專利名稱：一種桑黃菌絲體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體說就是一種桑黃菌絲體的制備方法。
背景技術(shù)：
桑黃屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotas)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目 (Aphyllophorales)、 秀革孑 L 菌禾斗(Hymenochae taceae)、針層孑 L 菌屬(Phellinus Quel·)。 學(xué)名WieIlinus baummi,中文名鮑姆層孔菌，因其子實(shí)體顏色鮮黃而俗稱為桑黃，又稱桑耳，是多年生的珍稀藥用真菌。桑黃是目前國際公認(rèn)的抗腫瘤最好的大型真菌之一，無任何毒性作用，是一種極具開發(fā)價(jià)值的珍貴藥用真菌，成為藥用真菌的研究熱點(diǎn)。對(duì)于桑黃總RNA的高質(zhì)量提取，是深入研究桑黃抗癌功效分子機(jī)制的基礎(chǔ)，但目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)此內(nèi)容研究較少。在現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)和文獻(xiàn)報(bào)道中，常用提取某種絲狀真菌總RNA的方法是將絲狀真菌進(jìn)行液體培養(yǎng)并收集菌絲體，然后液氮研磨，提取總RNA。所以要想獲得高質(zhì)量總RNA關(guān)鍵是如何獲得高質(zhì)量的菌絲體。關(guān)于絲狀真菌菌絲體的液體培養(yǎng)，目前培養(yǎng)方法主要是從原種斜面上切取豆粒大小的一塊菌餅接種入新配制并滅菌的液體培養(yǎng)基中，置于搖床中在合適的溫度下振蕩培養(yǎng)。通過此種方法培養(yǎng)后收集得到的菌絲體，由于附帶固體培養(yǎng)基，所以導(dǎo)致提取的總RNA濃度不高，直接影響后續(xù)的深入研究。因此，需要尋求一種更合適的獲得桑黃菌絲體的方法以獲取高質(zhì)量總RNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種桑黃菌絲體的制備方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的步驟如下步驟一桑黃菌種活化將保存在冰箱里的桑黃菌種用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面活化，首先將從 4°C冰箱里拿出來的桑黃菌種在室溫下放置一段時(shí)間，達(dá)到與室溫一致即可，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面接種，每個(gè)試管斜面只接一個(gè)點(diǎn)，蓋上膠塞， 放置在25°C溫箱里恒溫避光培養(yǎng)5-7天；步驟二 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)將已活化的桑黃菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，在超凈工作臺(tái)內(nèi)， 用接種鉤挑取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面上邊緣生長旺盛的桑黃菌絲體，接于平板中間，每個(gè)平板只接一個(gè)點(diǎn)，用封口膜封上置于25°C溫箱里恒溫避光培養(yǎng)7-9天；步驟三刮取桑黃菌絲體接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)將要長滿平板的年輕桑黃菌絲體進(jìn)行刮取并接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中， 首先，要選擇幾乎長滿平板但還沒有老化變黃的桑黃菌絲體作為接種材料，因?yàn)檫@樣的菌絲體更易于刮??；用滅過菌的小鑰匙進(jìn)行刮取，刮的時(shí)候不要太用力，只刮取桑黃菌絲體， 不要連帶培養(yǎng)基，刮取下來的桑黃菌絲體在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基里以涮的方式進(jìn)行接種，接入250ml三角瓶中，每瓶接入1-2個(gè)平板的桑黃菌絲體；封瓶膜封口后，置于恒溫振蕩頁
