由使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白和能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的蛋白融合而得到的單體蛋 ...的制作方法
【專利摘要】一種由使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白和能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的蛋白融合而得到的單體蛋白組成的多聚體蛋白的制備方法，該制備方法包括下述步驟：步驟(A)，準(zhǔn)備在微生物的菌體內(nèi)呈不溶性顆粒形態(tài)的蛋白，該蛋白為上述單體蛋白；步驟(B)，利用含有月桂酰-L-Glu的水溶液增溶步驟(A)中準(zhǔn)備的單體蛋白；步驟(C)，在含有精氨酸鹽酸鹽的緩沖液中稀釋步驟(B)中得到的溶液，降低月桂酰-L-Glu的濃度；以及步驟(D)，利用凝膠過(guò)濾層析等將步驟(C)中得到的溶液的溶劑置換成緩沖液。
【專利說(shuō)明】由使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白和能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的蛋白融合而得到的單體蛋白組成的多聚體蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及由使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白和能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的蛋白融合而得到的單體蛋白組成的多聚體蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】 [0002]治療用抗體由于其療效高和副作用風(fēng)險(xiǎn)小而取得了巨大成功，但因其制造成本高而引起的高藥價(jià)則成為課題。該抗體的療效局限于白血病或自身免疫疾病等較窄的疾病范圍，在藥物的組織轉(zhuǎn)移性受到限制的固體癌癥等中不太有效，這也成為課題。
[0003]自從1988年可以在大腸桿菌內(nèi)制備抗體片段(非專利文獻(xiàn)I~3)以來(lái)，組織轉(zhuǎn)移性高、低分子化的修飾抗體(抗體片段)的開發(fā)持續(xù)進(jìn)行。為了獲得更高的抗癌效果，有多種使抗體片段與抗癌藥、毒素、放射性同位素或前體藥物活化酶等融合而得到的抗體融合蛋白也被提案。
[0004]但是，當(dāng)天然抗體所具有的二價(jià)結(jié)合性是發(fā)揮其與靶抗原的高親和性和優(yōu)異的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)時(shí)，人工制作的一價(jià)抗體融合蛋白與靶抗原的結(jié)合性不及天然抗體的結(jié)合性。
[0005]因此，最近將低分子化修飾抗體或抗體融合蛋白形成多價(jià)的試驗(yàn)逐漸盛行(非專利文獻(xiàn)4)。如果能夠使用微生物廉價(jià)地生產(chǎn)抗體這樣的多價(jià)分子，那么當(dāng)然可以滿足高功能和低藥價(jià)這兩個(gè)方面。
[0006]如雙抗體、三鏈抗體或模仿免疫球蛋白M的抗體那樣，已知利用抗體結(jié)構(gòu)自身的締合性來(lái)制備多價(jià)分子的方法。作為其他方法，還有通過(guò)使締合性蛋白與抗體的片段結(jié)構(gòu)融合而得到多價(jià)分子的方法。其例子有:經(jīng)由與單鏈抗體可變區(qū)(scFv)結(jié)合的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)等進(jìn)行二聚化的方法(非專利文獻(xiàn)5)或經(jīng)由來(lái)自人p53的四聚體化a螺旋結(jié)構(gòu)的方法(非專利文獻(xiàn)6)、利用來(lái)自微生物的鏈霉親和素的四聚體化的方法等。特別是，關(guān)于使鏈霉親和素融合的方法，已經(jīng)通過(guò)鏈霉親和素的結(jié)構(gòu)修飾實(shí)現(xiàn)了高功能化(提高穩(wěn)定性和溶解性、降低免疫原性等)(非專利文獻(xiàn)7)。融合了鏈霉親和素的蛋白可以經(jīng)由以高親和性與鏈霉親和素結(jié)合的生物素分子實(shí)現(xiàn)藥物預(yù)靶向作用，因此是最受期待的多價(jià)融合蛋白之一(非專利文獻(xiàn)7)。
