火木層孔菌桑黃中單體成分Hypholomine B的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及火木層孔菌桑黃中單體成分HypholomineB的制備方法，步驟如下：1)桑黃藥材粉碎，超聲提?。?)提取物經(jīng)第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃??；3)分取2)中下層溶液經(jīng)第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取；取上層萃取液，得到萃取物干粉；4)制備流動相，得到上相溶液與下相溶液；5）下相溶液溶解萃取物干粉，上相溶液泵入高速逆流色譜儀分離管，主機為正轉(zhuǎn)，將下相溶液泵入，到平衡后，取濾液注入進樣閥，每15min收集1個流分；合并其中60-70min時間段內(nèi)所收集流分，減壓回收溶劑，得到單體化合物HypholomineB的干粉。本發(fā)明提取分離采用的技術(shù)手段新、分離效率高、方法穩(wěn)定可重復(fù)。
【專利說明】火木層孔菌桑黃中單體成分Hypholomine B的制備方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種屬于藥物領(lǐng)域，尤其涉及提取自火木層孔菌桑黃 中的一種單體成分：Hypholomine B的制備方法。 【背景技術(shù)】
[0002] 桑黃為擔(dān)子菌門（Basidiomycotas)、層菌綱（Hymenomycetes)、非裙菌目 (Aphyllophorales)、鎊革孔菌科（Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬（Phellinus Quel.) 大型藥用真菌的子實體。桑黃始記于《本草綱目》，又名桑臣、桑耳、胡孫眼、桑黃姑，可 用于治療治血崩、血淋、脫肛瀉血、帶下、經(jīng)閉、脾虛泄瀉等。其來源主要包含火木層孔菌 {Phellinus igniarius (Berk, et Curt.) Teng)、裂蹄木層孑L菌linteus (L.ex Fr.) Quel)和鮑氏層孔菌Aaa? ii /Wai)三個種。目前國內(nèi)外對桑黃 研究較多集中于生物學(xué)特征、化學(xué)成分分析、藥用機理以及菌種培育工藝等方面。
[0003] 桑黃因其臨床確有療效的抗腫瘤作用，近年來逐漸成為研究熱點。早在1968年， 日本學(xué)者Ikekawa研究發(fā)現(xiàn)桑黃子實體提取物對小鼠 S180肉瘤的抑制率為96. 7%，第一 次提出了桑黃具有腫瘤抑制作用。有關(guān)桑黃多糖免疫刺激和抗腫瘤活性研究報道較多，結(jié) 果顯示多糖能夠促進抗體的產(chǎn)生，降低荷瘤小鼠毒副作用和增強體內(nèi)協(xié)同作用，具有抑制 S180肉瘤細(xì)胞和H22肝癌細(xì)胞小鼠移植瘤的生長作用。Ge Li等研究后認(rèn)為桑黃蛋白多糖 可降低人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中Bcl-2的表達(dá)，增加細(xì)胞色素 C的釋放和減少細(xì)胞周期蛋白 B1來抑制SW480的生長，進而引發(fā)細(xì)胞凋亡作用。Jong-Jin Lee等研究發(fā)現(xiàn)桑黃菌絲體 多糖對人肺腺癌細(xì)胞A549具有直接殺傷作用，而對正常細(xì)胞NIH3T3和L1210沒有影響。 Ji D F等研究發(fā)現(xiàn)桑黃多糖可通過P27kipl-cyclin D1/E-CDK2途徑抑制人結(jié)腸腺癌細(xì)胞 HT-29和人肝癌細(xì)胞Η印G2的細(xì)胞S期，從而抑制HT-29和Η印G2的生長，引起細(xì)胞凋亡 作用。
[0004] 桑黃的其他化學(xué)成分，如黃酮類、多酚類、三萜類等，相關(guān)生物活性研究報道集中 于抗炎、抗氧化，抗病毒、降糖以及抗自由基等作用研究，其中Inoscavin A、Hypholomine B等成為是桑黃中含量較高的多酚類成分，研究證實具有抗氧化、抗自由基作用。本發(fā)明采 用溶劑提取，高速逆流色譜分離技術(shù)，自火木層孔菌桑黃中純化 制備得到一種單體成分，結(jié)合波譜解析，確定為多酚類物質(zhì)Hypholomine B，是桑黃醇提物 中主成分，生藥中含量達(dá)0.78%，并且峰位居中、與鄰峰分離度良好。據(jù)報道該成分具有顯著 的抗氧化、抗炎活性，本發(fā)明確定了該成分的制備方法，應(yīng)用該方法，能夠批量制備桑黃單 體成分，為桑黃藥效學(xué)研究及藥材質(zhì)量控制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。經(jīng)檢索，為見與本發(fā)明類似的關(guān) 于Hypholomine B單體成分制備方法的公開，除了采用植化分離手段，得到微量成分用于化 學(xué)結(jié)構(gòu)研究的研究報道。