器120r/min，25°C恒溫避光振蕩培養(yǎng)5-7天；步驟四收集桑黃菌絲體在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基尚未變色之前進(jìn)行桑黃菌絲體收集，將三角瓶里的桑黃菌絲體，進(jìn)行10層紗布過濾，用無菌蒸餾水沖洗桑黃菌絲體2-3遍，沖掉殘留的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，帶上一次性手套將紗布擰干，擰到桑黃菌絲體在紗布上略微粘起的程度即可，用滅過菌的鑷子將桑黃菌絲體從紗布上小塊地撕取下來，放入2mL的離心管中，不要放得太實(shí)，裝入量為離心管的1/3即可，置于_70°C保存，備用；步驟五提取桑黃菌絲體總RNA將步驟四中在-70°C里2mL離心管中保藏的桑黃菌絲體取出，置于用液氮冷卻過的研缽里充分研磨至粉狀，迅速分裝到盛有1. OmLTrizol試劑的1. 5mL無菌離心管中；用振蕩器振蕩3-5min，放回冰盒；加200 μ L氯仿，振蕩5min再放回冰盒靜置3_5min ；離心， 12000rpm, 15min ；取新的1. 5mL無菌離心管加600 μ L氯仿，將離心后的上清液加進(jìn)來，振蕩3-5min，保證液體能懸浮起來，靜置Imin ；離心，12000rpm，IOmin ；取新的1. 5mL無菌離心管加500 μ L異丙醇，將離心后的上清液加進(jìn)來，振蕩lmin，混勻；放冰上，靜置IOminjX 淀，離心12000rpm，IOmin ；去除上清液，留沉淀，加200 μ L的DEPC水溶解沉淀，用等體積的氯仿抽提2次，離心，12000rpm, 5min,每次離心后取上清液，第二次離心后得到的上清液即為我們所需的桑黃總RNA樣品；電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果；剩下的桑黃總RNA 樣品加入4倍體積的無水乙醇，再滴加幾滴3mol/L的乙酸鈉溶液，混勻，冰上靜置lOmin， 12000rpm，離心 lOmin，放于 _70°C保存。步驟六瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果稱取1. 6g瓊脂糖于小三角瓶中，加入20mL的1XTAE，微波爐中加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻；當(dāng)溫度降到50度左右時(shí)向小三角瓶中加入IyL的溴化乙錠，振蕩混勻；趁熱倒入洗凈的制膠槽中，形成模子，將制膠槽置于水平位置并固定放好梳子，室溫下靜置直至凝膠完全凝固，即得到瓊脂糖凝膠，垂直輕拔梳子，將瓊脂糖凝膠及內(nèi)槽放于電泳槽中，備用。在點(diǎn)樣板上，將3 μ L步驟五中的桑黃總RNA樣品與2 μ L的上樣緩沖液混合均勻， 用10 μ L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)桑黃總RNA樣品，應(yīng)更換一個(gè)新槍頭，以防污染，加樣時(shí)，勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓80-100V，樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動(dòng)，當(dāng)上樣緩沖液中的溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約Icm時(shí)，停止電泳。電泳完畢后，取出瓊脂糖凝膠，放于凝膠成像系統(tǒng)中，紫外線下觀察并拍照保存。本發(fā)明使用的菌種是保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)桑黃菌種(鮑姆層孔菌，保藏號(hào)為桑黃DLlOl CCTCC M 2011137)。保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址中國武漢武漢大學(xué)郵編430072。保藏日期2011. 05. 03，保藏編號(hào)CCTCC NO :M2011137，分類命名桑黃DLlOl phellinus Baumii DLlOl0
本發(fā)明一種桑黃菌絲體的制備方法，操作簡單，原理易懂，為今后獲得大規(guī)模的、高純度的桑黃菌絲體和高質(zhì)量的桑黃總RNA提供了簡便快捷的方法，也為桑黃的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

