充當各個擴增基因座的引物。在經歷多輪(如30輪)PCR循環(huán)反應之后，上述第一階段的產物就會被擴增至上百萬倍。在本發(fā)明中，我們將上述以短引物作為反應引物的PCR反應稱之為第二階段的反應，即復合擴增過程中第二階段的聚合酶鏈反應。需要說明的是，在本發(fā)明的上述設計思路中，第一階段和第二階段的反應是在同一反應體系中進行的，而不是截然地分成兩次反應。實際上，即使是在第三輪及第三輪之后的PCR反應中，仍然存在著上述第一階段的反應，只是其所占比例極低而已。另外，在進行第一階段的PCR擴增反應時有多對引物同時參與反應，即相對于多個待擴增基因座且序列不同的多對長引物同時參與反應(如前所述，各個待擴增基因座的長引物YPA-P1和YPB-P2并不相同)，引物與引物間的反應與競爭在所難免，從而大大降低了PCR擴增的效率，這一弊端在前面討論現有技術時已經提及。但是，就本發(fā)明來說，第一階段的PCR擴增的目的并不是希望獲得大量的擴增片段，而僅僅是使同時帶有目的基因片段和與YPA、YPB配對的非人類基因組序列的產物(第一階段的產物)產生即可，因此上述弊端對整個復合擴增反應過程產生的影響是極其微弱的。而在第一階段的PCR擴增之后，需要擴增的各個目的基因片段的5′端都帶有與YPA、YPB配對的非人類基因組序列，所以加入一對短引物(YPA、YPB)之后，就可以對多個基因座同時進行擴增。由于在此后進行的第二階段擴增中，參與反應的引物只有一對，即短引物對YPA、YPB，不存在引物間的競爭與反應，也無需調整引物間的濃度，從而大大提高了各基因座的擴增效率。因此可以說，第一階段的PCR反應是僅需擴增出少量模板，而第二階段的擴增是高效率擴增所有基因座。就其實質而言，在第二階段的PCR反應中，是把現有復合擴增方法中的多對引物同時擴增多個基因座，轉變?yōu)橐粚σ?YPA、YPB)同時擴增多個基因座；同時，相對于被擴增的各個特異性DNA片段來說，YPA、YPB并非是特異引物，因此，上述過程還由現有復合擴增方法中的由多對特異引物同時擴增多個特異性基因片段，轉變成了由一對非特異引物同時擴增多個特異性基因片段。
在本發(fā)明的試劑盒中，上述短引物YPA、YPB的選取考慮了以下幾個方面的要素①、它必須是非人類基因組序列，即它的序列不會與人類基因組序列相同或互補。②、選取適當的引物長度。大量實驗結果表明，在設計引物時，引物長度是一個非常關鍵的參數，18～24個堿基構成的寡核苷酸鏈是比較優(yōu)化的引物長度；引物過短，將會導致特異性的降低；引物過長，擴增退火時被引發(fā)的模板太少，在指數擴增期，甚至每一步退火步驟的小失誤都將擴大，以致引起擴增產物的明顯減少。③、選取引物中堿基GC的含量和引物的退火溫度Tm。PCR反應的引物應該保持合理的GC含量。兩條引物的GC含量和Tm值應該一致，兼容性差的引物對的擴增效率和特異性都較差。較低的Tm值會導致特異性的喪失，若采用太高的退火溫度，擴增的效率將會非常低；如果退火溫度太低，引物將產生非特異性退火，從而導致非特異性DNA片段的擴增。本發(fā)明在設計引物的Tm值時選擇的溫度是55℃，因為在該溫度下，復合擴增中絕大多數的PCR反應都能進行，同時此溫度將會使首次PCR反應后出現大量的非特異的雜帶，我們就必須通過降低長引物的濃度來減少雜帶。降低長引物濃度后，各引物之間的相互作用降低，非特異性的產物減少，與此同時，我們所需的特異性的產物也降低，但是這并不會影響整個擴增效率。前已述及，前兩輪PCR反應僅僅是上述復合擴增過程的開端，該輪PCR反應的產物并不要求有較大的量，只需產生少量同時具有非人類基因組序列和目的基因的DNA片段，即生成少量用于第二階段的PCR反應的模板，就能通過其后的PCR反應對該模板進行放量擴增。在第一階段的PCR反應之后，參與反應的引物就不再是長引物對(YPA-P1、YPB-P2)，而是短引物對(YPA、YPB)。
通過檢索人類基因數據庫，在人類基因組中并不存在與上述短引物YPA、YPB相對應的序列，從而確保了該短引物不與人類基因組序列發(fā)生結合。
本發(fā)明的試劑盒是針對四個待擴增的Y染色體上的基因座A、B、C、D配制的，因此試劑盒中包含了四對長引物。上述長引物中所含的能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2實際上就是可以與待擴增的四個基因座A、B、C、D的人類基因組特異性結合的原始引物，它們可以通過檢索在互聯(lián)網上公開的人類基因數據庫得到。此處，引物P1、P2的序列由待擴增基因座A、B、C、D的人類基因組序列所決定，且因待擴增基因座的序列的不同而不同。而在具體制作試劑盒產品時，可以根據該試劑盒所針對的四個待擴增的具體基因座A、B、C、D，檢索在互聯(lián)網上公開的人類基因數據庫，得到與四個基因座A、B、C、D相對應的四個具體的引物序列。亦即是說，當產品所針對的四個基因座A、B、C、D是一定的時候，與之對應的四個具體引物序列對(P1、P2)就是確定的，而且是公知的。此時，根據本發(fā)明中給出的上述短引物，就能夠制作出針對四個基因座A、B、C、D的長引物。另外，本發(fā)明試劑盒中所采用的上述緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶和Mgcl2等試劑均可直接采用現有的市售產品，如中國華美公司生產的產品，相應可以實現試劑的國產化。
本發(fā)明試劑盒中所包含的人工等位基因分型標準物是進行結果檢測時分型的對照物，它是本發(fā)明試劑盒的一個重要組份。
在現有的試劑盒中，通常配備了等位基因分型標準物。等位基因分型標準物是指用于STR分型的已知序列的DNA片段群。為了實現實驗室之間的分型標準化與質量控制，國際法醫(yī)血液遺傳學會(現名國際法醫(yī)遺傳學會，International Society of Forensic Genetics，ISFG)于1994年推薦了按核心序列串聯(lián)重復拷貝數命名常染色體等位基因的原則，1997年再次強調了該命名原則以序列分析為基礎的意義。在序列分析為基礎構建的人類等位基因分型標準物對照下，可以避免按分子量測定值計算DNA片段長短所產生的誤差。更重要的是，引物結合到基因組DNA上的位置是可以變化的，同一個體同一STR基因座用不同引物擴增將產生不同長短的DNA片段，而這些不同長短DNA片段的核心序列串聯(lián)重復拷貝數是相同的。顯然，核心序列串聯(lián)重復拷貝數是個體具有的特征，是群體數據可比性的基礎，是不同實驗室取得相同分型結果的關鍵。這一命名原則早已被商品化常染色體STR基因座采用，也為國內外法醫(yī)學者所熟悉。國內外可重復性分析結果表明只要將等位基因分型標準物與樣本PCR擴增產物同步電泳，不同的實驗室，不同的設備，不同的電泳方法，均可得到一致的可重復性結果。
