專利名稱：一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
因胚胎干細(xì)胞受倫理學(xué)限制，2006年日本學(xué)者Siinya Yamanaka將鼠成纖維細(xì)胞重編程為多潛能分化干細(xì)胞，該細(xì)胞理論上具有分化為三胚層細(xì)胞能力。2007年日本學(xué)者 Shinya Yamanaka與美國(guó)學(xué)者Thompson將人皮膚成纖維細(xì)胞重編程為多潛能分化干細(xì)胞， 隨后全球掀起多潛能分化干細(xì)胞重編程熱潮，但是目前重編程細(xì)胞來(lái)源受個(gè)體差異、免疫反應(yīng)、動(dòng)物源性成分污染等困擾，因此，需要尋找一種容易獲得，不存在倫理學(xué)限制、免疫反應(yīng)和動(dòng)物源性污染等問(wèn)題的重編程細(xì)胞來(lái)源，以保證多潛能分化干細(xì)胞能安全、普遍地應(yīng)用于臨床。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其具有操作簡(jiǎn)單、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，能夠方便地獲取低免疫源性的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞，其作為重編程細(xì)胞來(lái)源，可重編程為多潛能分化干細(xì)胞，供基礎(chǔ)與臨床研究用。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的分離方法， 包括以下步驟1)取人臍帶活組織，洗凈，切碎；2)加入膠原酶IV，置于(X)2培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化處理，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清液；3)加入胰酶，置于(X)2培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化處理，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化；4)過(guò)濾，取濾液進(jìn)行離心，離心后棄上清液，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。進(jìn)一步地，在所述的步驟2)中，膠原酶IV的濃度為lmg/ml ;3mg/ml，消化處理的時(shí)間為3. 5 4. 5小時(shí)。膠原酶IV能夠從組織中消化下細(xì)胞，具有作用溫和、對(duì)細(xì)胞損傷較小等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)表明，采用濃度為lmg/ml 3mg/ml的膠原酶IV消化3. 5 4. 5小時(shí)，得到的單個(gè)細(xì)胞量最多，而且細(xì)胞活力最佳；如果降低膠原酶IV的濃度、延長(zhǎng)消化處理的時(shí)間，或者提高膠原酶IV的濃度、縮短消化處理的時(shí)間，均不利于單個(gè)細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活力的最大化。進(jìn)一步地，在所述的步驟3)中，胰酶的濃度為0. 05% 0. 50%，消化處理的時(shí)間為10 20分鐘。進(jìn)一步地，所述的胰酶中還添加有濃度為0. 02%的EDTA。經(jīng)膠原酶IV分離得到的細(xì)胞往往是抱團(tuán)生長(zhǎng)的，并非單細(xì)胞生長(zhǎng)。而胰酶是多種酶的復(fù)合體，它能夠?qū)⒔M織分化為單個(gè)細(xì)胞，以供單個(gè)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。在胰酶中添加EDTA 是為了螯合鈣鎂離子(因?yàn)殁}鎂離子會(huì)抑制胰酶的活性以及破壞細(xì)胞間的連結(jié)結(jié)構(gòu))，進(jìn)一步提高胰酶的活性，使細(xì)胞能夠分散成單個(gè)細(xì)胞，從而獲得數(shù)量和活力最大化的單個(gè)貼壁生長(zhǎng)的臍帶間充質(zhì)細(xì)胞。進(jìn)一步地，所述的DMEM/F12培養(yǎng)基中還添加有10% FBS、1 %非必需氨基酸、1 % L-谷氨酸鹽、青-鏈霉素和ImM 2-巰基乙醇。進(jìn)一步地，所述步驟2)和步驟4)中的離心條件為1500rpm 3000rpm，5 10分鐘。采用這一離心條件，能夠最大限度地減少原代細(xì)胞在離心過(guò)程中死亡。進(jìn)一步地，在所述的步驟2)和步驟3)中，CO2培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37°C、5% CO20進(jìn)一步地，在所述的步驟4)中，采用直徑為40 μ m的呢絨濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾。呢絨濾網(wǎng)具有滑糯、柔軟、懸垂性好、對(duì)細(xì)胞損傷小等優(yōu)點(diǎn)，而40 μ m的濾孔直徑與臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的直徑相當(dāng)，能夠只讓單個(gè)臍帶間充質(zhì)細(xì)胞通過(guò)，其它未被消化為單個(gè)細(xì)胞的則不能通過(guò)，從而提高了細(xì)胞的純度。一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟a.采用明膠對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行包被處理，然后用無(wú)Ca2+和Mg2+的PBS緩沖液對(duì)該培養(yǎng)皿進(jìn)行洗滌；b.取根據(jù)本發(fā)明所述分離方法獲得的細(xì)胞，接種到經(jīng)步驟a處理后的培養(yǎng)皿中；c.待細(xì)胞匯合生長(zhǎng)至85% 90%時(shí)，進(jìn)行消化傳代。進(jìn)一步地，在所述的步驟a中，采用濃度為0. 01% 0. 02%的明膠對(duì)培養(yǎng)皿包被 20 30分鐘。進(jìn)一步地，在所述的步驟b中，細(xì)胞以0. 5X IO5 1. OXlO5的濃度接種到經(jīng)步驟
a處理后的培養(yǎng)皿中。本發(fā)明采用酶消化法獲得人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞，該方法具有操作簡(jiǎn)單、容易掌握、便于推廣等優(yōu)點(diǎn)，而且獲得的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞免疫源性低，無(wú)動(dòng)物源性細(xì)胞污染，不存在傳播異種病原體的危險(xiǎn)，為日后人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞重編程為多潛能分化干細(xì)胞的應(yīng)用進(jìn)行鋪墊。
