專利名稱：一種促進(jìn)水稻秧苗素質(zhì)的假單胞菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種假單胞菌屬的菌株，特別是涉及一種利用微生物篩選技術(shù)，從蘆葦根際土壤分離獲得的具有提高水稻秧苗素質(zhì)的假單胞菌菌株。
背景技術(shù)：
良好的水稻秧苗素質(zhì)有利于提高插秧質(zhì)量、增加水稻產(chǎn)量。目前，我國大多地區(qū)采取使用化水稻育秧劑(或壯秧劑)增強(qiáng)水稻秧苗質(zhì)量。即便如此，一些地區(qū)水稻秧苗，特別是機(jī)插秧和手拋秧苗仍出現(xiàn)幼苗黃化、秧苗不發(fā)棵、長勢弱、甚至根部腐爛等現(xiàn)象，一旦遇到低溫、干旱、寡照或多雨等環(huán)境，上述現(xiàn)象尤為嚴(yán)重。針對這些問題，人們先后采取了適當(dāng)降低播種量、使用農(nóng)藥(多效唑等)防止徒長、藍(lán)色膜育秧等方法，其結(jié)果要不效率偏低， 要不成本偏高。目前我國已有的一些水稻育秧專用微生物肥料的主要用途，是緩解水稻苗期常見的病害，如青枯、立枯、惡苗等，對一些物理性傷害，如低溫、多雨、干旱等并無緩解作用，或目前尚未報(bào)道。然而，育秧時(shí)節(jié)的天氣變化和土壤病害狀況都可能對秧苗素質(zhì)產(chǎn)生重大影響。因此，篩選能高效促進(jìn)水稻秧苗素質(zhì)的PGPR菌株，應(yīng)對生物和非生物因素干擾，對穩(wěn)定/提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對水稻育秧微生物肥料存在的缺陷，應(yīng)用篩選技術(shù)，從根際土壤獲得1 株能促進(jìn)水稻秧苗素質(zhì)，提高水稻對生物/非生物因素干擾能力的PGPR菌株，并已在水稻育秧相關(guān)試驗(yàn)中獲得成功。本發(fā)明提供的菌株為惡臭假單胞菌(作洲而膨/？浙putida) RBPl (以下簡稱為 RBPl菌株)，是從我國江蘇省大豐麋鹿自然保護(hù)區(qū)蘆葦根際土壤中分離、篩選出的，其已于 2011年8月31日在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏管理中心”保藏，保藏編號為CGMCC No. 5205。本發(fā)明所述的RBPl菌株具有下述性質(zhì) A、形態(tài)特征
在肉湯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后，用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡進(jìn)行觀察，RBPl桿狀， 長度3、微米，寬度為0. 5^0. 6微米，革蘭氏陰性，不產(chǎn)芽孢，以極生鞭毛運(yùn)動。B、培養(yǎng)特征
在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上菌落乳白，半透明，表面光滑有光澤，邊緣整齊。C、菌株生理生化特性
RBPl菌株在7%氯化鈉培養(yǎng)基上可緩慢生長，接觸酶反應(yīng)陽性，能液化明膠，產(chǎn)硫化氫， V-P>甲基紅反應(yīng)陰性，不能水解淀粉，能水解尿素，分解精氨酸，0/F試驗(yàn)為氧化型，不能還原硝酸。D、菌株16S rRNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示。E、菌株鑒定結(jié)果通過形態(tài)特征、理化特性，結(jié)合16S rRNA基因序列結(jié)果，將該菌株鑒定為惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida\用該菌株浸種1(Γ20分鐘晾干，或用菌液噴施苗盤土壤潤濕表面即可，具有用量省、見效快、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，所培育出的秧苗最典型的特征是秧苗“矮壯”，體現(xiàn)在秧齡 18-20天，葉齡3-4葉，苗基部莖寬大于2. 5毫米，每棵秧苗白根數(shù)多于15條，盤根良好，呈 “毯狀”，秧苗高度12厘米左右，秧苗均勻整齊，高度一致?？晒?jié)約609Γ100%苗期農(nóng)化用品投入量，此外對水稻一些常見病害具有一定的生防效果。


圖1為RBPl菌株在水稻育秧中的促生效果，圖中左側(cè)為對照，右側(cè)為添加RBPl處理；
圖2為RBPl菌株電鏡形態(tài)(23 000Χ )。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :RBP1菌株的篩選方法
采集揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田小麥根及其附著土壤2 mm區(qū)域)，置于冰盒(溫度約 4°C )，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。取植物根部，用無菌dH20輕柔沖洗，以去除外圍土壤，切成長約3 cm小段(利于內(nèi)生細(xì)菌釋放)，各稱取約1 g根段加入200 mL無菌dH20,150 r/min混合30 min，梯度稀釋后，分別吸取20 μ L菌液涂布于3種篩選培養(yǎng)基Jensen’ s培養(yǎng)基、King’ s B培養(yǎng)基，和NA (nutrient agar)培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)72 h，挑取共計(jì)98株形態(tài)各異的細(xì)菌， 分別編號，按照溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)IAA、產(chǎn)嗜鐵素、抗生素等指標(biāo)進(jìn)行PGPR菌株的進(jìn)一步篩選，最終獲得1株高效促生能力的RBPl菌株。RBPl菌株于2011年8月31日送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 5205 ；分類命名為惡臭假單胞菌G^ei/i/offloftas putida、M 藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。實(shí)施例2 =RBPl促生及生防指標(biāo)測定 A、生長素(IAA)測定
