專利名稱：一種基于microRNA結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞選擇性多靶點(diǎn)干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法及其功能驗(yàn)證的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝細(xì)胞選擇性多基因靶點(diǎn)干擾的質(zhì)粒載體pLIVE-(shLucl55mi,-shLuc 155mir-shEGFP 13lmir-shEGFP425mir)構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNAi現(xiàn)象最初發(fā)現(xiàn)于1998年Fire等對(duì)秀麗隱桿線蟲的研究， 此后陸續(xù)證實(shí)在真菌、果蠅、擬南芥及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也存在RNAi。目前，RNAi技術(shù)已經(jīng)在功能基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、基因治療和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛的領(lǐng)域里取得了令人矚目的進(jìn)展，使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的前景。病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因或轉(zhuǎn)座子等外源性基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，通常會(huì)產(chǎn)生一些長的雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)。宿主對(duì)這些dsRNA 產(chǎn)生應(yīng)答，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小干擾 RNA (short interfering RNA，siRNA)，約 21_23bp。siRNA 雙鏈在細(xì)胞內(nèi) RNA 解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，進(jìn)一步反義鏈和胞內(nèi)的一些酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。荷載有反義 RNA 鏈的 RISC 與胞內(nèi)同源 mRNA 的同源區(qū)進(jìn)行序列特異性的結(jié)合，因RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位開始切割mRNA， 導(dǎo)致mRNA斷裂降解，從而抑制宿主細(xì)胞基因的表達(dá)。siRNA制備通?？梢苑譃轶w外化學(xué)合成和體內(nèi)載體表達(dá)有兩種方法。體外化學(xué)合成的siRNA可以直接用于導(dǎo)入細(xì)胞抑制目的基因的表達(dá)，但化學(xué)合成的siRNA不穩(wěn)定，容易被RNase降解，且siRNA合成價(jià)格較高，操作要求嚴(yán)格，因此其廣泛應(yīng)用受到限制。另一種方法是通過載體表達(dá)短發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA (short-hairpin RNA, shRNA)，所表達(dá)的shRNA在體內(nèi)被Dicer酶剪切成siRNA從而發(fā)揮作用。相對(duì)來說，DNA載體在體內(nèi)作用更穩(wěn)定，且可以通過特定的抗藥性篩選得到shRNA表達(dá)DNA整合于細(xì)胞基因組的穩(wěn)定干擾細(xì)胞株，便于進(jìn)一步研究特定基因的功能。質(zhì)粒DNA載體按照表達(dá)所使用的啟動(dòng)子類型和shRNA的結(jié)構(gòu)可以分為三類。第一類是由廣泛表達(dá)與各個(gè)細(xì)胞的RNA聚合酶Pol III啟動(dòng)子啟動(dòng)shRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的表達(dá)，通過多個(gè)堿基T來終止轉(zhuǎn)錄。第二類是由RNA聚合酶Pol II啟動(dòng)子啟動(dòng)shRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的表達(dá)，通過Poly (A)序列來終止。特定的Pol II啟動(dòng)子具有細(xì)胞/組織特異性，因此可以干擾特定類型細(xì)胞中的目的基因，而對(duì)其他細(xì)胞中的靶基因不起作用。第三類由RNA聚合酶Pol II啟動(dòng)子，啟動(dòng)基于microRNA結(jié)構(gòu)的shRNA表達(dá)。相對(duì)于前兩種shRNA表達(dá)質(zhì)粒，這種方法能更好的模擬體內(nèi)microRNA作用的過程，避免由于產(chǎn)生過多shRNA阻斷體內(nèi)microRNA 的傳遞通路造成的毒性損傷。目前對(duì)此研究較多的是利用microRNA155和microRNA30的結(jié)構(gòu)，將所設(shè)計(jì)的小RNA干擾序列插入microRNA骨架結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)經(jīng)Dicer酶切割、解旋酶解開雙鏈，再結(jié)合到RISC復(fù)合物中抑制目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)。RNAi現(xiàn)象具有高度的特異性，只有與shRNA序列具有高度匹配的mRNA才能被降解，一個(gè)shRNA只能針對(duì)一個(gè)靶基因進(jìn)行沉默，而且針對(duì)靶基因mRNA不同位點(diǎn)的shRNA干擾效率也不一樣。為了確保RNAi的效率，或者是需要同時(shí)抑制多個(gè)靶基因時(shí)，多靶點(diǎn)RNA干擾載體的應(yīng)用就顯得非常重要。目前對(duì)于多靶點(diǎn)shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，例如中國專利號(hào) CN101245352A公開的技術(shù)方案是以pSilencer2. 0-U6或pSilencer3. O-Hl為基礎(chǔ)，構(gòu)建出能夠同時(shí)表達(dá)多個(gè)shRNA的質(zhì)粒載體pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n，但這種多靶點(diǎn)shRNA 表達(dá)載體不具有細(xì)胞/組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)，且一個(gè)載體中含有多個(gè)U6/H1啟動(dòng)子。 瞬時(shí)的過量表達(dá)shRNA容易導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)microRNA通路的阻斷而引起細(xì)胞毒性作用。