圖1為本發(fā)明的桑黃總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面舉例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 本發(fā)明一種桑黃菌絲體的制備方法，步驟如下步驟一桑黃菌種活化將保存在冰箱里的桑黃菌種用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面活化，首先將從 4°C冰箱里拿出來的桑黃菌種在室溫下放置一段時(shí)間，達(dá)到與室溫一致即可，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面接種，每個(gè)試管斜面只接一個(gè)點(diǎn)，蓋上膠塞， 放置在25°C溫箱里恒溫避光培養(yǎng)5-7天；步驟二 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)將已活化的桑黃菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，在超凈工作臺(tái)內(nèi)， 用接種鉤挑取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面上邊緣生長旺盛的桑黃菌絲體，接于平板中間，每個(gè)平板只接一個(gè)點(diǎn)，用封口膜封上置于25°C溫箱里恒溫避光培養(yǎng)7-9天；步驟三刮取桑黃菌絲體接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)將要長滿平板的年輕桑黃菌絲體進(jìn)行刮取并接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中， 首先，要選擇幾乎長滿平板但還沒有老化變黃的桑黃菌絲體作為接種材料，因?yàn)檫@樣的菌絲體更易于刮?。挥脺邕^菌的小鑰匙進(jìn)行刮取，刮的時(shí)候不要太用力，只刮取桑黃菌絲體， 不要連帶培養(yǎng)基，刮取下來的桑黃菌絲體在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基里以涮的方式進(jìn)行接種，接入250ml三角瓶中，每瓶接入1-2個(gè)平板的桑黃菌絲體；封瓶膜封口后，置于恒溫振蕩器120r/min，25°C恒溫避光振蕩培養(yǎng)5-7天；步驟四收集桑黃菌絲體在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基尚未變色之前進(jìn)行桑黃菌絲體收集，將三角瓶里的桑黃菌絲體，進(jìn)行10層紗布過濾，用無菌蒸餾水沖洗桑黃菌絲體2-3遍，沖掉殘留的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，帶上一次性手套將紗布擰干，擰到桑黃菌絲體在紗布上略微粘起的程度即可，用滅過菌的鑷子將桑黃菌絲體從紗布上小塊地撕取下來，放入2mL的離心管中，不要放得太實(shí)，裝入量為離心管的1/3即可，置于_70°C保存，備用；步驟五提取桑黃菌絲體總RNA將步驟四中在-70°C里2mL離心管中保藏的桑黃菌絲體取出，置于用液氮冷卻過的研缽里充分研磨至粉狀，迅速分裝到盛有1. OmLTrizol試劑的1. 5mL無菌離心管中；用振蕩器振蕩3-5min，放回冰盒；加200 μ L氯仿，振蕩5min再放回冰盒靜置3_5min ；離心， 12000rpm, 15min ；取新的1. 5mL無菌離心管加600 μ L氯仿，將離心后的上清液加進(jìn)來，振蕩3-5min，保證液體能懸浮起來，靜置Imin ；離心，12000rpm, IOmin ；取新的1. 5mL無菌離心管加500 μ L異丙醇，將離心后的上清液加進(jìn)來，振蕩lmin，混勻；放冰上，靜置IOminjX 淀，離心12000rpm，IOmin ；去除上清液，留沉淀，加200 μ L的DEPC水溶解沉淀，用等體積的氯仿抽提2次，離心，12000rpm, 5min,每次離心后取上清液，第二次離心后得到的上清液即為我們所需的桑黃總RNA樣品；電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果；剩下的桑黃總RNA 樣品加入4倍體積的無水乙醇，再滴加幾滴3mol/L的乙酸鈉溶液，混勻，冰上靜置lOmin，12000rpm，離心 lOmin，放于 _70°C保存。步驟六瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果稱取1. 6g瓊脂糖于小三角瓶中，加入20mL的1 X TAE,微波爐中加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻；當(dāng)溫度降到50度左右時(shí)向小三角瓶中加入IyL的溴化乙錠，振蕩混勻；趁熱倒入洗凈的制膠槽中，形成模子，將制膠槽置于水平位置并固定放好梳子，室溫下靜置直至凝膠完全凝固，即得到瓊脂糖凝膠，垂直輕拔梳子，將瓊脂糖凝膠及內(nèi)槽放于電泳槽中，備用。