本專利中的人工等位基因分型標準物與等位基因分型標準物的區(qū)別在于系列中DNA片段的序列與人類DNA序列只有部分是相同的，而另一部分是不同的(不同之處在于有一段非人類基因組序列在其中)。這種不同是本專利所述復合擴增與分型Y染色體特異STR基因座所必需，因此也是本專利的關鍵之一。
利用分子克隆技術可以制備本專利中所涉及的Y染色體特異STR基因座人工等位基因分型標準物?；静襟E是先用本專利設計的復合擴增體系擴增不同基因型個體，收集Y染色體特異STR基因座的各個等位基因片段，將其插入pUC重組質粒中，經DNA測序分析，證實插入片段的結構及大小，按國際法醫(yī)遺傳學會2001年公布的Y染色體特異STR基因座分型標準命名插入的等位基因片段，最后經轉染、擴大培養(yǎng)，擴增及再鑒定后制備出人工等位基因分型標準物。
綜上所述，由于本發(fā)明試劑盒中的引物與互聯(lián)網上基因數據庫中公布的引物(即P1、P2)不一致，本發(fā)明中的長引物是在互聯(lián)網上基因數據庫中公布的引物(P1、P2)的基礎之上加入了短引物，因此不能再采用原基因數據庫引物的擴增產物作本發(fā)明中的分型標準物。所以，在本發(fā)明的試劑盒中，針對各個待擴增基因座分別提供了人工等位基因分型標準物，即由各長引物擴增出來的PCR產物所對應的分型標準物，以供使用本發(fā)明試劑盒的實驗室作對照物。就人工等位基因分型標準物的具體構成來說，它實際上是在互聯(lián)網上公布的待擴增基因座的引物序列的PCR擴增產物的兩端加上短引物序列而成，它因所選待擴增基因座的不同而不同。
與前述現有技術相比，本發(fā)明對試劑盒內的引物進行了設計，從而能夠高效率地同時對Y染色體上的任意四個STR基因座進行復合擴增，擴增出大量的目的基因片段，實驗結果的可重現性極高，無需在實驗過程中繁瑣地調整各對引物的濃度，簡化了整個實驗過程，同時，提供了特有的Y染色體復合擴增的人工等位基因分型標準物，可以方便地檢測擴增結果。另外，采用本發(fā)明的試劑盒進行復合擴增反應之后，可以采用硝酸銀染色方式檢測結果，對實驗設備的成本要求不高，而前述現有技術中僅能采用熒光標記引物、通過自動測序儀進行檢測的方式，其對實驗設備的要求高，因此本發(fā)明的產品更符合當前中國大多數分子生物學實驗室的需要，具有中國特色。
本發(fā)明的內容結合以下實施例作更進一步的說明，但本發(fā)明的內容不僅限于實施例中所涉及的內容。
具體實施例方式
實施例1本實施例中的試劑盒所針對的待擴增基因座分別為DYS434、DYS438、DYS439和C4，以下分別以A、B、C、D代表上述四個基因座。
在本實施例中，所給出的Y染色體復合擴增銀染試劑盒由分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2以及人工等位基因分型標準物構成，其中短引物YPA為非人類的基因組序列(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)；短引物YPB為非人類的基因組序列(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)。
A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2為分別在能夠與人類的A基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列。在本實施例中，互聯(lián)網上基因數據庫中公布的A基因座DYS434的引物P1、P2為P1 5’CACTCCCTGAGTGCTGGATT3’P2 5’GGAGATGAATGAATGGATGGA 3’與之相對應，本實施例中的A基因座長引物為YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CACTCCCTGAGTGCTGGATT 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GGAGATGAATGAATGGATGGA 3’
同樣，B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2為分別在能夠與人類的B基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列。在本實施例中，互聯(lián)網上基因數據庫中公布的B基因座DYS4 38的引物P1、P2為P15’TGGGGAATAGTTGAACGGTAA 3’P25’GTGGCAGACGCCTATAATCC 3’與之相對應，本實施例中的B基因座長引物為YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GTGGCAGACGCCTATAATCC 3’C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2為分別在能夠與人類的C基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列。在本實施例中，互聯(lián)網上基因數據庫中公布的C基因座DYS439的引物P1、P2為P15’TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT 3’P25’GCCTGGCTTGGAATTCTTTT 3’與之相對應，本實施例中的C基因座長引物為YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT 3’D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2為分別在能夠與人類的D基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列。