專利名稱：腸炎沙門氏菌的鏈置換恒溫擴(kuò)增(sda)快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物檢測領(lǐng)域，具體涉及恒溫擴(kuò)增快速檢測腸炎沙門氏菌的試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
1885年沙門氏等在霍亂流行時分離到豬霍亂沙門氏菌，故定名為沙門氏菌屬。 沙門氏菌屬有的專對人類致病，有的只對動物致病，也有對人和動物都致病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，其中腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)是重要致病的沙門氏菌之一。我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種腸炎沙門氏菌的恒溫擴(kuò)增快速檢測試劑盒及其使用方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種腸炎沙門氏菌的快速檢測方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，從而為食品安全提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用?；谏鲜鲈恚景l(fā)明提供的腸炎沙門氏菌的恒溫擴(kuò)增快速檢測試劑盒，包括(1)模板預(yù)處理反應(yīng)液IXNEB buffer 2、1. 0 μ M上游內(nèi)引物Sl、l. 0 μ M下游內(nèi)引物S2、3% (V/V) 二甲基亞砜、和ddH20。所述IXNEB buffer 2 為50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2、ImM 二硫蘇糖醇，和 ddH20，pH 7. 9。所述的引物Sl和S2分別如SEQ ID NO :1和2所示。(2)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液I :3% (V/V) 二甲基亞砜，0. lmg/mL牛血清白蛋白，濃度分別為 0. 2mM dATP、dGTP 和 dTTP 的混合液，1. OmM dCTP α S, IXNEB buffer 2，和 ddH20
(3) Bst DNA 聚合酶；(4)限制性內(nèi)切酶BsoBI。使用上述試劑盒檢測腸炎沙門氏菌的方法，包括步驟(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取DNA，其中提取的DNA 0D26(1/0D28(1在1. 6-2. 0范圍內(nèi)，濃度在IO-IOOng/μ L范圍內(nèi)。(2)模板預(yù)處理程序取模板預(yù)處理反應(yīng)液23 μ L，加入待檢樣品DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 過程反復(fù)進(jìn)行6個以上循環(huán)； 產(chǎn)物用作SDA擴(kuò)增模板。
3
(3) SDA擴(kuò)增將上述預(yù)處理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液I 中，95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然后加入0.4yL Bst DNA聚合酶與0.4yL BsoBI，置于59°C水浴反應(yīng)Ih。(4)核酸凝膠電泳檢測反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測；電泳板上出現(xiàn)IOObp的核酸擴(kuò)增條帶，說明待檢樣品為陽性，否則為陰性。本發(fā)明的試劑盒根據(jù)目標(biāo)菌株的保守基因序列設(shè)計(jì)引物，保證檢測方法的特異性。本發(fā)明采用改進(jìn)的鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(SDA)技術(shù)，特異性強(qiáng)，具有與PCR檢測方法相似靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，檢測方法簡單、快速，特別適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)及食品公司與相關(guān)檢測部門。


圖1 其中，1檢測樣品2腸炎沙門氏菌陽性對照3 DNA Marker 4陰性對照
具體實(shí)施例方式SDA(Strand displacement amplification)反應(yīng)是一種恒溫、酶控的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，主要依據(jù)限制性內(nèi)切酶識別并切割半硫代磷酸化DNA的未修飾鏈以形成一個切口，在具有鏈置換能力的DNA聚合酶的作用下從切口處聚合延伸并取代下游DNA鏈。被置換下的單鏈DNA再與引物結(jié)合并由DNA聚合酶延伸成雙鏈DNA。這種“切口一擴(kuò)增一置換” 不斷循環(huán)往復(fù)達(dá)到靶序列高效擴(kuò)增的目的?；谏鲜鲈?，本發(fā)明提供的腸炎沙門氏菌的恒溫擴(kuò)增快速檢測試劑盒，包括(1)模板預(yù)處理反應(yīng)液(所列組分均為在模板預(yù)處理反應(yīng)液中的終濃度)包括 IXNEB buffer 2，1.0μΜ 上游內(nèi)引物(Si)、1. 0 μ M 下游內(nèi)引物(S2)、體積比 3% DMSO(二甲基亞砜)、ddH20。所述IXNEB buffer 2 反應(yīng)緩沖液成分為50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2UmM Dithiothreitol ( 二硫蘇糖醇)，ddH20，ρΗ 7. 9。腸炎沙門氏菌引物Sl 5，-CAGCCTGACACCAGACAA- CrCGGG-CATGTCTGAGCACTTC _3，(SEQ IDNO 1)S2 5，-ACCGCATCGAATGCATGT- CrCGGG-TATGCTGGACCAACTG _3，(SEQ IDNO 2)(注其中黑體部分為與腸炎沙門氏菌irwA基因片段匹配的序列)(2)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液I 體積比3. 0 % DMSO, 0. lmg/mL BSA (牛血清白蛋白)，濃度分別為0. 2mM dATP, dGTP和dTTP混合液，1. OmM dCTP α S (購自BIOLOG公司(德國)、 2’ -deoxyeytidine-5' -0-(1-thiotriphosphate))，1XNEB buffer 2，ddH20o(3) Bst DNA Polymerase (鏈延伸 DNA 聚合酶，購自 NewEnglandBiolabsLTD、 8000U/mL)(4)BsoBI (限制性內(nèi)切酶 BsoBI，購自 NewEnglandBiolabsLTD、10000U/mL)使用上述試劑盒檢測腸炎沙門氏菌的方法，包括步驟
