專利名稱：以stat3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型及其構(gòu)建和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，尤其涉及一種以具有組成型STAT3活性細(xì)胞為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型；本發(fā)明同時(shí)還涉及該抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3 (STAT3)作為重要的轉(zhuǎn)錄因子在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的的作用，被公認(rèn)為是癌癥相關(guān)蛋白。在許多腫瘤細(xì)胞中，如結(jié)腸癌、乳腺癌、 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肺癌、頭頸部癌等等細(xì)胞中，STAT3常常以持續(xù)活化的形式存在，STAT3受到上游信號(hào)細(xì)胞因子刺激或在某些酪氨酸激酶持續(xù)活化的狀態(tài)下，其C端705位酪氨酸被磷酸化而形成二聚體，進(jìn)而入核調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)一系列基因的調(diào)控，在促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移、 防止凋亡方面發(fā)揮多重作用。通常胞外調(diào)節(jié)STAT3的細(xì)胞因子的有IL-6，LIF, OSM, EGF, PDGF，G-CSF等，胞內(nèi)維持STAT3持續(xù)活性的因素來自于上游受體或非受體酪氨酸激酶的持續(xù)活化或自身突變。研究表明，抑制STAT3活性將會(huì)大大降低多種腫瘤細(xì)胞的生長、生存和轉(zhuǎn)移，從而大大降低它們惡性程度(Ni等人Cancer Res 2000 ； Leong等人Proc Natl Acad Sci 2003 ； Barton 等)κ Mol Cancer Ther 2004 ； Kortylewski 等)κ Nat Med 2005 ； Xin等人Cancer Res 2009)。此外研究表明，在不少腫瘤細(xì)胞中，STAT3可以促進(jìn)和維持NF-κ B的活性，而NF-κ B則是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的另一重要促成因素，在這一類腫瘤中抑制STAT3活性，不僅抑制了 STAT3本身調(diào)控的腫瘤相關(guān)基因，也在一定程度上下調(diào)NF- κ B 的活性，達(dá)到一點(diǎn)雙靶的目的(Yang J等人Cancer Res 2005 ； Yang J等人Genes & Dev 2007 ； Torres J等人Nat Cell Biol 2008 ；Lee H等人Cancer Cell 2009 ；Yu H等人 Nat Rev Cancer 2009)。
目前基于STAT3為靶點(diǎn)的藥物篩選系統(tǒng)通常具有效率低下、步驟繁瑣等缺點(diǎn)，例如每次篩藥都需要使用外源細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素6 (IL-6)和白細(xì)胞抑制因子(LIF)激活細(xì)胞內(nèi)STAT3，額外的步驟將使篩藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性大大降低，成本也因IL-6或LIF的使用將大大增加。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型。
本發(fā)明的另一目的是提供一種以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的，就是提供一種以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型在抗腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用。
(一)以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型本發(fā)明以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，是利用含有STAT3特異性結(jié)合序列的報(bào)告系統(tǒng)載體，以具有組成型STAT3活性細(xì)胞為基礎(chǔ)，構(gòu)建成穩(wěn)定的以STAT3信號(hào)為靶點(diǎn)高通量抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型。
所述STAT3的特異性結(jié)合序列為5’ -TT (C/A) CNNNAA-3，，N為堿基。
所述報(bào)告系統(tǒng)載體是在含有熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有STAT3特異性結(jié)合序列作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成的報(bào)告系統(tǒng)載體。
所述具有組成型STAT3活性細(xì)胞為DU145前列腺癌細(xì)胞、H1299人肺癌細(xì)胞、AM9 人肺癌細(xì)胞、HCTl 19人結(jié)腸癌細(xì)胞、Hela人宮頸癌細(xì)胞、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞、MDA-MB-468 人乳腺癌細(xì)胞或MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞等等。
(二)以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建。