[0007]其中，問(wèn)題在于:使用大腸桿菌等微生物生產(chǎn)多價(jià)融合蛋白時(shí)，往往會(huì)在微生物的菌體內(nèi)形成不溶性蛋白。在微生物的菌體內(nèi)不溶性的蛋白喪失了活性或穩(wěn)定性，所以為了將該蛋白作為藥品等來(lái)使用，必需重新進(jìn)行用于重建活性結(jié)構(gòu)的重折疊操作。
[0008]Schultz等人通過(guò)想辦法研究與鏈霉親和素結(jié)合的scFv內(nèi)的肽接頭或H鏈與L鏈的配置順序，報(bào)道了在大腸桿菌的菌體內(nèi)以可溶性且活性型的方式生產(chǎn)的例子(非專利文獻(xiàn)8)。但是，可知若將鏈霉親和素改變成修飾型，則其在大腸桿菌的菌體內(nèi)不溶(非專利文獻(xiàn)9)。因此，在鏈霉親和素融合蛋白的實(shí)用化上，認(rèn)為必需進(jìn)行重折疊操作。[0009]由于這樣的情況，Choe等人研究了修飾型鏈霉親和素融合蛋白的重折疊例子(非專利文獻(xiàn)10)，但目標(biāo)物的回收率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1%，在實(shí)用化上還存在很多課題。
[0010]本發(fā)明人之前提出了使由于不溶化或喪失了高級(jí)結(jié)構(gòu)而失去了活性或穩(wěn)定性的蛋白(改性蛋白)恢復(fù)天然狀態(tài)的高級(jí)結(jié)構(gòu)的方法(重折疊方法)(專利文獻(xiàn)I)。根據(jù)該方法，使用I~3%的預(yù)定的?；劝彼岜砻婊钚詣┧芤涸趐H6.5~9.0下增溶已改性沉淀的蛋白，之后，使用精氨酸緩沖液將該增溶后的溶液的表面活性劑濃度降低至0.02~0.5%，從而可以有效地重建蛋白結(jié)構(gòu)。
[0011]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開第2009/136568號(hào)；
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) 1:Science, 240, 1038-1041 (1988)；
非專利文獻(xiàn) 2:Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 85,5879-5883 (1988)；
非專利文獻(xiàn) 3:Science, 242，423-426 (1988)；
非專利文獻(xiàn) 4:Nature Reviews Immunology, 10 345-352 (2010)；
非專利文獻(xiàn) 5:Biochemisry (Mosc)，31，1579-1584 (1992)；
非專利文獻(xiàn) 6 Journal of Immunogy, 157，2989-2997 (1996)；
非專利文獻(xiàn) 7 Journal of Controlled Release 65，203-220 (2000)；
非專利文獻(xiàn) 8 =Cancer Research, 60，6663-6669 (2000)；
非專利文獻(xiàn) 9:Protein Science 10，491-503 (2001)；
非專利文獻(xiàn) 10:Bulletin of Korean Chemical Society, 30, 1101-1106 (2009)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明所要解決的課題
如上所述，使用大腸桿菌等微生物生產(chǎn)多價(jià)融合蛋白時(shí)，往往會(huì)在微生物的菌體內(nèi)形成不溶性蛋白， 但為了將其作為藥品等來(lái)使用，必需進(jìn)行用于重建活性結(jié)構(gòu)的重折疊操作。
[0013]本發(fā)明的課題在于提供:即使在多價(jià)融合蛋白中，在亞單元結(jié)構(gòu)中也包含免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的多聚體蛋白的新的制備方法。
[0014]解決課題的方法