細(xì)菌在特定液體培養(yǎng)基中(添加0.5 g/L L-色氨酸，約2. 5 mM)生長48 h，取培養(yǎng)液 2 mL, 10000 r/min 離心 15 min,每 1 ml 上清液加 2 mL Salkowski 試劑(每升 10. 8 M H2SO4含4. 5 g !^eCl3),室溫暗處顯色30 min后，于530 nm處測光密度值。以空白培養(yǎng)基作對照，并以純IAA對應(yīng)的光密度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IAA產(chǎn)出量(mg/L)。標(biāo)準(zhǔn)曲線配1 g/L IAA母液100 mL，分別吸取0、1、2、3、4、5 ml定容至50 mL，即得到0、60、120、180、M0、300 mg/L的系列IAA溶液。再在上述溶液中，分別吸取1 mL加入 2 mL顯色劑，即得到0、2、40、60、80、100 mg/L的系列IAA溶液。結(jié)果顯示，RBPl產(chǎn)IAA能力為 4. 85 mg/L οB、產(chǎn) NH3 鑒定
將菌株轉(zhuǎn)接到含10 ml蛋白胨水(10 g/L)試管中，28°C培養(yǎng)48-72 h，每管加入0.5 mL Nessler' s試劑，顏色由褐色轉(zhuǎn)為黃色的表明有NH3產(chǎn)生。結(jié)果表明，RBPl有很強(qiáng)的產(chǎn)氨能力。
C、產(chǎn) HCN 鑒定
在NB培養(yǎng)基中添加4. 4 g/L甘氨酸，將細(xì)菌劃線接種于該平板上，另將浸過洲碳酸鈉、 0. 5%苦味酸溶液(2，4，6-三硝基苯酚)whatman 1號濾紙置于培養(yǎng)基上，密封，28°C培養(yǎng)4 d，濾紙顏色由橘黃色轉(zhuǎn)為紅色的說明有HCN產(chǎn)生。結(jié)果表明，RBPl有一定的產(chǎn)HCN能力。D、溶磷能力測定
在培養(yǎng)基中添加 Cei3 (PO4) 2J8°C，170 r/min 培養(yǎng) 5 d，10000 r/min 離心 30 min，鉬銻抗比色法定量測定溶解磷含量。結(jié)果表明，RBPl的溶磷量為106.75 mg P/L。實(shí)施例3 =RBPl對水稻塑盤旱育秧苗素質(zhì)的影響
將消毒過的水稻種子在IO8 cfu/mL RBPl細(xì)胞液內(nèi)浸泡20 min，于無菌操作臺上風(fēng)干后，備播種用。在434孔規(guī)格的塑盤旱育拋秧盤中，每盤均勻撒播45 g種子，用細(xì)土覆土 2 cm，噴灑自來水使苗盤濕潤，覆膜。齊苗后，在第一葉完全抽出1.0 cm左右時(shí)揭膜。早晚時(shí)分灑水補(bǔ)濕。20 d后，取出秧盤，測量莖長、莖基粗等；自來水下沖洗洗凈后，將莖葉和根部分離，置于烘箱80°C烘8 h左右至恒重，分別稱重。試驗(yàn)中，RBPl處理的莖高比對照減少 6. 17%，莖基粗對照增粗26. 32%，差異均達(dá)顯著水平；RBPl處理的地上部和地下部干重分別比對照增重17. 72%禾口 50. 60% (如圖1)。實(shí)施例4 菌株的鑒定
A、形態(tài)及培養(yǎng)特征接種RBPl菌株于營養(yǎng)肉湯瓊脂上培養(yǎng)2、天后，觀察菌落形狀及菌體顏色，并用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡進(jìn)行常規(guī)菌體形態(tài)的觀察(圖2)。B、生理生化實(shí)驗(yàn)參照《Bergey’ s Manual of Systematic Bacteriology》的內(nèi)容對菌株進(jìn)行生理生化鑒定。C、16S rRNA基因序列分析按反復(fù)凍融法提取細(xì)菌基因組DNA。以總DNA為模板，利用特異引物27F/1492R (引物參見SEQ ID NO. 2和3)擴(kuò)增16S rRNA基因近乎全長片段。50 μ L 的反應(yīng)體系中含有 IXPCR Buffer (含 MgCl2)，200 μ mol/L 的 dNTPs，0. 2 μ mol/L的引物，IXTaq DNA聚合酶(Takara，大連寶生物)和1 μ L的模板。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4° C預(yù)變性5min;94° C變性45 s，64° C退火lmin，72° C延伸90 s，20個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)退火溫度降低0.5° C;72° C延伸20 min。PCR產(chǎn)物送上海生工測序。根據(jù)獲得16S rDNA序列，在GenBank中Blast搜索同源序列。
權(quán)利要求
1. 一種促進(jìn)水稻秧苗素質(zhì)的假單胞菌菌株，是惡臭假單胞菌(作^/而 /^^ putida) RBPl，保藏編號為 CGMCC No. 5205。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種假單胞菌屬的菌株，是惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)RBP1，保藏編號為CGMCCNo.5205。用該菌株浸種10~20分鐘晾干，或用菌液噴施苗盤土壤潤濕表面即可，具有用量省、見效快、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，所培育出的秧苗最典型的特征是秧苗“矮壯”，體現(xiàn)在秧齡18-20天，葉齡3-4葉，苗基部莖寬大于2.5毫米，每棵秧苗白根數(shù)多于15條，盤根良好，呈“毯狀”，秧苗高度12厘米左右，秧苗均勻整齊，高度一致。可節(jié)約60%~100%苗期農(nóng)化用品投入量，此外對水稻一些常見病害具有一定的生防效果。
文檔編號C12N1/20GK102443554SQ20111035114
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者康貽軍, 殷仕學(xué), 程潔, 高君君 申請人:揚(yáng)州大學(xué)