如文獻 1 "In-Kyoung Lee, Myung-Suk Han, Myeong-Seok Lee, Young-Sook Kim, Bong-Sik Yun, Styrylpyrones from the medicinal fungus Phellinus baumii and their antioxidant properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20 (2010) 5459 - 5461，';文獻二"Shunyan Mo, Sujuan Wang, Guangxiong Zhou, et al. Phelligridins C_F: Cytotoxic Pyrano[4,3_c][2]benzopyran_l, 6-dione and Furo[3, 2-c]pyran-4-〇ne Derivatives from the Fungus Phellinus igniarius. Nat. Prod. 67 (2004)823-828";文獻三"Yeon Sil Lee, Il-Jun Kang, Moo Ho Won, Jae-Yong Lee, Jin Kyu Kim and Soon Sung Lim. Inhibition of Protein Tyrosine Phosphatase 1 β by Hispidin Derivatives Isolated from the Fruiting Body of Phellinus linteus. , Natural Product Communications 5 (2010) 1927-1930"。上述文獻中均提 到了化合物Hypholomine B并明確指出其結(jié)構(gòu)式，文獻1、2、3均采用溶劑提取-柱分離技 術(shù)，得到系列化合物，經(jīng)光譜、質(zhì)譜及核磁分析，鑒定所得化合物。文獻3證實該化合物具有 鐵螯合活性，因而發(fā)揮抗氧化作用。但所有文獻均以植化分離技術(shù)得到微量化合物，采用成 分結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)進行化合物結(jié)構(gòu)解析，其目的是為了證明被研究植物中含有該化合物，而 非批量純化制備該化合物，因而不涉及該化合物的純化制備過程。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種火木層孔菌桑黃中單體成分 Hypholomine B的制備方法，該方法具有分離效率高、方法穩(wěn)定可重復(fù)和技術(shù)應(yīng)用前景良好 的特點。
[0006] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案： 火木層孔菌桑黃中單體成分Hypholomine B的制備方法，該方法包括以下的步驟： 1) 桑黃藥材粉碎，采用60%體積百分比濃度的乙醇水溶液超聲提??； 2) 乙醇提取物經(jīng)第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第一石油醚和乙酸乙酯混合溶 液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為3:1，棄去； 3) 分取2)中下層溶液經(jīng)第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第二石油醚和乙酸乙 酯混合溶液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為1:1 ;取上層萃取液，濃縮，干燥，得到萃取物 干粉； 4) 制備流動相，流動相采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系，精密計量體積，配制成 體積比為1:1. 7:1:2的混合溶液，充分振搖后靜置3 h，上下兩層完全分層澄清，分離上下 層，得到上相溶液與下相溶液，分別超聲脫氣30 min，備用； 5) 取萃取物干粉，精密稱重，取下相溶液，體積相當(dāng)于萃取物干粉質(zhì)量數(shù)的10倍量，溶 解萃取物干粉，用〇. 45 Mm孔徑的微孔濾膜濾過，濾液備用；取上相溶液，泵入高速逆流色 譜儀分離管，待固定相充滿整個分離管后，調(diào)節(jié)主機為正轉(zhuǎn)，至800 r/min轉(zhuǎn)速，同時將下相 溶液泵入，待流動相從柱口流出且固定相不流出，兩相溶劑在分離管中達(dá)到動態(tài)平衡后，取 濾液10mL，注入進樣閥進樣，流速2. 5 mL/min的條件下，395 nm波長下檢測，分離樣品，總 分析時間200 min，每15 min收集1個流分；合并其中60-70 min時間段內(nèi)所收集流分，減 壓回收溶劑，得到單體化合物Hypholomine B的干粉。