這次，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn):通過(guò)月桂酰-L-Glu增溶的具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的融合蛋白，即使將月桂酰-L-Glu濃度降低至0.02~0.5%，也不會(huì)形成多聚體結(jié)構(gòu)，而是穩(wěn)定地繼續(xù)溶解。而且，在該融合蛋白溶解于月桂酰-L-Glu溶液期間，只形成亞單元結(jié)構(gòu)，接著，通過(guò)置換該溶液和特定的緩沖液，能夠形成上述融合蛋白的多聚體結(jié)構(gòu)。
[0015]即，通過(guò)本發(fā)明，提供由使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白與能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的蛋白融合而得到的單體蛋白組成的多聚體蛋白的制備方法，該制備方法包括下述步驟:
步驟(A)，準(zhǔn)備在微生物的菌體內(nèi)呈不溶性顆粒形態(tài)的蛋白，該蛋白為使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白與能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的其他蛋白融合而得到的單體蛋白；步驟(B)，利用含有月桂酰谷氨酸或其鹽的水溶液增溶步驟(A)中準(zhǔn)備的單體蛋白；步驟(C)，在含有精氨酸或精氨酸衍生物的緩沖液中稀釋步驟(B)中得到的溶液，降低月桂酰谷氨酸或其鹽的濃度；以及
步驟(D)，利用選自下述(dl)~(d4)的方法，將步驟(C)中得到的溶液的溶劑置換成緩沖液，
(dl)選自凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、疏水性相互作用層析和它們的組合的柱層
析；
(d2)超濾法；
(d3)透析法；以及
(d4) (dl)~(d3)中的兩種以上的組合。
[0016]發(fā)明效果
通過(guò)本發(fā)明，使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白與能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的其他蛋白融合，并根據(jù)該融合蛋白的性質(zhì)形成多聚體結(jié)構(gòu)，由此可以制備對(duì)靶抗原具有多個(gè)親和性部位的多聚體結(jié)構(gòu)的多價(jià)融合蛋白。 [0017]根據(jù)本發(fā)明，即使是使性質(zhì)大為不同的兩種以上的蛋白融合而得到的蛋白，也可以有效地形成多聚體結(jié)構(gòu)。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的蛋白不會(huì)形成多聚體蛋白，可以抑制其聚集和沉淀。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1顯示實(shí)驗(yàn)10中純化的HyHEL-1O scFv SA全長(zhǎng)的還原SDS凝膠電泳的結(jié)果。
[0020]圖2是顯示實(shí)驗(yàn)10中純化的HyHEL-1O scFv SA全長(zhǎng)的凝膠過(guò)濾HPLC圖形(225nm下的紫外部吸收)的圖。
[0021]圖3顯示實(shí)驗(yàn)11中純化的Dl.3 scFv SA全長(zhǎng)的還原SDS凝膠電泳的結(jié)果。
[0022]圖4是顯示實(shí)驗(yàn)11中純化的Dl.3 scFv SA全長(zhǎng)的凝膠過(guò)濾HPLC圖形(225nm下的紫外吸收)的圖。
[0023]圖5是顯示實(shí)驗(yàn)12中純化的HyHEL-1O scFv SAcore多聚體蛋白的凝膠過(guò)濾HPLC圖形(柱=Superdex 10/300 GL ;展開溶劑:0.1M磷酸鈉、0.2M精氨酸鹽酸鹽、pH6.8 ;流速為0.8ml/分鐘；檢測(cè):280nm下的紫外吸收)的圖。在峰的后方看到的次要成分推測(cè)是HyHEL-1O scFv SAcore多聚體蛋白的分解物。