(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取DNA，其中提取的DNA OD260/OD280在1. 6-2. 0范圍內(nèi)，濃度在IO-IOOng/ μ L范圍內(nèi)。(2)模板預(yù)處理程序取模板預(yù)處理反應(yīng)液23 μ L，加入待檢樣品DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 過程反復(fù)進(jìn)行6個以上循環(huán)； 產(chǎn)物用作SDA模板。(3) SDA擴(kuò)增將上述預(yù)處理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液 I中，95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然后加入0. 4yL Bst DNA Polymerase與 0. 4yL BsoBI，置于59 °C水浴反應(yīng)Ih。(4)核酸凝膠電泳檢測反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)管中加入6XLoading buffer (組分30mM EDTA ；36% (ν/ν) Glycerol ；0. 05% (w/v)Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v)Bromophenol Blue),自然冷卻至室溫，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，電泳40分鐘，電泳成像系統(tǒng)拍照。電泳板上出現(xiàn)IOObp的核酸擴(kuò)增條帶，說明待檢樣品為陽性，否則為陰性。下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作為本發(fā)明的限制。實(shí)施例(腸炎沙門氏菌的檢測)(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1. 6-2. O范圍內(nèi)，濃度在 IO-IOOng/μ L 范圍內(nèi)。(2)模板預(yù)處理程序取模板預(yù)處理反應(yīng)液23 μ L，加入待檢樣品DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 過程反復(fù)進(jìn)行6個以上循環(huán)； 產(chǎn)物用作SDA模板。取2份23 μ L的模板預(yù)處理反應(yīng)液，分別加入2 μ L ddH20和腸炎沙門氏菌DNA，重復(fù)上述步驟，產(chǎn)物用作SDA模板，作為陰性對照和陽性對照；(3) SDA擴(kuò)增將上述預(yù)處理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液 I中，95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然后加入0. 4yL Bst DNA Polymerase與 0. 4yL BsoBI，置于59 °C水浴反應(yīng)Ih。(4)核酸凝膠電泳檢測反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)管中加入6XL0ading buffer，自然冷卻至室溫，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，電泳40分鐘，電泳成像系統(tǒng)拍照。結(jié)果如圖1所示。說明此檢測方法特異性強(qiáng)，快速可靠，具有簡單快速的特點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種腸炎沙門氏菌的恒溫擴(kuò)增快速檢測試劑盒，其特征在于包括(1)模板預(yù)處理反應(yīng)液1XNEBbuffer 2、1. 0 μ M上游內(nèi)引物Sl、l. 0 μ M下游內(nèi)引物 S2,3% (V/V) 二甲基亞砜、和 ddH20 ；所述 IXNEB buffer2 為50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2、ImM 二硫蘇糖醇，和 ddH20, pH 7. 9 ；所述的引物Sl和S2分別如SEQ ID NO :1和2所示；(2)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液I:3% (V/V) 二甲基亞砜，0. lmg/mL牛血清白蛋白，濃度分別為 0. 2mM dATP、dGTP 和 dTTP 的混合液，1. OmM dCTP α S, IXNEB buffer 2，和 ddH20。(3)Bst DNA 聚合酶；(4)限制性內(nèi)切酶BsoBI。
2.使用如權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測腸炎沙門氏菌的方法，其特征在于包括步驟(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取DNA，其中提取的DNA 0D26Q/0D28Q在1.6-2. 0范圍內(nèi)，濃度在IO-IOOng/μ L范圍內(nèi)；(2)模板預(yù)處理程序取模板預(yù)處理反應(yīng)液23 μ L，加入待檢樣品DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入 59°C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 過程反復(fù)進(jìn)行6個以上循環(huán)；產(chǎn)物用作SDA擴(kuò)增模板；(3)SDA擴(kuò)增將上述預(yù)處理的25μ L模板溶液加入Μ.2μ L鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液I中， 95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然后加入0.4yL Bst DNA聚合酶與0.4yL BsoBI，置于59°C水浴反應(yīng)Ih ；(4)核酸凝膠電泳檢測反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測；電泳板上出現(xiàn)IOObp的核酸擴(kuò)增條帶，說明待檢樣品為陽性，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用依賴于鏈置換擴(kuò)增技術(shù)的腸炎沙門氏菌恒溫擴(kuò)增快速檢測試劑盒及其檢測方法。該試劑盒內(nèi)有模板預(yù)處理反應(yīng)液、鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液Ⅰ、Bst DNA Polymerase，BsoBI。檢測腸炎沙門氏菌的方法包括細(xì)菌DNA的提取、模板預(yù)處理、SDA鏈置換恒溫擴(kuò)增、核酸檢測。其優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且成本低。
文檔編號C12Q1/68GK102382884SQ20111034510
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者宋濤, 尼秀媚, 張京宣, 張健, 彭青, 李偉濤, 李美芹, 畢建秀, 雷質(zhì)文, 魏曉棠 申請人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心