專利名稱：一種用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物及其應(yīng)用的制作方法
一種用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及一種用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)是一種地理分布和寄主范圍均很廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌，在土壤、水體、植物、牛奶、人畜腸道中都可以被發(fā)現(xiàn)。凝結(jié)芽孢桿菌耐熱，耐酸，耐鹽，可以形成芽孢；能分解糖類生成L-乳酸，為同型乳酸發(fā)酵菌。1989年美國FDA公布的41種可用于飼料的安全菌株及1992年再次批準(zhǔn)42種中(包括的5種芽孢桿菌)，凝結(jié)芽孢桿菌排在第一位。該種菌具有一定的纖維素分解能力。
凝結(jié)芽孢桿菌在工業(yè)上可以用來生產(chǎn)乳酸，在農(nóng)業(yè)方面可以飼料添加劑，在醫(yī)藥方面是極具潛力的益生菌。但有些時(shí)候它也是令人頭疼的有害菌，其會(huì)導(dǎo)致果醬和蔬菜醬等罐頭產(chǎn)品的酸敗以及牛奶的凝結(jié)。因而發(fā)展快速、準(zhǔn)確的檢測方法對凝結(jié)芽孢桿菌的應(yīng)用研究會(huì)很有幫助。PCR檢測方法速度快、靈敏度高、成本低，是當(dāng)前細(xì)菌鑒定中一種快速有效的方法。但此前國內(nèi)外尚未公布凝結(jié)芽孢菌的全基因組序列，故沒有從樣品DNA中擴(kuò)增出凝結(jié)芽孢桿菌靶標(biāo)序列的特異性引物。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決目前缺乏引物從樣品DNA中擴(kuò)增出凝結(jié)芽孢桿菌靶標(biāo)序列的問題，提供一種用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物。
一種用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物BCF/BCR，正向引物BCF 序列為gatcattttcttccatggtatg(SEQ ID No. 1)，反向引物 BCR 序列為 gaaacgatggcgctggatac(SEQ ID No. 2)。
所述的用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物在凝結(jié)芽孢桿菌的分子檢測中的應(yīng)用。
有益效果相對于使用常規(guī)通用引物擴(kuò)增后還需測序、比對等繁瑣的步驟才能判斷菌株的類型，使用該特異性引物來擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌中異常保守的comK基因，可直接根據(jù)是否擴(kuò)增出comK基因來判斷是否是凝結(jié)芽孢桿菌，這樣既節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，也將大大加快實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。
本發(fā)明的引物是根據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌comK基因存在特異性的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。應(yīng)用本發(fā)明的引物BCF/BCR可從各類樣品DNA中直接擴(kuò)增出長度大約為400bp的凝結(jié)芽孢桿菌目的片段。


圖1為實(shí)施例1中BCF/BCR引物對10種屬細(xì)菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
其中，M泳道為標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000,1-9號泳道為9株凝結(jié)芽孢桿菌的擴(kuò)增結(jié)果，10-17號泳道分別為含有枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、鞘月旨單胞菌屬(Sphingomonadales)、紅球菌屬(Rhodococcus) 克氏菌(BurW10Ideria)屬DNA的擴(kuò)增結(jié)果，18號泳道為空白對照的擴(kuò)增結(jié)果。
圖2為實(shí)施例2中BCF/BCR弓丨物對土壤樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
其中，M泳道為標(biāo)準(zhǔn)DL2000，1-4號泳道分別為河北廊坊市土壤樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果，5-8號泳道分別為湖北武漢市土壤樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果，9號泳道為空白對照的擴(kuò)增結(jié)^ ο具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
分別以凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans) (9個(gè)不同菌株)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonadales)、紅球菌屬(Rhodococcus)細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行引物BCF/BCR的特異性驗(yàn)證試驗(yàn)。
PCR擴(kuò)增體系為25 μ L由0. 5 μ L DNA模板(約IOng)、0. 5 μ L正向引物 BCF(10yM)、0.5yL 反向引物 BCR(10 μ Μ)、0· 5 μ L dNTPs (10mmol/L)、2· 5 μ L IOXPCR buffer (withMgC12)、0· 2 μ 1 TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)，滅菌雙蒸水補(bǔ)足 25 μ L。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 5min，變性94°C 30s，退火60°C 30s，延伸72°C 45s，共35個(gè)循環(huán)， 72°C 延伸 5min，4°C 保存。
將本實(shí)施方式擴(kuò)增出的序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出本實(shí)施方式用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物BCF/BCR能夠準(zhǔn)確的擴(kuò)增出凝結(jié)芽孢桿菌的靶標(biāo)序列片段，而未能從其他屬細(xì)菌DNA和空白對照中擴(kuò)增出核酸片段。將1-9號泳道對應(yīng)的序列片段于T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞、測序， 序列長度大約為400bp，并且經(jīng)blast分析，為凝結(jié)芽孢桿菌comk基因的特異序列。
實(shí)施例2
應(yīng)用引物BCF/BCR對8份土樣(采自河北廊坊市和湖北武漢市)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增體系為25yL由IyL DNA模板(約IOng)、1 μ L正向引物BCF (10 μ M)、 1 μ L反向引物BCR(10 μ Μ)、12. 5 μ L，滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μ L。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性 950C 3min，變性 94°C 30s，退火 59°C 30s，延伸 72°C 45s，共；35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min，4°C保存。
將本實(shí)施方式擴(kuò)增出的序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示，從圖2中可以看出本實(shí)施方式用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物BCF/BCR能夠準(zhǔn)確的擴(kuò)增出所有土壤樣品DNA中的凝結(jié)芽孢桿菌的靶標(biāo)序列片段。隨機(jī)挑選1、3、5、7號泳道對應(yīng)的序列片段分別于T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞測序，測序結(jié)果為序列長度大約為400bp，blast分析結(jié)果顯示皆為凝結(jié)芽孢桿菌comk基因的特異序列。
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物BCF/BCR，其特征在于正向引物BCF序列為=SEQ ID No. 1，反向引物 BCR 序列為=SEQ ID No. 2。
2.權(quán)利要求1所述的用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物在凝結(jié)芽孢桿菌的分子檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，公開了一種用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物及其應(yīng)用。用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物BCF/BCR，正向引物BCF序列為SEQ ID No.1，反向引物BCR序列為SEQ ID No.2。所述的用于擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異性引物可在凝結(jié)芽孢桿菌的分子檢測中應(yīng)用。本發(fā)明的引物是根據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌comK基因存在特異性的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。應(yīng)用本發(fā)明的引物BCF/BCR可從各類樣品DNA中直接擴(kuò)增出長度大約為400bp的凝結(jié)芽孢桿菌目的片段。
文檔編號C12Q1/04GK102533743SQ20111043774
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者李順鵬, 閆新, 黃科 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)