在本實施例中，互聯(lián)網上基因數據庫中公布的D基因座C4的引物P1、P2為P15’GTGGAACCAGCCCAAATATC 3’P25’AATGCTCTCTTGGCTTCTCACT 3’與之相對應，本實施例中的D基因座長引物為YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GTGGAACCAGCCCAAATATC 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-AATGCTCTCTTGGCTTCTCACT 3’人工等位基因分型標準物共包括了A基因座分型標準物、B基因座分型標準物、C基因座分型標準物和D基因座分型標準物
A基因座分型標準物為A基因座的長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一。具體來說，在本實施例中，A基因座分型標準物的序列為長引物YPA-A-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-A-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS434)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
同理，B基因座分型標準物為B基因座的長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一。具體來說，在本實施例中，B基因座分型標準物的序列為長引物YPA-B-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-B-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS438)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
C基因座分型標準物為C基因座的長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一。具體來說，在本實施例中，C基因座分型標準物的序列為長引物YPA-C-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-C-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS439)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
D基因座分型標準物為D基因座的長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一。具體來說，在本實施例中，D基因座分型標準物的序列為長引物YPA-D-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-D-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(C4)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
在本實施例中，上述各組份的用量比為短引物YPA0.3ml(400nM)、短引物YPB0.3ml(400nM)、緩沖液(無Mgcl2)3.75ml、DNA聚合酶3000u(3u/μl)、Mgcl23ml(2.25mM)、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2各0.3ml(40nM)、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2各0.3ml(40nM)、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2各0.3ml(40nM)、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2各0.3ml(40nM)、人工等位基因分型標準物4ml，在人工等位基因分型標準物中，A基因座分型標準物1ml、B基因座分型標準物1ml、C基因座分型標準物1ml、D基因座分型標準物1ml。
在本實施例中，緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2這三種試劑均由中國華美公司生產。其中，緩沖液的組分為500 mM KCl100 mM Tris-HCl1.0％ Triton X-100另外，本實施例中的試劑盒是針對1000個樣本制作的。
實施例2本實施例中的試劑盒所針對的待擴增基因座分別為DYS456、DYS443、DYS444和DYS448，以下仍然分別以A、B、C、D代表上述四個基因座。
在本實施例中，除與上述四個基因座相對應的長引物和分型標準物的構成不同之外，試劑盒的其余成份及各成份的用量比均與實施例1相同。