本發(fā)明以STAT3為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建，包括以下工藝步驟(1)報(bào)告系統(tǒng)載體構(gòu)建利用分子生物學(xué)方法在含有熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有STAT3特異性結(jié)合序列以及3’端含有TATA盒序列的DNA片段， 作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成報(bào)告系統(tǒng)載體。插入序列位于熒光素酶報(bào)告基因的上游，當(dāng)STAT3活化時(shí)，便可增強(qiáng)熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和熒光素酶翻譯，從而增強(qiáng)了熒光素酶的活性，加入熒光素酶底物時(shí)即可檢測(cè)到更強(qiáng)的熒光；抑制STAT3活性時(shí)，熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和熒光素酶翻譯的水平都降低，也就抑制細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的活性，加入熒光素酶底物時(shí)熒光強(qiáng)度也就減弱。
(2)細(xì)胞模型的構(gòu)建將報(bào)告系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)染具有組成型STAT3活性細(xì)胞后，用嘌呤霉素進(jìn)行陽性克隆篩選，選取對(duì)已知STAT3信號(hào)抑制劑(如PD-180970，等已知特定細(xì)胞中 STAT3上游信號(hào)抑制劑)有響應(yīng)的克隆，即為以STAT3為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型。
在具有組成型STAT3活性的細(xì)胞中，報(bào)告系統(tǒng)載體能很好地被活化，當(dāng)使用STAT3 信號(hào)通路抑制劑時(shí)即可使熒光被顯著抑制，構(gòu)建的細(xì)胞模型也就無需在外源刺激下靈敏地用于高通量藥物篩選。
(三)以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型在抗腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用。
本發(fā)明以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型用于篩選由STAT3組成型活化造成的癌變及腫瘤的治療藥物。具體篩選抗腫瘤藥物的方法包括以下工藝步驟(1)將所述抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型用100μ 1培養(yǎng)基接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為30% 40% ；(2)在培養(yǎng)基中加入待篩選化合物0.1μ廣2μl，繼續(xù)培養(yǎng) 小時(shí)；(3)在上述96孔板中加入50μ 1穩(wěn)定型熒光素酶底物，使用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定熒光強(qiáng)度并分析熒光抑制率，當(dāng)熒光抑制率達(dá)到40%以上得到初篩產(chǎn)物；(4)以化合物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)消除化合物對(duì)細(xì)胞模型的直接損傷，熒光抑制率達(dá)仍在40% 以上得到復(fù)篩產(chǎn)物，即為以STAT3為靶點(diǎn)的抑制藥物。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)以STAT3信號(hào)通路為靶點(diǎn)，采用基于具有組成型STAT3活性(即持續(xù)STAT3活性)的細(xì)胞系為策略，使報(bào)告系統(tǒng)本身在細(xì)胞中處于高度活化狀態(tài)，得到的穩(wěn)定細(xì)胞模型，無需使用外加刺激，可直接用于化合物的篩選；不僅大大降低了篩選的成本，同時(shí)也使整個(gè)篩選流程從“細(xì)胞培養(yǎng)一激活STAT3 —加化合物一檢測(cè)”簡化為“細(xì)胞培養(yǎng)一加化合物一檢測(cè)”，縮短了篩選的周期，減少了操作步驟，提升了系統(tǒng)的穩(wěn)定性、高效性及易用性，更適用于高通量藥物篩選。


圖1為使用Western-Blot方法檢測(cè)本發(fā)明所涉及的細(xì)胞中STAT3活性結(jié)果。
圖2為使用凝膠電泳阻抑試驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)本發(fā)明所涉及的細(xì)胞中STAT3活性結(jié)^ ο
圖3為所用報(bào)告載體基本骨架。
圖4為所構(gòu)建的報(bào)告系統(tǒng)載體SIE-Iuc插入序列的測(cè)序結(jié)果圖。
圖5為利用細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)載體SIE-Iuc響應(yīng)能力。
圖6為使用Western-Blot方法檢測(cè)A549細(xì)胞在已知抑制劑PD180970處理后的 STAT3活性變化。
圖7為抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型AM9R對(duì)STAT3活性降低或升高的響應(yīng)。
圖8為使用Western-Blot方法檢測(cè)所篩的化合物3412對(duì)STAT3活化的抑制能力。
具體實(shí)施方式
下面以A549細(xì)胞為例，本發(fā)明抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建方法和應(yīng)用作進(jìn)一步說明。
實(shí)驗(yàn)中所采用的儀器和試劑如下儀器=PerkinElmer Victor3熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀。
試劑性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自！^rmentas公司；引物合成及測(cè)序，上海生工提供；DMEM (高糖)及胎牛血清購自Hyclone (Thermo公司)，轉(zhuǎn)染試劑Ger^scort II購自南京慧基生物；螢火蟲熒光素酶測(cè)定試劑盒購自Promega公司；IL-6購自P^rotech公司；PD180970及Puromycin購自Sigma-Aldrich公司；用于篩藥的96孔板購自Corning 公司；待篩選的化合物來自國家小分子化合物資源中心；各種抗體購自Cell Signaling Technology 公司。