[0007] 作為優(yōu)選，所述的步驟1)中取桑黃藥材，粉碎成蠶豆大顆粒，加入相當(dāng)于8倍藥材 質(zhì)量的濃度為60 %的乙醇水溶液，浸泡15 min，超聲提取30 min，濾過，該過程重復(fù)三次合 并3次濾液，減壓回收溶劑，得到干燥粉末，備用。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的步驟2)中取步驟1)的乙醇提取物，20%乙醇水溶液充分溶解，轉(zhuǎn) 移至分液漏斗中，放冷；加入同體積的第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液，振搖萃取；靜置分 層；分取下層水液，棄去上層；下層水液采用同樣的萃取過程，重復(fù)萃取1次；棄去上層，得 石油醚乙酸乙酯混合溶液萃取去雜后的水液，備用。
[0009] 作為優(yōu)選，所述的步驟3)中取步驟2)的下層溶液，加入等體積的第二石油醚和乙 酸乙酯混合溶液，振搖萃取；靜置分層；分取上層，下層水液采用同樣的萃取過程，重復(fù)萃 取2次；合并3次的萃取液；50°C水浴蒸干，殘渣冷藏備用。
[〇〇1〇] 作為優(yōu)選，該方法還包括精制步驟：取制備的干粉，加50%乙腈水溶液充分溶解， 體積相當(dāng)于干粉質(zhì)量數(shù)的10倍，備用；采用C18制備色譜柱，在流動相乙腈-水體積比為 1:1，流速3 mL/min條件下，精密吸取上述制備的溶液，進樣lmL，分離精制，395nm波長檢 測，總運行時間25 min，收集22. 5-23. 5 min的洗脫液，減壓干燥，得到淡黃色無定形粉末， 即 Hypholomine B 精制品。
[0011] 上述的方法制備的Hypholomine B化合物用于用于作為桑黃藥材的質(zhì)量評價與質(zhì) 量控制的指標(biāo)成分，或者用于制備抗炎、抗氧化等藥物的主成分。
[0012] 本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，提供了桑黃中的一種單體成分：Hypholomine B及其制備方法和應(yīng)用，具體來說，本發(fā)明的方法可以實現(xiàn)桑黃中單體成分Hypholomine B 化合物的批量制備，該化合物為hispidin的衍生物，具有顯著的抗氧化、抗炎的功效，被廣 泛用于保健品、化妝品中。同時，本發(fā)明的化合物為桑黃醇提取物中主成分，在桑黃醇提取 物特征圖譜中峰位居中，吸收最高（395 nm條件下)，與鄰峰分離度好，能夠作為指標(biāo)成分， 進行桑黃藥材的質(zhì)量評價與質(zhì)量控制，為桑黃的實驗研究及研發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是： 1、提取分離采用的技術(shù)手段新 高速逆流色譜技術(shù)是目前中藥與天然藥物化學(xué)研究領(lǐng)域較為先進的分離技術(shù)，與傳統(tǒng) 的柱分離方法以及溶劑萃取方法相比，分離效率及分離效果均有明顯的優(yōu)勢。本方法在溶 劑粗提的基礎(chǔ)上，采用高速逆流色譜技術(shù)，在技術(shù)手段上具有先進性。
[0014] 2、分離效率高 本方法采用乙醇提取，溶劑萃取的方式得到桑黃乙醇提取石油醚：乙酸乙酯（1:1，V/ v)混合溶劑萃取物，進一步采用高速逆流色譜技術(shù)，半制備液相純化，分離得到純度95%以 上的單體成分，基本達(dá)到含量測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度要求。本方法省略了反復(fù)液-液萃取以 及柱分離過程，簡化分離流程，節(jié)約了大量的溶劑處理時間。在不到一天的分離流程內(nèi)，能 夠達(dá)到毫克級單體成分的制備能力。
[0015] 3、方法穩(wěn)定可重復(fù) 本方法在液-液萃取的基礎(chǔ)上，采用高速逆流色譜及半制備液相色譜儀，完成單體成 分純化精制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與傳統(tǒng)反復(fù)液-液萃取、柱分離制備方法相比，方法穩(wěn)定，可重復(fù) 性好。
[0016] 4、技術(shù)應(yīng)用前景良好 藥物及保健品的研發(fā)是研究重點領(lǐng)域，本發(fā)明建立的單體制備方法，能夠為批量生產(chǎn) 單體物質(zhì)提供技術(shù)與方法，為后續(xù)的藥效學(xué)研究，藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究及藥物研發(fā)提供 基礎(chǔ)。具有良好的應(yīng)用前景。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為實施例1制備的Hypholomine B的結(jié)構(gòu)式。
[0018] 圖2為實施例1制備的Hypholomine B的液質(zhì)分析圖。
[0019] 圖3為實施例1制備的Hypholomine B的高速逆流色譜圖。