在點(diǎn)樣板上，將3 μ L步驟五中的桑黃總RNA樣品與2 μ L的上樣緩沖液混合均勻， 用10 μ L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)桑黃總RNA樣品，應(yīng)更換一個(gè)新槍頭，以防污染，加樣時(shí)，勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓80-100V，樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動(dòng)，當(dāng)上樣緩沖液中的溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約Icm時(shí)，停止電泳。電泳完畢后，取出瓊脂糖凝膠，放于凝膠成像系統(tǒng)中，紫外線下觀察并拍照保存。實(shí)施例2 本發(fā)明一種桑黃菌絲體的制備方法，步驟如下步驟一制備桑黃菌絲體斜面培養(yǎng)基配置本發(fā)明中所述的桑黃菌絲體培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基IL，每升中各組份重量為馬鈴薯200g (去皮)，葡萄糖20g，瓊脂15g。將培養(yǎng)基趁熱分裝到試管中，每管大約5ml，蓋上膠塞，高壓蒸汽滅菌，121°C，15min，取出后趁熱擺斜面，冷卻，備用。步驟二 菌種活化將保存在冰箱里的桑黃菌種用已制備的PDA培養(yǎng)基斜面活化，首先將從4°C冰箱里拿出來的桑黃菌種在室溫下放置一段時(shí)間，達(dá)到與室溫一致即可，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行PDA斜面接種，每個(gè)斜面只接一個(gè)點(diǎn)，放置在25°C溫箱里避光培養(yǎng)5-7d ；步驟三制備PDA平板培養(yǎng)基配置本發(fā)明中所述的用于刮取桑黃菌絲體的PDA培養(yǎng)基IL，每升中各組份重量為馬鈴薯200g (去皮)，葡萄糖20g，瓊脂20g (瓊脂加的比正常的15g多，易于下面的刮取菌絲體實(shí)驗(yàn))。將培養(yǎng)基分裝到500ml三角瓶中，每瓶裝250ml左右，用封瓶膜封口，高壓蒸汽滅菌，12rC，15min，取出后趁熱倒平板，在超凈工作臺(tái)中，向滅過菌的平板里每個(gè)倒入 ΙΟ-iaiil，靜置冷卻，備用。步驟四PDA平板培養(yǎng)將已活化的桑黃PDA斜面轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用接種鉤挑取PDA斜面邊緣生長旺盛的菌絲，接于平板中間，每個(gè)平板只接一個(gè)點(diǎn)，用封口膜封上置于 25 °C溫箱里避光培養(yǎng)7-9d ；步驟五制備液體培養(yǎng)基(PA培養(yǎng)基)配置本發(fā)明中所述的用于培養(yǎng)桑黃菌絲體的液體培養(yǎng)基IL，每升中各組份重量為馬鈴薯200g (去皮)，葡萄糖20g，將培養(yǎng)基分裝到250ml三角瓶中，每瓶裝IOOml左右， 用封瓶膜封口，高壓蒸汽滅菌，121°C，15min，取出，冷卻備用。步驟六刮取菌絲體接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)將要長滿平板的年輕菌絲進(jìn)行刮取并接種于PA培養(yǎng)基中，首先，要選擇幾乎長滿平板但還沒有老化變黃的菌絲作為接種材料，因?yàn)檫@樣的菌絲更易于刮??；用滅過菌的小鑰匙進(jìn)行刮取，刮的時(shí)候不要太用力，只刮取菌絲，不要連帶培養(yǎng)基，刮取下來的菌絲體在 PA培養(yǎng)基里以涮的方式進(jìn)行接種，接入250ml三角瓶中，每瓶接入1_2個(gè)平板的菌絲體；封瓶膜封口后，置于恒溫振蕩器120r/min，25°C避光振蕩培養(yǎng)5_7d ；步驟七收集菌絲體在培養(yǎng)液尚未變色之前進(jìn)行菌絲體收集，將三角瓶里的菌絲體，進(jìn)行10層紗布過濾，用無菌蒸餾水沖洗菌絲體2-3遍，沖掉殘留的培養(yǎng)液，帶上一次性手套將紗布擰干，擰到菌絲體在紗布上略微粘起的程度即可，用滅過菌的鑷子將菌絲體從紗布上小塊地撕取下來，放入2mL的離心管中，不要放得太實(shí)，裝入量為管的1/3即可，置于-70°C保存，備用；步驟八提取桑黃菌絲體總RNA將-70 0C冷凍保藏的桑黃菌絲體取出，置于用液氮冷卻過的研缽里研磨，迅速分裝到盛有1. OmLTrizol的1. 