1、報(bào)告系統(tǒng)載體構(gòu)建將人工合成的包含的16個(gè)SIE (即STAT3特異性結(jié)合序列)以及通用的TATA盒輔助序5，-TATATAA-3，的DNA片段，以KpnI和HindIII的酶切位點(diǎn)插入到通用的熒光素酶報(bào)告載體pBR322-luC-puro，得到的報(bào)告系統(tǒng)載體命名為SIE_luc。上述STAT3特異性結(jié)合序列包含 8 個(gè) 5，-TTCCCGTAA-3，(M67 序列，hyperactive mutated form of SIE )， 8個(gè)5，-TTCCTGTAA-3，(來自Ly6E基因)交替連接，兩種元件對(duì)STAT3都具有高度特異的親和力。熒光素酶報(bào)告載體pBR322 - Iuc - puro由pBR322載體HindIII和Ml I 之間插入北美螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase，參見J R de Wet等人Mol. Cell. Biol. 1987)報(bào)告基因和嘌呤霉素基因(Puromycin，參見Lacalle RA等人Gene. 1989， GenBank :M25346. 1)所得，并且熒光素酶報(bào)告基因和嘌呤霉素篩選基因通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(IRES)相連，嘌呤霉素基因終止密碼子下游有AATAAA序列為poly A加尾信號(hào)。 pBR322-luc-puro多克隆位點(diǎn)位于原EcoR I和Hind III之間(參見圖3)。
至此，在pBR322-luC-puro熒光素酶報(bào)告載體上的完整插入序列如下(測(cè)序結(jié)果見圖4)
2、報(bào)告系統(tǒng)載體性能測(cè)試由于細(xì)胞對(duì)各種外源細(xì)胞因子的刺激比較敏感，便于在外加細(xì)胞因子刺激時(shí)檢測(cè)相應(yīng)信號(hào)通路的活化情況，所以使用該細(xì)胞作為代表檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)載體是否響應(yīng)正常。 結(jié)果(見圖5)表明，在相應(yīng)信號(hào)通路活化時(shí)所使用報(bào)告系統(tǒng)載體響應(yīng)正常，刺激后與刺激前熒光素酶活性的比例約為18. 7 :1，其中細(xì)胞使用IL-6刺激激活。將細(xì)胞于12 孔板生長至50% 70%密度，轉(zhuǎn)染SIE-Iuc (2 μ g/孔)，載體與轉(zhuǎn)染試劑的使用比例為1 2 (即2 μ g質(zhì)粒，4 μ 1轉(zhuǎn)染試劑，各溶于50 μ 1 DMEM無血清培養(yǎng)基，混合成100 μ 1預(yù)混液，室溫靜置20 min，再加入150 μ 1無血清DMEM，混勻后加入12孔板各孔內(nèi))4小時(shí)后換成完全培養(yǎng)基(即含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，12小時(shí)以后，用IL-6 (250 ng/ ml)處理24小時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入200 μ 1裂解液裂解細(xì)胞，輕搖lOmin，取150 μ 于96 孔板中，加入20 μ 1普通螢火蟲熒光素酶底物，使用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀立即測(cè)定(Imin 以內(nèi))熒光素酶的活性，對(duì)照及處理各3個(gè)重復(fù)，并獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次(***，ρ<0. 001)。
3、藥物篩選模型細(xì)胞選擇通過Wiestern-Blot及EMSA凝膠阻抑實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞中STAT3的活性，得到多種適用與本報(bào)告系統(tǒng)載體的STAT3活性高(無需額外使用IL-6等細(xì)胞因子刺激細(xì)胞)的腫瘤細(xì)胞系(圖1，圖2)，圖1為使用Western-Blot方法檢測(cè)本發(fā)明所涉及的細(xì)胞中STAT3活性結(jié)果。結(jié)果表明包括AM9在內(nèi)的一系列腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞具有更高的STAT3活性，以 STAT3第705位酪氨酸(Tyr705)的磷酸化表征，標(biāo)注為“pTyr705-STAT3”，磷酸化水平越高，活性越高。圖2為使用凝膠電泳阻抑試驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)本發(fā)明所涉及的細(xì)胞中STAT3活性結(jié)果。表明圖1中所用幾種腫瘤細(xì)胞活化的STAT3都比正常細(xì)胞HMEl具有更高的DNA 結(jié)合能力。其中，HME1，人乳腺表皮細(xì)胞(正常對(duì)照細(xì)胞);DU145，前列腺癌細(xì)胞；H印G2，人肝癌細(xì)胞；H1299和A549為人肺癌細(xì)胞，HCT119，人結(jié)腸癌細(xì)胞；Hela，人宮頸癌細(xì)胞；MCF-7、 MDA-MB-468和MDA-MB-231為人乳腺癌細(xì)胞。
4、藥物篩選模型構(gòu)建及性能測(cè)試將SIE-Iuc轉(zhuǎn)染AM9細(xì)胞(IOcm培養(yǎng)皿)48小時(shí)后，1傳3，并加入puromycin 進(jìn)行陽性克隆篩選，初始濃度為5 yg/ml,2周后降為2.5 yg/ml。待形成克隆(共約3 周)后，用胰酶消化單克隆于96孔板，長起后再轉(zhuǎn)入48孔板，6孔板直至10 cm培養(yǎng)瓶和凍存，期間用終濃度為2.5 yg/ml puromycin的繼續(xù)維持2周。首選選取熒光素酶陽性的克隆，再檢測(cè)這些克隆是否響應(yīng)正常；雖然是組成型活化，細(xì)胞一般還能對(duì)外加細(xì)胞因子有所反應(yīng)，故所選陽性克隆的熒光素酶活性在外加IL-6刺激時(shí)應(yīng)當(dāng)還能有所增加。經(jīng)過驗(yàn)證，外加IL-6 (250 ng/ml)刺激時(shí)還能使該細(xì)胞模型STAT3活性提升2. 5倍