亦有人采用microRNA的結(jié)構(gòu)構(gòu)建多靶點(diǎn)shRNA表達(dá)載體(Hyun Jung Junn，Dai-Wu Seol et al. Effective knockdown of multiple target genes by expression the single transcript harbouring multi—cistronic shRNAs. Biochemical and Biophysical Research Communications 396 Q010) 861-865)，但這種載體采用了 CMV 啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在多種細(xì)胞中均能啟動(dòng)shRNA的轉(zhuǎn)錄，抑制靶基因的表達(dá)，不具有細(xì)胞/組織特異性，且易甲基化而失活，導(dǎo)致干擾效率降低。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)發(fā)明了一種基于microRNA結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞選擇性多靶點(diǎn)干擾的質(zhì)粒載體。該載體能夠選擇性的高效抑制肝細(xì)胞中的單個(gè)/多個(gè)靶基因的表達(dá)，而對(duì)其他細(xì)胞不起作用。該載體及其構(gòu)建方法可以應(yīng)用于肝細(xì)胞基因的功能研究和肝臟疾病基因治療藥物的研發(fā)，同時(shí)對(duì)于其他細(xì)胞/組織特異性干擾載體的構(gòu)建具有重要的借鑒和參考價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種基于microRNA結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞選擇性多靶點(diǎn)干擾的質(zhì)粒載體 pLIVE-(shLucl55mir-shLuc Issmir-ShEGFPisimir-ShEGFPdZ^lir)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述肝細(xì)胞選擇性多靶點(diǎn)干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是說明所述肝細(xì)胞選擇性多靶點(diǎn)干擾質(zhì)粒載體在干擾 Luciferase和EGFP報(bào)告基因中的驗(yàn)證應(yīng)用。在本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種基于microRNA結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞選擇性多靶點(diǎn)干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，所述質(zhì)粒載體由具有肝細(xì)胞選擇性的甲胎蛋白增強(qiáng)子 / SSSin^J^ (AFP enhancer/albumin promoter) 3 (Multiple Cloning Sites,MCS)、兩個(gè)內(nèi)含子區(qū)(intron)、多個(gè)靶基因的基于microRNA結(jié)構(gòu)的短發(fā)卡RNA轉(zhuǎn)錄單位(microRNA30-based shRNA, shRNAmir)和質(zhì)粒序列組成，該載體的建立方法是在質(zhì)粒的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)，通過同尾酶結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，串聯(lián)多個(gè)相同或者不同的針對(duì)靶基因(例如，熒光素酶基因(Luciferase)和綠色熒光蛋白基因(EGFP)) WshRNAmi,轉(zhuǎn)錄單位，因而可以同時(shí)選擇性的高效抑制肝細(xì)胞內(nèi)靶基因(例如Luciferase和EGFP)的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒載體采用具體肝細(xì)胞選擇性的啟動(dòng)子，具體地為甲胎蛋白增強(qiáng)子/白蛋白啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述甲胎蛋白增強(qiáng)子/白蛋白啟動(dòng)子的序列為GATCTTTTTGATGGCAGAGTTCAGTTTACCGGGTCACATTGTACCTGGGAAGATTCAAGGATTTATGGA AAAAGTCAACAACAGGAGTCAGAGCAGCCGGAAAAGCATGGACTCTGTACTTAGGACTGCGCTTTGAGCAATGGCACAGCAAGCTTTAACCCTGTTTGCAGTCAGCACACAAACTGTGGTTCAAAGCTCCACTTTATCTCTTCTTGTGGAATTC AGATATCAGATCAGTTTAAACCTTGCGGCCGCACTAGTGCTCAAATGGGAGACAAAGAGATTAAGCTCTTATGTAAA ATTTGCTGTTTTACATAACTTTAATGAATGGACAAAGTCTTGTGCATGGGGGTGGGGGTGGGGTTAGAGGGGAACAG CTCCAGATGGCAAACATACGCAAGGGATTTAGTCAAACAACTTTTTGGCAAAGATGGTATGATTTTGTAATGGGGTA GGAACCAATGAAATGCGAGGTAAGTATGGTTAATAATCTACAGTTATTGGTTAAAGAAGTATATTAGAGCGAGTCTT TCTGCACACAGATCACCTTCCTATCAACCCCACTAGCCTCTGGCAAA(SEQ ID NO 5)在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所采用的質(zhì)粒載體是pLIVE質(zhì)粒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒的內(nèi)含子區(qū)域是質(zhì)粒的第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 ShRNAmir 轉(zhuǎn)錄單位的序列選自 SEQ ID NO :1,SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO: 4。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述同尾酶可以是)(ba I和Spe I。在一個(gè)實(shí)施方案中，申請(qǐng)人將包含構(gòu)建的 PLivE-(ShLucissmir-ShLucissmir-ShEGFPisimir-ShEGFPAZ^lir)載體的大腸桿菌 (Escherichia coli)宿主菌株于2011年8月沈日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)， 保藏號(hào)為 CGMCC No. 5181。