5mL無菌離心管中；用振蕩器振蕩3_5min，放回冰盒；加200 μ L 氯仿，振5min放冰盒靜置3-5min ；離心，12000rpm, 15min ；取新滅菌過的離心管加600 μ L 氯仿，將離心后的上清液加進(jìn)來，振蕩3-5min，保證液體能懸浮起來，靜置Imin ；離心， 12000rpm, IOmin ；取新的離心管加500 μ L異丙醇，將離心后的上清液加進(jìn)來，振蕩IminJg 勻；放冰上，靜置lOmin，沉淀，離心12000rpm，IOmin ；加200 μ L的DEPC水溶解，用等體積的氯仿抽提2次，12000rpm，離心5min ；電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果；剩下的樣品加入4倍體積無水乙醇，再滴加幾滴乙酸鈉，混勻，冰上靜置lOmin，12000rpm,離心lOmin，放于-70°C保存。步驟九瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果制備0. 8%瓊脂糖凝膠。稱取1. 6g瓊脂糖于小三角瓶中，加入20mL的1XTAE，微波爐中加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻；當(dāng)溫度降到50度左右時(shí)向其加入1 μ L的 EB (溴化乙錠)，振蕩混勻；趁熱倒入洗凈的制膠槽中，形成模子，將槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子，室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，將凝膠及內(nèi)槽放于電泳槽中，備用。在點(diǎn)樣板上，將3 μ L樣品與2 μ L的上樣緩沖液混合均勻，用10 μ L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)新槍頭，以防污染，加樣時(shí)， 勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓80-100V，樣品由負(fù)極(黑色)向正極 (紅色)方向移動(dòng)，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約Icm時(shí)，停止電泳。電泳完畢后，取出凝膠，放于凝膠成像系統(tǒng)中，紫外線下觀察并拍照保存。
權(quán)利要求
1. 一種桑黃菌絲體的制備方法，其特征在于步驟如下 步驟一桑黃菌種活化將保存在冰箱里的桑黃菌種用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面活化，首先將從4°C 冰箱里拿出來的桑黃菌種在室溫下放置一段時(shí)間，達(dá)到與室溫一致即可，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面接種，每個(gè)試管斜面只接一個(gè)點(diǎn)，蓋上膠塞，放置在25°C溫箱里恒溫避光培養(yǎng)5-7天；步驟二 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)將已活化的桑黃菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用接種鉤挑取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面上邊緣生長旺盛的桑黃菌絲體，接于平板中間，每個(gè)平板只接一個(gè)點(diǎn)，用封口膜封上置于25°C溫箱里恒溫避光培養(yǎng)7-9天； 步驟三刮取桑黃菌絲體接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng) 將要長滿平板的年輕桑黃菌絲體進(jìn)行刮取并接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，首先，要選擇幾乎長滿平板但還沒有老化變黃的桑黃菌絲體作為接種材料，因?yàn)檫@樣的菌絲體更易于刮?。挥脺邕^菌的小鑰匙進(jìn)行刮取，刮的時(shí)候不要太用力，只刮取桑黃菌絲體，不要連帶培養(yǎng)基，刮取下來的桑黃菌絲體在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基里以涮的方式進(jìn)行接種，接入250ml三角瓶中，每瓶接入1-2個(gè)平板的桑黃菌絲體；封瓶膜封口后，置于恒溫振蕩器120r/min，25°C恒溫避光振蕩培養(yǎng)5-7天； 步驟四收集桑黃菌絲體在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基尚未變色之前進(jìn)行桑黃菌絲體收集，將三角瓶里的桑黃菌絲體，進(jìn)行10層紗布過濾，用無菌蒸餾水沖洗桑黃菌絲體2-3遍，沖掉殘留的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，帶上一次性手套將紗布擰干，擰到桑黃菌絲體在紗布上略微粘起的程度即可， 用滅過菌的鑷子將桑黃菌絲體從紗布上小塊地撕取下來，放入2mL的離心管中，不要放得太實(shí)，裝入量為離心管的1/3即可，置于_70°C保存，備用； 步驟五提取桑黃菌絲體總RNA將步驟四中在-70°C里2mL離心管中保藏的桑黃菌絲體取出，置于用液氮冷卻過的研缽里充分研磨至粉狀，迅速分裝到盛有1. OmLTrizol試劑的1. 