權(quán)利要求
1.以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于利用含有STAT3特異性結(jié)合序列的報(bào)告系統(tǒng)載體，以具有組成型STAT3活性細(xì)胞為基礎(chǔ)，構(gòu)建成穩(wěn)定的以STAT3信號(hào)為靶點(diǎn)高通量抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型。
2.如權(quán)利要求1所述以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述 STAT3的特異性結(jié)合序列為5’ -TT(C/A)CNNNAA-3', N為堿基。
3.如權(quán)利要求1所述以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述報(bào)告系統(tǒng)載體是在含有熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有STAT3特異性結(jié)合序列作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成的報(bào)告系統(tǒng)載體。
4.如權(quán)利要求1所述以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述具有組成型STAT3活性細(xì)胞為DU145前列腺癌細(xì)胞、H1299人肺癌細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞、 HCTl 19人結(jié)腸癌細(xì)胞、Hela人宮頸癌細(xì)胞、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞、MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞或MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，包括以下工藝步驟(1)報(bào)告系統(tǒng)載體構(gòu)建利用分子生物學(xué)方法在含有熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有STAT3特異性結(jié)合序列以及3’端含有TATA盒序列的DNA片段， 作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成報(bào)告系統(tǒng)載體；(2)細(xì)胞模型的構(gòu)建將報(bào)告系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)染具有組成型STAT3活性細(xì)胞后，用嘌呤霉素進(jìn)行陽性克隆篩選，選取對(duì)STAT3信號(hào)抑制劑有響應(yīng)的克隆，即為以STAT3為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型。
6.如權(quán)利要求1所述以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型用于篩選由STAT3組成型活化造成的癌變及腫瘤的治療藥物。
7.如權(quán)利要求6所述以STAT3為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型用于篩選由STAT3組成型活化造成的癌變及腫瘤的治療藥物，其特征在于所述篩選抗腫瘤藥物的方法包括以下工藝步驟(1)將所述抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型用100μ 1培養(yǎng)基接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為30% 40% ；(2)在培養(yǎng)基中加入待篩選化合物0.1μ廣2μl，繼續(xù)培養(yǎng) 小時(shí)；(3)在上述96孔板中加入50μ 1穩(wěn)定型熒光素酶底物，使用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定熒光強(qiáng)度并分析熒光抑制率，當(dāng)熒光抑制率達(dá)到40%以上得到初篩產(chǎn)物；(4)以化合物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)消除化合物對(duì)細(xì)胞模型的直接損傷，熒光抑制率達(dá)仍在40% 以上得到復(fù)篩產(chǎn)物，即為以STAT3為靶點(diǎn)的抑制藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以STAT3為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。該模型利用含有STAT3特異性結(jié)合序列的報(bào)告系統(tǒng)載體，以具有組成型STAT3的活性細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，用于篩選由STAT3組成型活化造成的癌變及腫瘤的治療藥物。由于采用具有組成型STAT3活性的細(xì)胞，模型細(xì)胞中報(bào)告基因處于高度活化狀態(tài)，無需使用外加刺激物，得到的穩(wěn)定細(xì)胞模型可直接用于化合物的篩選，不僅大大降低了篩選的成本，同時(shí)也使整個(gè)篩選流程從“細(xì)胞培養(yǎng)→激活STAT3→加化合物→檢測(cè)”簡化為“細(xì)胞培養(yǎng)→加化合物→檢測(cè)”，縮短了篩選的周期，減少了操作步驟，提升了系統(tǒng)的穩(wěn)定性、高效性及易用性，更適用于高通量藥物篩選。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102517373SQ20111042300
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者杜宇平, 楊金波, 王勤, 陳星 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)