[0024]圖6是顯示實(shí)驗(yàn)12中純化的HyHEL-1O scFv SAcore多聚體蛋白的場(chǎng)流分級(jí)法圖形(交叉流:2.7ml/分鐘；槽流:1.5ml/分鐘；展開溶劑:0.1M磷酸鈉、pH6.8 ;225nm下的紫外吸收)的圖。分子量利用多角度光散射裝置和Zi_ plot法算出。在峰的前方看到的次要成分推測(cè)是HyHEL-1O scFv SAcore多聚體蛋白的分解物。
[0025]圖7是顯示實(shí)驗(yàn)12中純化的HyHEL-1O scFv SAcore多聚體蛋白的陰離子交換HPLC 圖形(柱 RESOURCE QUml ;流速:0.5ml/分鐘;展開溶劑:20mM Tris-鹽酸鹽、pH8.0 ；洗脫方法:0~0.5M NaCl線性濃度梯度洗脫法、20分鐘；檢測(cè):280nm下的紫外吸收)的圖。在峰的前方、后方看到的次要成分推測(cè)是HyHEL-1O scFv SAcore多聚體蛋白的分解物。
[0026]圖8是顯示實(shí)驗(yàn)12中純化的HyHEL-1O scFv SAcore多聚體蛋白的雞卵清溶菌酶活性抑制率的圖。將溶菌酶和HyHEL-1O scFv SAcore多聚體蛋白以圖中所示的比率進(jìn)行混合，加入到作為溶菌酶底物的微生物懸浮液中，由其吸光度的變化率評(píng)價(jià)殘留的溶菌酶活性，求出相對(duì)于未添加HyHEL-1O scFv SAcore多聚體蛋白時(shí)的溶菌酶活性的抑制率(%)。
[0027]圖9是通過(guò)SDS-PAGE (非還原)分析實(shí)驗(yàn)13中實(shí)施的HyHEL-10 scFv SAcore多聚體蛋白的重折疊步驟的圖。泳道1:提取步驟；泳道2:利用稀釋緩沖液進(jìn)行的50倍稀釋階段；泳道3:置換成含有精氨酸鹽酸鹽的緩沖液的階段；泳道4:利用陰離子交換柱進(jìn)行的純化階段；泳道5:實(shí)驗(yàn)12中得到的純化HyHEL-10 scFv SAcore多聚體蛋白，粗箭頭(—)顯示四聚體的譜帶，細(xì)箭頭(一)顯示單體的譜帶。
【具體實(shí)施方式】
[0028]〔定義〕 在本說(shuō)明書中，“免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)”是指，通過(guò)以二硫鍵結(jié)合的兩個(gè)P結(jié)構(gòu)平面構(gòu)成的穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，通過(guò)在其表面提示的環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠形成與特定的分子強(qiáng)力結(jié)合的親和性分子。還稱作免疫球蛋白折疊(immunoglobulin fold)。分子細(xì)胞生物學(xué),第3版，1227頁(yè)，東京化學(xué)同人，1997年。
[0029]在本說(shuō)明書中，“亞單元結(jié)構(gòu)”是指，通過(guò)非共價(jià)鍵集合而形成穩(wěn)定的多聚體結(jié)構(gòu)的蛋白的、其中的一個(gè)結(jié)構(gòu)單元。分子細(xì)胞生物學(xué)，第3版，51頁(yè)，東京化學(xué)同人，1997年。
[0030]在本說(shuō)明書中，“多聚體結(jié)構(gòu)(多聚體蛋白)”是指，作為其構(gòu)成成分的亞單元結(jié)構(gòu)經(jīng)由非共價(jià)鍵集合而形成的高級(jí)的層次結(jié)構(gòu)，通常亞單元結(jié)構(gòu)的配置是規(guī)則的、對(duì)稱的。分子細(xì)胞生物學(xué)，第3版，51頁(yè)，東京化學(xué)同人，1997年。有時(shí)將具有多聚體結(jié)構(gòu)的蛋白稱作多聚體蛋白。另外，有時(shí)將形成多聚體結(jié)構(gòu)的構(gòu)成成分稱作單體蛋白。
[0031]〔步驟(A):蛋白的準(zhǔn)備〕
本發(fā)明中的構(gòu)成多聚體蛋白的單體蛋白是使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白與能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的其他蛋白融合而得到的單體蛋白。根據(jù)該其他的蛋白所具有的自身集合性?自身結(jié)合性的性質(zhì)，可以形成多聚體結(jié)構(gòu)，可以制備與靶抗原具有多個(gè)親和性部位的多聚體結(jié)構(gòu)的多價(jià)融合蛋白。