[0020] 圖4為實施例1制備的Hypholomine B的半制備液相色譜圖。
[0021] 圖5為實施例1制備的Hypholomine B的單體HPLC純度檢測圖。
[0022] 圖6為桑黃醇提取物HPLC特征圖譜。
[0023] 圖7為不同來源、產(chǎn)地桑黃藥材的HPLC指紋圖譜。 【具體實施方式】
[0024] 實施例1 Hypholomine B化合物的制備純化方法，該方法包括以下的步驟： 1)取桑黃藥材，粉碎成蠶豆大顆粒，精密稱取1000 g，加入8000 mL質(zhì)量濃度為60%的 乙醇水溶液，浸泡15 min，超聲提取30 min，濾過；濾渣再加8000 mL質(zhì)量濃度為60%的乙 醇水溶液，超聲提取30 min，濾過；濾渣再次加8000 mL質(zhì)量濃度為60%的乙醇水溶液，超 聲提取30 min，濾過；合并3次濾液，減壓濃縮，得到醇提取物粉末50. 8 g。
[0025] 2)取步驟1)中醇提取物10 g，加500 mL20%乙醇溶液充分溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗 中；加入500 mL實現(xiàn)配好的石油醚：乙酸乙酯（3:1，v/v)混合溶液，振搖萃??；靜置分層； 分取下層水液，上層棄去；下層水液再加500 mL同種混合溶劑萃??；棄去上層，得石油醚： 乙酸乙酯（3:1，v/v)混合溶液除雜后的溶液。
[0026] 3)取步驟2)的下層溶液液，體積約540 mL,加入540mL石油醚：乙酸乙酯（3:1, v/v)混合溶液，振搖萃取；靜置分層；分取上層溶液，下層重復(fù)采用同樣的萃取過程，重復(fù) 萃取2次；合并3次萃取的上層溶液；50°C水浴蒸干。10g醇提取按此操作共得到約1. 66 g 殘渣，冷藏備用； 4) 精密量取石油醚200 mL、乙酸乙酯340 mL、甲醇200 mL和純水400 mL，配制體積比 1:1. 7:1:2的混合溶液，充分振搖后靜置3 h，上下兩層完全分層澄清，分離上下層，得到上 相溶液與下相溶液，分別超聲脫氣30 min，備用； 5) 取步驟3)的殘渣20 mg，取步驟4)的下相溶液10 mL，溶解殘渣，溶液用0.45 Mm孔 徑的微孔濾膜濾過，濾液備用； 6) 取步驟4)的上相溶液，泵入高速逆流色譜儀分離管，待固定相充滿整個分離管后，調(diào) 節(jié)主機為正轉(zhuǎn)，至最大轉(zhuǎn)速（800 r/min)，同時將步驟3)的下相溶液泵入，待流動相從柱口 流出且固定相不流出，兩相溶劑在分離管中達(dá)到動態(tài)平衡后，取步驟5)的濾液10 mL，注入 進樣閥，流速2.5 mL/min的條件下，395 nm波長下檢測，分離樣品，總分析時間200 min，每 15 min收集1個流分；合并其中60-70 min內(nèi)所收集的流分，約25 mL，減壓回收溶劑，同次 操作最后合并共得到干粉29. 5mg，備用； 7) 取步驟6)的干粉29. 5 mg，加29. 5mL50%的乙腈水溶液完全溶解，0.45 μ m濾膜過 濾，備用； 8) 利用制備型高效液相色譜儀，采用C18制備色譜柱（10 mmX250mm，5 Mm)，設(shè)置流動 相乙腈（A相)-水（B相)體積比為1:1，流速3 mL/min條件下，取步驟7)的溶液，進樣2 mL, 395 nm波長檢測，分離樣品，總運行時間25 min,收集12. 5-23. 5 min的洗脫液，減壓干燥， 步驟6)的溶液經(jīng)15次進樣，得到淡黃色無定形粉末，即Hypholomine B，約15 mg。HPLC純 度檢測含量為95%。
[0027] 桑黃藥材質(zhì)量評價應(yīng)用 1) 取采用本發(fā)明制備的單體成分-Hypholomine B，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為0. lmg/mL 的溶液，備用； 2) 取全國各主產(chǎn)區(qū)桑黃藥材樣品粗粉，精密稱定，加質(zhì)量濃度為60%的乙醇溶液，浸泡 15min，超聲提取30min，提取液以0. 45 Mm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液，備用； 3) 利用分析型高效液相色譜儀，采用C18柱（4.6 mmX250 mm，5 Mm)，柱溫30°C，以甲 醇（A相)、0. 2%磷酸水溶液（B相）為流動相。梯度洗脫程序：0-20 min，A相30-40% ;20-30 min，A 相 30-40% ;30-45 min，A 相 45% ;45-60 min，A 相 45-55%，流速 lmL/min，395 nm 波 長下檢測，分別吸取步驟1)的Hypholomine B溶液1〇μ?，步驟2)的桑黃藥材供試品溶液 各1〇μ?，進樣分析，得到不同樣品的HPLC特征圖譜(見發(fā)明附圖7)。各樣品色譜圖中，在 與Hypholomine Β相同保留時間位置，為藥材中所含Hypholomine Β的色譜峰，根據(jù)該峰 面積，計算不同藥材中Hypholomine B的含量，結(jié)果見表1，可以直觀地比較不同樣品中 Hypholomine B的含量，從而評價不同藥材的質(zhì)量。