具體實(shí)施例方式DMEM/F12培養(yǎng)基的準(zhǔn)備在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10% FBS、1%非必需氨基酸、L-谷氨酸鹽、青-鏈霉素和ImM 2-巰基乙醇。取1 3厘米破宮產(chǎn)近胎兒端人臍帶活組織，采用無(wú)Ca2+和Mg2+的PBS緩沖液對(duì)人臍帶活組織進(jìn)行清洗，并將人臍帶活組織切碎至0. 5 1毫米的大小。將剪碎的人臍帶組織塊平鋪至IOcm的培養(yǎng)皿中，加入IOml濃度為ang/ml的膠原酶IV，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中4小時(shí)，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，在3000rpm 下離心8分鐘，吸棄上清液。加入8ml濃度為0.25%的胰酶(含0. 02%的EDTA)，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中 15分鐘，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，并用孔徑為40 μ m的呢絨濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，取濾液在1500rpm下離心8分鐘，吸棄上清液，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。取IOcm的培養(yǎng)皿，預(yù)先用濃度為0. 01 %的明膠包被30分鐘，然后用無(wú)Ca2+和Mg2+ 的PBS緩沖液洗滌2次。以IXlO5的濃度，將得到的細(xì)胞懸液接種在該培養(yǎng)皿中。每周換液2次，直至細(xì)胞匯合生長(zhǎng)至85%，進(jìn)行消化傳代。
權(quán)利要求
1.一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的分離方法，包括以下步驟1)取人臍帶活組織，洗凈，切碎；2)加入膠原酶IV，置于(X)2培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化處理，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清液；3)加入胰酶，置于(X)2培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化處理，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化；4)過(guò)濾，取濾液進(jìn)行離心，離心后棄上清液，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于在所述的步驟2)中，膠原酶IV的濃度為lmg/ml 3mg/ml，消化處理的時(shí)間為3. 5 4. 5小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于在所述的步驟幻中，胰酶的濃度為 0. 05% 0. 50%，消化處理的時(shí)間為10 20分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離方法，其特征在于所述的胰酶中還添加有濃度為 0. 02% 的 EDTA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于所述的DMEM/F12培養(yǎng)基中還添加有 10% FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酸鹽、青-鏈霉素和ImM 2-巰基乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于所述的步驟2)、步驟4)中的離心條件為 1500rpm 3000rpm, 5 10 分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于在所述的步驟2)和步驟3)中，CO2 培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37°C、5% C02。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于在所述的步驟4)中，采用直徑為 40 μ m的呢絨濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾。
9.一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟a.采用明膠對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行包被處理，然后用無(wú)Ca2+和Mg2+的PBS緩沖液對(duì)該培養(yǎng)皿進(jìn)行洗滌；b.取根據(jù)權(quán)利要求1所述分離方法獲得的細(xì)胞，接種到經(jīng)步驟a處理后的培養(yǎng)皿中；c.待細(xì)胞匯合生長(zhǎng)至85% 90%時(shí)，進(jìn)行消化傳代。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)方法，其特征在于在所述的步驟a中，采用濃度為 0. 01% 0. 02%的明膠對(duì)培養(yǎng)皿包被20 30分鐘。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)方法，其特征在于在所述的步驟b中，細(xì)胞以 0. 5 X IO5 1. OX IO5的濃度接種到經(jīng)步驟a處理后的培養(yǎng)皿中。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，該方法采用膠原酶IV和胰酶對(duì)人臍帶活組織進(jìn)行消化處理，并將分離得到的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞接種于預(yù)先用明膠包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行擴(kuò)增。本發(fā)明所述的分離培養(yǎng)方法具有操作簡(jiǎn)單、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，能夠方便地獲取低免疫源性的人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/077GK102321575SQ20111030090
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月8日
發(fā)明者盧海, 高毅 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院