專利名稱：微生物酶法拆分dl-精氨酸制備d-精氨酸鹽酸鹽和l-鳥氨酸鹽酸鹽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)領(lǐng)域，涉及通過微生物酶法拆分DL-精氨酸生產(chǎn)D-精氨酸鹽酸鹽和L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法。
背景技術(shù)：
D-精氨酸(D-arginine，D-Arg)作為一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是一種重要手性試劑和醫(yī)藥中間體。研究表明D-精氨酸具有抗高血壓的功效，作為多肽的組成氨基酸，D-精氨酸的重要生理功能還表現(xiàn)在可抑制癌癥擴(kuò)散，治療生長激素過多釋放造成的紊亂、抑制DNA 合成和抑制前列腺癌細(xì)胞增殖等方面。目前D-精氨酸的制備方法主要有(1)化學(xué)法化學(xué)法是將DL-精氨酸先與光學(xué)活性拆分劑反應(yīng)生成具有旋光性的氨基酸衍生物，再水解，調(diào)節(jié)PH至氨基酸等電點，即可析出晶體。化學(xué)拆分法通常工藝路線復(fù)雜，都要先轉(zhuǎn)化成氨基酸衍生物，因此步驟多、收率低，且存在拆分劑的選擇、回收等問題；(2)生物轉(zhuǎn)化法。生物轉(zhuǎn)化法是以微生物細(xì)胞或從微生物中提取的酶作為生物催化劑，利用酶的立體選擇性拆分得D-精氨酸和另一副產(chǎn)物，反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化體系中雜質(zhì)較少、提取工藝簡單，不產(chǎn)生有毒物質(zhì)。已有報道的李加友等利用糞球鏈菌菌體內(nèi)精氨酸脫亞胺酶對L-精氨酸的轉(zhuǎn)移脫亞胺作用，獲得D-精氨酸，同時獲得附加產(chǎn)物L(fēng)-瓜氨酸；劉均忠等采利用固定化精氨酸脫亞胺酶細(xì)胞的方法拆分DL-精氨酸，提高了酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用批次；Makryaleas等用動物來源的精氨酸酶催化DL-精氨酸轉(zhuǎn)化制備D-精氨酸與 L-鳥氨酸，但是由于他采用的精氨酸酶活力較低，且受來源限制，不能規(guī)模制備，因此不具有產(chǎn)業(yè)化價值。L-鳥氨酸(L-Ornithine)是生物體內(nèi)普遍存在的氨基酸之一，1877年杰弗在喂養(yǎng)安息香酸的鳥類的尿液水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了鳥氨酸，因此得名。鳥氨酸在生物體代謝中起到重要的作用。它是尿素形成過程中出現(xiàn)的氨基酸，是精氨酸、瓜氨酸等多種氨基酸代謝的前體物質(zhì)，主要參與產(chǎn)尿毒的鳥氨酸循環(huán)，對體內(nèi)聚集的氨具有解毒作用，因此鳥氨酸對人體肝臟細(xì)胞具有重大意義。在近代醫(yī)藥行業(yè)，L-鳥氨酸除用于制備保肝、護(hù)肝、抗疲勞、抗虛弱等各種復(fù)方氨基酸輸液外，還常與精氨酸一起用于配制恢復(fù)疲勞的發(fā)泡飲料。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，L-鳥氨酸還可刺激腦垂體分泌生長激素，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及糖與脂肪的分解代謝，在結(jié)合運動情況下攝食鳥氨酸可減少體內(nèi)脂肪堆積，增強肌肉，起到減肥保健的作用。此外， L-鳥氨酸能增加聚乙烯胺的合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖，具有提高免疫功能、抗癌功能的作用。因此，L-鳥氨酸因其多功能的保健作用而引起世人的關(guān)注。而以L-鳥氨酸為原料制備的依氟鳥氨酸，能抑制多胺合成，延緩腫瘤細(xì)胞增長，是一種很有前景的新型抗癌藥物。目前，制備L-鳥氨酸的方法主要有提取法、化學(xué)法、微生物發(fā)酵法和酶法。其中(1)提取法是從細(xì)菌的膜成分及多肽類抗生素物質(zhì)中提取，但是該法提取制備鳥氨酸的成本太高，且提取工藝繁瑣。