[0028] 表1.不同來源及產(chǎn)地桑黃藥材中Hypholomine B的含量
【權(quán)利要求】
1. 火木層孔菌桑黃中單體成分Hypholomine B的制備方法，其特征在于該方法包括以 下的步驟： 1) 桑黃藥材粉碎，采用60%體積百分比濃度的乙醇水溶液超聲提??； 2) 乙醇提取物經(jīng)第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第一石油醚和乙酸乙酯混合溶 液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為3:1，棄去； 3) 分取2)中下層溶液經(jīng)第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第二石油醚和乙酸乙 酯混合溶液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為1:1 ;取上層萃取液，濃縮，干燥，得到萃取物 干粉； 4) 制備流動相，流動相采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系，精密計量體積，配制成 體積比為1:1. 7:1:2的混合溶液，充分振搖后靜置3 h，上下兩層完全分層澄清，分離上下 層，得到上相溶液與下相溶液，分別超聲脫氣30 min，備用； 5) 取萃取物干粉，精密稱重，取下相溶液，體積相當(dāng)于萃取物干粉質(zhì)量數(shù)的10倍量，溶 解萃取物干粉，用〇. 45 Mm孔徑的微孔濾膜濾過，濾液備用；取上相溶液，泵入高速逆流色 譜儀分離管，待固定相充滿整個分離管后，調(diào)節(jié)主機為正轉(zhuǎn)，至800 r/min轉(zhuǎn)速，同時將下相 溶液泵入，待流動相從柱口流出且固定相不流出，兩相溶劑在分離管中達(dá)到動態(tài)平衡后，取 濾液10mL，注入進樣閥進樣，流速2. 5 mL/min的條件下，395 nm波長下檢測，分離樣品，總 分析時間200 min，每15 min收集1個流分；合并其中60-70 min時間段內(nèi)所收集流分，減 壓回收溶劑，得到單體化合物Hypholomine B的干粉。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Hypholomine B化合物的制備方法，其特征在于：步驟1)中 取桑黃藥材，粉碎成蠶豆大顆粒，加入相當(dāng)于8倍藥材質(zhì)量的濃度為60 %的乙醇水溶液，浸 泡15 min，超聲提取30 min，濾過，該過程重復(fù)三次合并3次濾液，減壓回收溶劑，得到干燥 粉末，備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Hypholomine B化合物的制備方法，其特征在于：步驟2)中 取步驟1)的乙醇提取物，20%乙醇水溶液充分溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放冷；加入同體積 的第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液，振搖萃?。混o置分層；分取下層水液，棄去上層；下層 水液采用同樣的萃取過程，重復(fù)萃取1次；棄去上層，得石油醚乙酸乙酯混合溶液萃取去雜 后的水液，備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Hypholomine B化合物的制備方法，其特征在于：步驟3)中 取步驟2)的下層溶液，加入等體積的第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液，振搖萃?。混o置分 層；分取上層，下層水液采用同樣的萃取過程，重復(fù)萃取2次；合并3次的萃取液；50°C水浴 蒸干，殘渣冷藏備用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Hypholomine B化合物的制備方法，其特征在于該方法還 包括精制步驟：取制備的干粉，加50%乙腈水溶液充分溶解，體積相當(dāng)于干粉質(zhì)量數(shù)的10 倍，備用；采用C18制備色譜柱，在流動相乙腈-水體積比為1:1，流速3 mL/min條件下， 精密吸取上述制備的溶液，進樣lmL，分離精制，395nm波長檢測，總運行時間25 min,收集 22. 5-23. 5 min的洗脫液，減壓干燥，得到淡黃色無定形粉末，即Hypholomine B精制品。
【文檔編號】C07D493/04GK104059080SQ201410112506
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】董宇, 李洪玉, 壽旦, 張揚, 俞忠明 申請人:浙江省中醫(yī)藥研究院