5mL無菌離心管中；用振蕩器振蕩3-5min，放回冰盒；加200 μ L氯仿，振蕩5min再放回冰盒靜置3_5min ；離心， 12000rpm, 15min ；取新的1. 5mL無菌離心管加600 μ L氯仿，將離心后的上清液加進(jìn)來，振蕩3-5min，保證液體能懸浮起來，靜置Imin ；離心，12000rpm, IOmin ；取新的1. 5mL無菌離心管加500 μ L異丙醇，將離心后的上清液加進(jìn)來，振蕩lmin，混勻；放冰上，靜置IOminjX 淀，離心12000rpm，IOmin ；去除上清液，留沉淀，加200 μ L的DEPC水溶解沉淀，用等體積的氯仿抽提2次，離心，12000rpm, 5min,每次離心后取上清液，第二次離心后得到的上清液即為我們所需的桑黃總RNA樣品；電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果；剩下的桑黃總RNA 樣品加入4倍體積的無水乙醇，再滴加幾滴3mol/L的乙酸鈉溶液，混勻，冰上靜置lOmin， 12000rpm，離心 lOmin，放于 _70°C保存； 步驟六瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果稱取1. 6g瓊脂糖于小三角瓶中，加入20mL的IX TAE，微波爐中加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻；當(dāng)溫度降到50度左右時(shí)向小三角瓶中加入IyL的溴化乙錠，振蕩混勻；趁熱倒入洗凈的制膠槽中，形成模子，將制膠槽置于水平位置并固定放好梳子，室溫下靜置直至凝膠完全凝固，即得到瓊脂糖凝膠，垂直輕拔梳子，將瓊脂糖凝膠及內(nèi)槽放于電泳槽中，備用；在點(diǎn)樣板上，將3μ L步驟五中的桑黃總RNA樣品與2μ L的上樣緩沖液混合均勻，用 10 μ L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)桑黃總RNA樣品，應(yīng)更換一個(gè)新槍頭，以防污染，加樣時(shí)，勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面，加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓80-100V，樣品由負(fù)極向正極方向移動(dòng)，當(dāng)上樣緩沖液中的溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約Icm時(shí)，停止電泳，電泳完畢后，取出瓊脂糖凝膠，放于凝膠成像系統(tǒng)中，紫外線下觀察并拍照保存。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種桑黃菌絲體的制備方法。步驟包括桑黃菌種活化；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)；刮取桑黃菌絲體接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)；收集桑黃菌絲體；提取桑黃菌絲體總RNA；瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。本發(fā)明使用的菌種是保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)桑黃菌種(鮑姆層孔菌，保藏號(hào)為桑黃DL101 CCTCC M 2011137)。本發(fā)明操作簡單，原理易懂，為今后獲得大規(guī)模的、高純度的桑黃菌絲體和高質(zhì)量的桑黃總RNA提供了簡便快捷的方法，也為桑黃的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102363749SQ20111031566
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者劉志華, 孫婷婷, 王志英, 鄒莉 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)