一種基于無(wú)偏識(shí)別與恒溫?cái)U(kuò)增的小rna檢測(cè)試劑盒及定量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于小RNA檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于無(wú)偏識(shí)別與恒溫?cái)U(kuò)增的小 RNA檢測(cè)試劑盒及定量方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小RNA是一類(lèi)廣泛存在于真核生物中的細(xì)胞內(nèi)源性非蛋白編碼RNA分子，其長(zhǎng)度 約為20-30個(gè)堿基，主要包括小干擾RNAs (siRNAs)，微RNA (miRNA)和與piwi相互作用的 RNA(piRNA)。小RNA通過(guò)與特定的Argonaute家族蛋白（AGO蛋白）結(jié)合，指導(dǎo)AGO接近其 標(biāo)靶分子（DNA或RNA)，通過(guò)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物特異性的降低目標(biāo)基因的表達(dá)。小RNA 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、增殖和凋亡等生命過(guò)程，影響著幾乎所有的信號(hào)通路，參與 各種生理病理過(guò)程，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)水平與人類(lèi)疾病特別是腫瘤的發(fā)生和 發(fā)展密切相關(guān)，可以作為標(biāo)志物用于一些癌癥的早期診斷。因此，對(duì)定量檢測(cè)組織、血液或 細(xì)胞樣本中小RNA方法及試劑盒的深入研宄將有助于人們進(jìn)一步了解小RNA與腫瘤發(fā)生、 發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制，對(duì)腫瘤的早期診斷以及治療具有重要的意義。
[0003] Northern blotting技術(shù)是小RNA檢測(cè)的經(jīng)典方法及試劑盒，一直被用于小RNA 的鑒定和發(fā)現(xiàn)等方面。該方法及試劑盒通過(guò)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳對(duì)小RNA樣品按大小 與分子量進(jìn)行分離，然后將小RNA轉(zhuǎn)移并固定至硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，再與標(biāo)記好 的寡核苷酸探針雜交，洗膜后將非特異性結(jié)合的探針洗掉，最后經(jīng)過(guò)顯影獲得信號(hào)。雖然該 技術(shù)被認(rèn)為是小RNA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法及試劑盒，但其靈敏度、特異性不高，操作步驟多且復(fù) 雜，耗時(shí)長(zhǎng)（數(shù)天），對(duì)環(huán)境要求很高。
[0004] 相較于Northern blotting技術(shù)，微陣列芯片技術(shù)（Microarray)可以同時(shí)對(duì)多 種目標(biāo)物進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)了小RNA的高通量檢測(cè)。Microarray是利用分子雜交原理，通過(guò) 儀器把已知序列的DNA探針固定在玻璃片或者尼龍膜上形成陣列，然后加入多種待測(cè)的小 RNA與DNA探針進(jìn)行雜交固定，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后獲得不同小RNA的 分析譜。然而，微陣列芯片技術(shù)制作成本高昂，靈敏度和重復(fù)性較差，選擇性遠(yuǎn)不能讓人滿(mǎn) O
[0005] 為了提高靈敏度和特異性，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)已被應(yīng)用于小RNA 的分析。然而，由于成熟小RNA分子長(zhǎng)度較短，僅相當(dāng)于PCR引物的長(zhǎng)度，無(wú)法直接用PCR 技術(shù)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。另外，雖然RT-PCR具有較好的分析靈敏度和特異性，但是其依賴(lài)于熱循環(huán) 擴(kuò)增反應(yīng)，需要大型反應(yīng)儀器（PCR儀），同時(shí)要設(shè)計(jì)復(fù)雜的多種引物，極大地限制了它們的 廣泛應(yīng)用。