在本例中，互聯(lián)網上基因數據庫中公布的A基因座DYS456的引物P1、P2為P15’cccatcaactcagcccaaaac 3’P25’ggaccttgtgataatgtaagata 3’與之相對應，本實施例中的A基因座長引物為YPA-A-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-cccatcaactcagcccaaaac 3’YPB-A-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ggaccttgtgataatgtaagata 3’互聯(lián)網上基因數據庫中公布的B基因座DYS44 3的引物P1、P2為P15’tctttagctttttgcagccc 3’P25’tcattggccacctgcatta 3’與之相對應，本實施例中的B基因座長引物為YPA-B-P1 5’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tctttagctttttgcagccc 3’YPB-B-P2 5’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-tcattggccacctgcatta 3’互聯(lián)網上基因數據庫中公布的C基因座DYS444的引物P1、P2為P15’tttctctcttcccactttaaccag 3’P25’ctcacgttgttcaagggtca 3’與之相對應，本實施例中的C基因座長引物為YPA-C-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tttctctcttcccactttaaccag 3’YPB-C-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ctcacgttgttcaagggtca 3’互聯(lián)網上基因數據庫中公布的D基因座DYS448的引物P1、P2為P15’tcttccttacgtgaatttcctc 3’P25’tgtcaaagagcttcaatggaga 3’與之相對應，本實施例中的D基因座長引物為YPA-D-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tcttccttacgtgaatttcctc 3’
YPB-D-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-tgtcaaagagcttcaatggaga 3’在本實施例中，A基因座分型標準物的序列為長引物YPA-A-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-A-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS456)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
B基因座分型標準物的序列為長引物YPA-B-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-B-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS443)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
C基因座分型標準物的序列為長引物YPA-C-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-C-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS444)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
D基因座分型標準物的序列為長引物YPA-D-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-D-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS448)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
實施例3本實施例中的試劑盒所針對的待擴增基因座分別為DYS458、A10、DYS455和DYS457，以下仍然分別以A、B、C、D代表上述四個基因座。
在本實施例中，除與上述四個基因座相對應的長引物和分型標準物的構成不同之外，試劑盒的其余成份及各成份的用量比也與實施例1相同。在本例中，互聯(lián)網上基因數據庫中公布的A基因座DYS458的引物P1、P2為P15’agcaacaggaatgaaactccaat 3’P25’ccaccacgcccaccctcc 3’與之相對應，本實施例中的A基因座長引物為YPA-A-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-agcaacaggaatgaaactccaat 3’YPB-A-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ccaccacgcccaccctcc 3’互聯(lián)網上基因數據庫中公布的B基因座A10的引物P1、P2為P15’ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT 3’P25’CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA 3’與之相對應，本實施例中的B基因座長引物為YPA-B-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT 3’YPB-B-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA 3’互聯(lián)網上基因數據庫中公布的C基因座DYS455的引物P1、P2為P15’ggggtggaaacgagtgtt 3’P25’atctgagccgagccgagagaatgata 3’與之相對應，本實施例中的C基因座長引物為YPA-C-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ggggtggaaacgagtgtt 3’YPB-C-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-atctgagccgagccgagagaatgata 3’互聯(lián)網上基因數據庫中公布的D基因座DYS457的引物P1、P2為P15’tgcagcctcaatttcctggt 3’