(2)化學(xué)法分為有機(jī)合成法和精氨酸水解法，此法大量使用有機(jī)溶劑，且得到的 DL型混合物，回收率低，分離提純困難。(3)微生物發(fā)酵法主要是利用L-鳥氨酸是L-精氨酸合成途徑中的中間產(chǎn)物之一， 通過篩選精氨酸或瓜氨酸的營養(yǎng)缺陷性突變株來積累L-鳥氨酸?？捎糜邙B氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌株主要是谷氨酸生產(chǎn)菌，通過谷氨酸的積累可以使代謝途徑向合成精氨酸方向進(jìn)行， 這樣利于鳥氨酸的積累。用發(fā)酵法生產(chǎn)鳥氨酸原料成本低廉，但是產(chǎn)量不高，且發(fā)酵生產(chǎn)周期較長，同時由于發(fā)酵液中的成分復(fù)雜，后續(xù)分離較為困難，給實際推廣應(yīng)用帶來了很大困難(4)酶法生產(chǎn)鳥氨酸就是利用動植物或微生物體內(nèi)的精氨酸酶作催化劑，水解精氨酸，生成鳥氨酸和尿素，反應(yīng)式如下
權(quán)利要求
1.一種微生物酶法拆分DL-精氨酸制備D-精氨酸鹽酸鹽和L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法， 其特征在于該方法包括以表達(dá)L-精氨酸酶的基因工程重組菌的發(fā)酵菌體細(xì)胞或噴霧干燥固體酶制劑為酶源，以DL-精氨酸為底物，在30至45 °C下，pH7至11，經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化反應(yīng)4 至對h，產(chǎn)生D-精氨酸和L-鳥氨酸；將酶促生成液經(jīng)減壓濃縮后，加入與濃縮液中L-鳥氨酸等物質(zhì)的量的濃鹽酸，使產(chǎn)生的L-鳥氨酸轉(zhuǎn)變成L-鳥氨酸單鹽酸鹽，然后加入3-5倍體積無水乙醇，使L-鳥氨酸單鹽酸鹽結(jié)晶析出，收集沉淀，得L-鳥氨酸鹽酸鹽；對乙醇析出結(jié)晶后的上清液，采用201X4樹脂去除其中殘留的尿素，經(jīng)0. 1 N鹽酸洗脫、減壓濃縮干燥， 獲得D-精氨酸鹽酸鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，酶促反應(yīng)液中，底物DL-精氨酸的加入量為20至200 g/L，酶源的添加量為500至2000 U/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于酶促反應(yīng)液中，底物DL-精氨酸的用量優(yōu)選為100 g ；酶源的添加量優(yōu)選為1000 U，優(yōu)選轉(zhuǎn)化溫度為37 °C，優(yōu)選轉(zhuǎn)化pHIO，優(yōu)選轉(zhuǎn)化時間24 h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的表達(dá)L-精氨酸酶的基因工程重組菌的宿主菌為大腸桿菌BL21，表達(dá)載體為pET21a(+)-Arg重組表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的表達(dá)L-精氨酸酶的基因工程重組菌體細(xì)胞的噴霧干燥固體酶制劑的制備條件為保護(hù)劑為脫脂奶粉、谷氨酸鈉或阿拉伯膠， 濃度范圍為100-200 g/L，進(jìn)口溫度為140-180 °C，霧化速度范圍為0. 2-0. 6 L/h，進(jìn)料菌濃范圍為 100-200 g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于最佳噴霧干燥條件為100g/L的脫脂奶粉、谷氨酸鈉或阿拉伯膠作為保護(hù)劑，進(jìn)口溫度為160 °C，霧化速度為0.4 L/h，進(jìn)料菌濃為 100 g/L。
全文摘要
一種微生物酶法拆分DL-精氨酸制備D-精氨酸鹽酸鹽和L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法。本發(fā)明利用高效表達(dá)L-精氨酸酶的重組大腸桿菌的發(fā)酵菌體或其噴霧干燥制劑作為酶源，以DL-精氨酸為底物，經(jīng)酶促反應(yīng)拆分DL-精氨酸生產(chǎn)D-精氨酸和L-鳥氨酸。生成液通過加入鹽酸使L-鳥氨酸變成L-鳥氨酸單鹽酸鹽，再加入一定體積的乙醇使其析出，收集沉淀得L-鳥氨酸鹽酸鹽；上清中D-精氨酸的純化方法是經(jīng)離子交換樹脂吸附洗脫、減壓濃縮干燥，獲得D-精氨酸鹽酸鹽；本專利提供了一種新的D-精氨酸鹽酸鹽和L-鳥氨酸鹽酸鹽的綠色生產(chǎn)工藝路線。
文檔編號C12R1/19GK102286602SQ20111027498
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者劉磊, 王文芳, 高智慧 申請人:天津啟仁醫(yī)藥科技有限公司