本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案是l.pLIVE質(zhì)粒載體的改造(1)去除)(ba I、Spe I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)通過5’突出末端補(bǔ)平再自連的方法， 將pLIVE質(zhì)粒中的)(ba I (2695), Spe I (264)兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)去除。(2)在化仕011 2中引入新的Xba I和Spe I位點(diǎn)利用載體中已有的Xho 1(956) 和Cla 1(1172)位點(diǎn)，雙酶切pLIVE質(zhì)粒形成線性質(zhì)粒，同時(shí)，通過PCR的方法，擴(kuò)增Bio I 和Cla I之間的質(zhì)粒序列，并在下游引物的5’端加上)(ba I和Spe I位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物經(jīng) Xho I和Cla I雙酶切后，與線性的pLIVE質(zhì)粒相連接，即可得到在Citron 2中引入新的 Xba I 和 Spe I 位點(diǎn)的 pLIVE 質(zhì)粒(pLIVE*)。2.基于microRNA結(jié)構(gòu)的shRNAmi,干擾序列的設(shè)計(jì)通過軟件分析選擇針對(duì)靶基因的干擾序列，合成97nt的基于microRNA30結(jié)構(gòu)的干擾序列寡聚核苷酸單鏈。針對(duì)Luciferase 基因的 97nt DNA Oligo (shLucl55mir)設(shè)計(jì)如下
權(quán)利要求
1.一種基于microRNA結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞選擇性多靶點(diǎn)干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，所述質(zhì)粒載體由具有肝細(xì)胞選擇性的甲胎蛋白增強(qiáng)子/白蛋白啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)區(qū)、兩個(gè)內(nèi)含子區(qū)、多個(gè)靶基因的基于microRNA結(jié)構(gòu)的短發(fā)卡RNA轉(zhuǎn)錄單位和質(zhì)粒序列組成，所述載體的建立方法是在質(zhì)粒的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)，通過同尾酶結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，串聯(lián)多個(gè)相同或者不同的針對(duì)靶基因的shRNA*轉(zhuǎn)錄單位，因而可以同時(shí)選擇性的高效抑制肝細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述質(zhì)粒載體采用甲胎蛋白增強(qiáng)子/白蛋白啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述質(zhì)粒載體是pLIVE質(zhì)粒載體。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述質(zhì)粒的內(nèi)含子區(qū)域是質(zhì)粒的第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)域。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ShRNAmi,轉(zhuǎn)錄單位的序列是SEQID N0:1,SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3 禾口 / 或 SEQ ID NO :4。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述同尾酶可以是)(baI和Spe I。
7.質(zhì)粒載體，采用權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法所構(gòu)建。
8.權(quán)利要求7所述的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體為pLIVE-shLuC155mi,、 pLIVE-(shLucl55mir-shLucl55mir),或 pLIVE-(shLucl55mir-shLucl55mir-shEGFP131mir-shEGF P425mir)(保藏號(hào)為 CGMCC No. 5181)。
9.權(quán)利要求7或8的質(zhì)粒載體靶向肝細(xì)胞干擾靶基因的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中所述靶基因是Luciferase或EGFP報(bào)告基因。
全文摘要
本發(fā)明公開一種基于microRNA結(jié)構(gòu)的能實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞選擇性多靶點(diǎn)干擾的質(zhì)粒載體pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)的構(gòu)建方法及其功能驗(yàn)證。所述質(zhì)粒載體由具有肝細(xì)胞選擇性的甲胎蛋白增強(qiáng)子/白蛋白啟動(dòng)子(AFP enhancer/albumin promoter)、多克隆位點(diǎn)區(qū)(Multiple Cloning Sites，MCS)、兩個(gè)內(nèi)含子區(qū)(intron)、多個(gè)靶基因的基于microRNA結(jié)構(gòu)的短發(fā)卡RNA轉(zhuǎn)錄單位(microRNA30-based shRNA，shRNAmir)和質(zhì)粒序列組成。在第二個(gè)內(nèi)含子(intron 2)區(qū)域內(nèi)，通過同尾酶結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，串聯(lián)多個(gè)相同或者不同的針對(duì)熒光素酶基因(Luciferase)和綠色熒光蛋白基因(EGFP)的shRNAmir轉(zhuǎn)錄單位，同時(shí)選擇性的高效抑制肝細(xì)胞內(nèi)Luciferase和EGFP的表達(dá)。該載體及其構(gòu)建方法可以應(yīng)用于肝細(xì)胞基因的功能研究和肝臟疾病基因治療藥物的研發(fā)，同時(shí)對(duì)于其他細(xì)胞/組織特異性干擾載體的構(gòu)建具有重要的借鑒和參考價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102433352SQ201110363118
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者孫汭, 田志剛, 耿建林, 魏海明 申請(qǐng)人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)