P25’tatagatagatagataaccacag 3’與之相對應，本實施例中的D基因座長引物為YPA-D-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tgcagcctcaatttcctggt 3’YPB-D-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-tatagatagatagataaccacag 3’在本實施例中，A基因座分型標準物的序列為長引物YPA-A-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-A-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS458)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
B基因座分型標準物的序列為長引物YPA-B-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-B-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(A10)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
C基因座分型標準物的序列為長引物YPA-C-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-C-P2經PCR反應的產物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS455)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
D基因座分型標準物的序列為長引物YPA-D-P1經PCR反應的產物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-D-P2經PCR反應的產物
TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS457)原始引物進行PCR擴增后的序列，與互聯(lián)網上的人類基因數據庫中一致。
權利要求
1.一種Y染色體復合擴增銀染試劑盒，其特征是由分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2以及人工等位基因分型標準物構成，其中短引物YPA、YPB為非人類的基因組序列YPA5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′；YPB5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′；A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2為分別在能夠與人類的A基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2為分別在能夠與人類的B基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2為分別在能夠與人類的C基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2為分別在能夠與人類的D基因座的基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；人工等位基因分型標準物共包括了A基因座分型標準物、B基因座分型標準物、C基因座分型標準物和D基因座分型標準物A基因座分型標準物為A基因座的長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一；B基因座分型標準物為B基因座的長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一；C基因座分型標準物為C基因座的長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一；D基因座分型標準物為D基因座的長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經聚合酶鏈式反應所得產物，且長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經PCR擴增所得產物各占其總重量的二分之一；各組份的用量比為短引物YPA0.25～0.35ml(400nM)、短引物YPB0.25～0.35ml(400nM)、緩沖液(無Mgcl2)3.5～4.0ml、DNA聚合酶3000u(3u/μl)、Mgcl22.5～3.5ml(2.25mM)、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2各0.25～0.35ml(40nM)、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2各0.25～0.35ml(40nM)、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2各0.25～0.35ml(40nM)、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2各0.25～0.35ml(40nM)、人工等位基因分型標準物4ml(40nM)，在人工等位基因分型標準物中，A基因座分型標準物1ml(40nM)、B基因座分型標準物1ml(40nM)、C基因座分型標準物1ml(40nM)、D基因座分型標準物1ml(40nM)。
全文摘要
一種Y染色體復合擴增銀染試劑盒，其特征是由分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl
文檔編號C12Q1/68GK1438329SQ0311742
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月10日 優(yōu)先權日2003年3月10日
發(fā)明者侯一平, 李英碧, 應斌武, 冀強, 董建國, 吳謹, 張 申請人:四川大學