[0032]作為具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白，可以列舉:抗雞溶菌酶抗體(例如HyHEL_10、Dl.3)、抗 TNF a 抗體(英夫利昔單抗(infliximab)、阿達(dá)木單抗(adalimumab)、戈利木單抗(goIimumab))、抗HER2抗體(曲妥珠單抗(trastuzumab))、抗CD20抗體(利妥昔單抗(rituximab))、抗VEGF抗體(貝伐珠單抗(bevacizumab))、抗EGFR抗體(西妥昔單抗(cetuximab)、中白尼單抗(panitumumab))等。
[0033]作為能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的其他蛋白，可以列舉:鏈霉親和素、來(lái)自人P53的四聚體化a螺旋結(jié)構(gòu)、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)、或它們的功能性片段等。需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，功能性片段是指能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的蛋白片段，例如可以列舉核心序列型鏈霉親和素。
[0034]作為本發(fā)明中使用的單體蛋白，具體而言，可以列舉scFv與鏈霉親和素的融合蛋白等。更具體而言，可以列舉:HyHEL-10 scFv與鏈霉親和素的融合蛋白、Dl.3 scFv與鏈霉親和素的融合蛋白或HyHEL-10 scFv與核心序列型鏈霉親和素的融合蛋白等。
[0035]本發(fā)明中使用的單體蛋白在微生物的菌體內(nèi)呈不溶性顆粒的形態(tài)。以后，只稱呼“單體多聚體蛋白”時(shí)，還包括在微生物的菌體內(nèi)意圖不溶性顆粒的形態(tài)的單體蛋白的情形，該單體蛋白是指使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白與能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的其他蛋白融合而得到的蛋白。
[0036]本發(fā)明中使用的單體蛋白，可以利用本領(lǐng)域公知的方法、例如Ueda等人，Gene.1993, 129, 129-34.Lin, Y.等人，Cancer Res.2006, 66, 3884-3892.或Fischmann,T.0.等人，J.Biol.Chem.1991，266，12915-12920.Lin, Y.等人，Cancer Res.2006，66，3884-3892.中記載的方法，構(gòu)建目標(biāo)單體蛋白的生產(chǎn)系統(tǒng)，接著利用常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)、集菌，由此即可制得。
[0037]〔步驟⑶:單體蛋白的增溶〕
*表面活性劑的種類
在本發(fā)明中，用于增溶單體蛋白的表面活性劑為月桂酰谷氨酸(月桂酰-Glu)或其鹽。月桂酸_Glu可以是D體、L體、DL體中的任一種。優(yōu)選月桂酸-L_Glu。
[0038]*表面活性劑的濃度
月桂酰-Glu或其鹽優(yōu)選制成I~10%的水溶液，更優(yōu)選制成I~8%的水溶液。當(dāng)為上述濃度范圍時(shí)，可以充分提高單體蛋白的增溶效率，同時(shí)可以適度限制作為之后的操作的稀釋的倍率。
[0039]* pH
關(guān)于該水溶液在25°C下的pH，根據(jù)單體蛋白的性質(zhì)，可以選擇優(yōu)選pH6.5~9.0、更優(yōu)選？117.0~8.8的溫和條件。需要說(shuō)明的是，在本發(fā)明中，pH可以利用安裝有pH電極的pH計(jì)來(lái)測(cè)定。PH的調(diào)節(jié)可以使用氫氧化鈉等堿來(lái)進(jìn)行?？梢允褂镁彌_液作為該水溶液。
[0040]*溫度和時(shí)間
利用如此操作制備的月桂酰-Glu水溶液，得到增溶單體蛋白的溶液。可以向月桂酰-Glu水溶液中添加單體蛋白，也可以向單體蛋白中添加月桂酰-Glu水溶液。