[0006] 為了簡(jiǎn)化反應(yīng)條件和設(shè)計(jì)，同時(shí)又保持高靈敏度和選擇性，研宄者們相繼發(fā)展了 多種基于核酸恒溫信號(hào)放大的小RNA檢測(cè)方法及試劑盒。但是，近年來(lái)的研宄表明，多種小 RNA都存在3'末端甲基化，以使其免受細(xì)胞中多種核酸外切酶、連接酶、末端轉(zhuǎn)移酶、聚合 酶等可作用于核酸3'末端羥基的酶攻擊，從而保護(hù)小RNA的穩(wěn)定。這些小RNA的3'末端 甲基化盡管沒(méi)有改變核苷酸序列，卻給現(xiàn)有的基于酶外切、酶聚合以及酶連接的檢測(cè)技術(shù) 帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)，這些酶反應(yīng)都需要與小分子RNA的3'末端發(fā)生作用，而3'末端的甲基 化會(huì)影響酶的識(shí)別能力，抑制酶反應(yīng)的效率，最終導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，發(fā)展一種簡(jiǎn) 單、通用、快速、高靈敏、高選擇性的小RNA檢測(cè)方法及試劑盒依舊是一個(gè)挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種基于無(wú)偏識(shí)別與 恒溫?cái)U(kuò)增的小RNA檢測(cè)試劑盒及定量方法，該試劑盒體系簡(jiǎn)單，使用方便，可實(shí)現(xiàn)高效、快 速的酶協(xié)同級(jí)聯(lián)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，靈敏度高。
[0008] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明公開(kāi)了一種基于無(wú)偏識(shí)別與恒溫?cái)U(kuò)增的小RNA檢測(cè)試劑盒，包括：
[0010] 與目標(biāo)小RNA形成三元雜交結(jié)構(gòu)的組合物，包括3-WJ引物和3-WJ模板；
[0011] 其中，3-WJ引物由兩部分序列組成，其5'端部分與目標(biāo)小RNA 3'端部分互補(bǔ)，3' 端部分與3-WJ模板的中間段互補(bǔ)；3-WJ模板由三部分序列組成：其3'端部分與目標(biāo)小RNA 5'端部分互補(bǔ)，中間段與3-WJ引物3'端部分互補(bǔ)，其5'端部分為含兩個(gè)核酸切口酶識(shí)別 位點(diǎn)的鏈置換擴(kuò)增（SDA)模板區(qū)域，其中一個(gè)酶切位點(diǎn)經(jīng)過(guò)硫代修飾；
[0012] 擴(kuò)增底物，包括dNTPs混合物；
[0013] 工具酶，包括具有鏈置換擴(kuò)增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶，用于三元雜交結(jié) 構(gòu)形成所觸發(fā)SDA反應(yīng)的引物聚合延伸以及酶切級(jí)聯(lián)放大，產(chǎn)生帶有內(nèi)切酶位點(diǎn)的SDA產(chǎn) 物；
[0014] 帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)探針，其兩端分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，分子信 標(biāo)探針具有能夠與SDA產(chǎn)物相互補(bǔ)的序列；
[0015] 以及擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液。
[0016] 小 RNA 檢測(cè)試劑盒中包括：10nM 3-WJ 引物，10nM 3-WJ 模板，250uM dNTPs，250nM 分子信標(biāo)探針，0.5U DNA聚合酶（Klenow Fragment excT，KF〇,2. 5U核酸切口酶（財(cái). BbvCI),50mM KAc,10mM Tris-HAc,10mM Mg(Ac)2,lmM DTT ；
[0017] 與SDA產(chǎn)物互補(bǔ)的分子信標(biāo)探針序列中含有核酸切口酶Nt. BbvCI的酶切位點(diǎn)。
[0018] 3-WJ引物與3-WJ模板的摩爾比為1:1 ;且3-WJ引物與3-WJ模板有6個(gè)堿基的互 補(bǔ)。
[0019] 3-WJ引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；含有酶切位點(diǎn)的硫代修飾的3-WJ 模板的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 2所示；