[0041]之后，通常可以在5~40°C下、優(yōu)選15~40°C下放置。當(dāng)為上述范圍時(shí)，由化學(xué)反應(yīng)引起的單體蛋白的切斷或氧化等修飾被抑制在最小限度，因此優(yōu)選。
[0042]放置時(shí)間通常為10分鐘~3小時(shí),優(yōu)選為10分鐘~I小時(shí)。當(dāng)為上述范圍時(shí)，由化學(xué)反應(yīng)引起的單體蛋白的切斷或氧化等修飾被抑制在最小限度，因此優(yōu)選。可以在接觸過(guò)程中進(jìn)行攪拌。
[0043]蛋白是否被增溶，這可以通過(guò)例如目視的濁度判定、或者280nm等的紫外吸收光譜法等來(lái)確認(rèn)。
[0044]〔步驟(C):利用精氨酸緩沖液進(jìn)行的稀釋〕
*稀釋倍率
接著，將步驟(B)中得到的增溶了單體蛋白的溶液，以數(shù)10倍~150倍左右的稀釋倍率稀釋在包含精氨酸或精氨酸衍生物作為添加劑的緩沖液中，直至單體蛋白恢復(fù)天然狀態(tài)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，并維持不變。稀釋后的月桂酰-Glu的濃度優(yōu)選達(dá)到0.01~0.5%，進(jìn)一步優(yōu)選達(dá)到0.02~0.3%。稀釋可以按照I段、多段(分級(jí)梯度)或線性梯度來(lái)適當(dāng)選擇進(jìn)行。
[0045]當(dāng)為上述范圍時(shí)，天然狀態(tài)的高級(jí)結(jié)構(gòu)恢復(fù)得到促進(jìn)，還可確保單體蛋白的穩(wěn)定性，因此優(yōu)選。單體蛋白是否恢復(fù)了天然狀態(tài)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，這可以通過(guò)CD光譜或熒光光譜等分光測(cè)定、或觀察HPLC等蛋白的理化特性的方法、或者酶活性等的高級(jí)結(jié)構(gòu)指標(biāo)來(lái)確認(rèn)。
[0046]添加劑的種類
用作添加劑的精氨酸可以是L型也可以是D型?？梢允躯}酸鹽等與無(wú)機(jī)酸形成的鹽、或者是乙酸鹽等與有機(jī)酸形成的鹽。
[0047]作為精氨酸衍生物，可以列舉:乙酰精氨酸、N- 丁酰精氨酸等具有碳原子數(shù)I~6的?；木彼?；除去了羧基的精胺；導(dǎo)入了羥基以代替a氨基的精氨酸等。作為精氨酸衍生物，優(yōu)選?；彼幔鼉?yōu)選N- 丁酰精氨酸。
[0048]作為添加劑，最優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。
[0049] pH
作為緩沖液，可以使用磷酸鈉、枸櫞酸鈉、Tris-鹽酸鹽等。pH只要是與恢復(fù)天然狀態(tài)的蛋白的性質(zhì)相符的pH即可，穩(wěn)定在大約pH6.5~9.0的中性pH。因此，步驟(C)中的pH只要處于該范圍即可，可以不同于步驟(B)中的pH。pH的調(diào)節(jié)例如可以使用鹽酸或氫氧化鈉等來(lái)進(jìn)行。
[0050]添加劑濃度
添加劑濃度根據(jù)恢復(fù)天然狀態(tài)的蛋白的性質(zhì)分別選擇，但稀釋后的添加劑濃度優(yōu)選調(diào)整成0.1~1.5M，進(jìn)一步優(yōu)選調(diào)節(jié)成0.2~1.2M。當(dāng)為上述范圍時(shí)，天然狀態(tài)的高級(jí)結(jié)構(gòu)恢復(fù)得到促進(jìn)，因此優(yōu)選。
[0051]稀釋溫度?保持時(shí)間
稀釋可以在室溫下實(shí)施，當(dāng)目標(biāo)蛋白恢復(fù)天然狀態(tài)時(shí)的熱穩(wěn)定性不夠高時(shí)，可以在5~10°C下實(shí)施。溫度調(diào)節(jié)可以按照I段、多段(分級(jí)梯度)或線性梯度適當(dāng)選擇進(jìn)行。
[0052]稀釋后，可以保持?jǐn)?shù)小時(shí)~數(shù)天。優(yōu)選保持I小時(shí)~5天，更優(yōu)選保持1.5小時(shí)~3天，進(jìn)一步優(yōu)選保持2小時(shí)~24小時(shí)。可以逐步稀釋。
[0053]分成幾個(gè)階段來(lái)進(jìn)行稀釋時(shí)，在最終階段的稀釋后，只取抵消稀釋倍率的份量，例如利用超濾膜進(jìn)行濃縮，從而將最終階段的稀釋后的蛋白濃度保持在0.01~1.0mg/ml、優(yōu)選0.01~0.5mg/ml,當(dāng)目標(biāo)蛋白包含F(xiàn)ab時(shí),促進(jìn)構(gòu)成Fab的重鏈與輕鏈的二硫鍵形成。