[0020] 分子信標(biāo)探針的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示；其兩端分別標(biāo)記有熒光基團(tuán) FAM和淬滅基團(tuán)DABCYL。
[0021] 本發(fā)明公開(kāi)了一種基于無(wú)偏識(shí)別與恒溫?cái)U(kuò)增的小RNA定量方法，包括以下步驟：
[0022] 1)提取獲得待測(cè)目標(biāo)小RNA ;
[0023] 2)通過(guò)核酸互補(bǔ)雜交，目標(biāo)小RNA特異性識(shí)別3-WJ引物、3-WJ模板并形成穩(wěn)定的 三元雜交結(jié)構(gòu)；
[0024] 3)將三元雜交結(jié)構(gòu)與擴(kuò)增底物、工具酶、分子信標(biāo)探針以及擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液混合， 三元雜交結(jié)構(gòu)中的三元引物沿著硫代修飾的三元模板起始鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)并產(chǎn)生大量帶 有酶切位點(diǎn)的單鏈SDA產(chǎn)物；
[0025] 4)擴(kuò)增獲得的SDA產(chǎn)物觸發(fā)打開(kāi)分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，恢復(fù)焚光；分子信標(biāo)與SDA 產(chǎn)物形成的雙鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)中含有核酸切口酶識(shí)別位點(diǎn)，在形成雙鏈結(jié)構(gòu)后該位點(diǎn)被識(shí)別， 并在分子信標(biāo)序列上進(jìn)行切割；被切割的分子信標(biāo)從雙鏈結(jié)構(gòu)上脫落產(chǎn)生熒光信號(hào)，SDA 產(chǎn)物與新的分子信標(biāo)形成雜交雙鏈，以產(chǎn)生更多的熒光信號(hào)；
[0026] 5)待達(dá)到規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間后，檢測(cè)熒光信號(hào)，對(duì)熒光信號(hào)分析，得到待測(cè)溶液中小 RNA的含量。
[0027] 在3-WJ模板的SDA模板區(qū)域中含有兩個(gè)Nt. BbvCI的識(shí)別位點(diǎn)，包括硫代修飾不 被切割的單鏈序列5' -CCTCAGC-3'和可被切口酶識(shí)別并切割的5' -GCTGAGG-3' ；
[0028] 靠近模板3'端的位點(diǎn)在SDA生成雙鏈的過(guò)程中被Nt. BbvCI識(shí)別，在聚合產(chǎn)物位 點(diǎn)處切割實(shí)現(xiàn)SDA ;
[0029] 靠近模板5'端的位點(diǎn)被硫代修飾，阻斷第二次Nt. BbvCI酶切，在產(chǎn)生大量帶有酶 切位點(diǎn)的SDA產(chǎn)物的同時(shí)模板不被酶切。
[0030] 步驟3)所述的擴(kuò)增反應(yīng)中溫度為37°C，反應(yīng)時(shí)間為45分鐘。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0032] 1.本發(fā)明提供的基于無(wú)偏識(shí)別與恒溫?cái)U(kuò)增的小RNA檢測(cè)試劑盒，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，一步 操作即可完成，無(wú)需增加體系復(fù)雜性即可實(shí)現(xiàn)高效、快速的酶協(xié)同級(jí)聯(lián)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng) 快速，只需要30分鐘，可以提高靈敏度到600fM ;
[0033] 2.本發(fā)明提供的基于無(wú)偏識(shí)別與恒溫?cái)U(kuò)增的小RNA檢測(cè)試劑盒，具有很好的通用 性，巧妙的回避了核酸外切酶、連接酶、聚合酶等工具酶對(duì)核酸3'末端羥基的偏好性導(dǎo)致檢 測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。可適用于各種修飾的小RNA序列，如3'末端2-0-甲基化修飾。并且只需 改變?nèi)结樀男蛄卸鵁o(wú)需改變發(fā)卡探針及分子信標(biāo)即可檢測(cè)其他序列的小RNA，方便、價(jià) 廉。尤其是還能檢測(cè)到植物樣本中小RNA的表達(dá)水平，結(jié)果與商品化小RNA試劑