[0054]〔步驟⑶:與緩沖液進(jìn)行置換〕
將步驟(C)中得到的溶液的溶劑與緩沖液進(jìn)行置換。由此，從系統(tǒng)中除去月桂酰-Glu。
[0055]利用緩沖液進(jìn)行的置換采用選自下述(dl)~(d4)的方法來(lái)進(jìn)行，其中，優(yōu)選(dl)的柱層析，更優(yōu)選凝膠過(guò)濾層析:
(dl)選自凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、疏水性相互作用層析和它們的組合的柱層
析；
(d2)超濾法；
(d3)透析法；以及
(d4) (dl)~(d3)中的兩種以上的組合。
[0056]上述操作方法是本領(lǐng)域中使用的慣用方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇?確定操作條件。
[0057]本發(fā)明中使用的緩沖液是pH緩沖液，例如可以使用:在三(羥甲基)氨基甲烷等弱堿性溶液中加入有計(jì)算量的強(qiáng)酸(例如鹽酸、硫酸、甲酸等)的緩沖液、或者在磷酸等弱酸性溶液中加入有計(jì)算量的強(qiáng)堿(例如氫氧化鈉或氫氧化鋰等)稀溶液的緩沖液。[0058]緩沖液中可以含有精氨酸或精氨酸衍生物，也可以含有NaCl等無(wú)機(jī)鹽或EDTA等螯合劑。此時(shí)的濃度例如為0.001~1.2M。
[0059]緩沖液的pH優(yōu)選為6~9。
[0060]利用本發(fā)明的方法，單體蛋白是否形成了多聚體蛋白，這可以通過(guò)紫外吸收、靜態(tài)光散射法等來(lái)確認(rèn)。
[0061]〔任意步驟⑴:用添加劑溶液進(jìn)行稀釋前的放置〕
根據(jù)蛋白，在用精氨酸或精氨酸衍生物緩沖液進(jìn)行稀釋前，可以添加磷酸緩沖溶液等，并進(jìn)行放置。具體而言，在上述步驟⑶與步驟(C)之間添加磷酸緩沖液，使表面活性劑濃度達(dá)到2~5%，之后，優(yōu)選在5~40°C下優(yōu)選放置10分鐘~I小時(shí)，由此可以提高單體蛋白的提取率，可以進(jìn)一步提聞溶解度。其結(jié)果，可以進(jìn)一步提聞蛋白的聞級(jí)結(jié)構(gòu)的恢復(fù)率。此時(shí)得到的溶液在25°C下的pH只要處于pH6.5~9.0的范圍即可。
[0062]〔任意步驟(ii):二硫鍵的形成〕
根據(jù)蛋白，在單一的分子內(nèi)有時(shí)具有二硫鍵。使蛋白進(jìn)行氧化還原反應(yīng)以促進(jìn)這些二硫鍵的形成時(shí)，重折置率進(jìn)一步提聞，因此優(yōu)選。
[0063]氧化還原反應(yīng)可以通過(guò)共存用于促進(jìn)硫醇? 二硫化物交換反應(yīng)以形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵的氧化還原物質(zhì)(例如氧化型谷胱甘肽(GSSG)與還原型谷胱甘肽(GSH)的混合物、或胱氨酸與半胱氨酸的混合物、或胱胺與半胱胺的混合物、或氧化型谷胱甘肽或胱氨酸與巰基乙醇的混合物等))、或用于促進(jìn)空氣氧化的銅離子來(lái)進(jìn)行，也可以通過(guò)改變蛋白的氧化還原電位來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選使用氧化還原物質(zhì)。
[0064]氧化還原反應(yīng)只要`在上述步驟(B)以后進(jìn)行即可，例如可以通過(guò)在上述步驟(C)中將氧化還原物質(zhì)和添加劑一同添加到步驟(A)中得到的溶液中來(lái)進(jìn)行，也可以通過(guò)在上述步驟(C)中在得到稀釋液后向該稀釋液中添加氧化還原物質(zhì)來(lái)進(jìn)行。
[0065]對(duì)于每一種恢復(fù)天然狀態(tài)的蛋白，氧化還原物質(zhì)或銅離子的濃度都調(diào)整至適當(dāng)?shù)臐舛取?br> [0066]此時(shí)的25°C下的pH只要處于pH6.5~9.0的范圍即可。pH的調(diào)節(jié)例如可以使用
鹽酸或氫氧化鈉等來(lái)進(jìn)行。
[0067]液溫可以和步驟⑶中得到的溶液的溫度為相同程度，也可以和步驟(C)中得到的溶液的溫度為相同程度。為了促進(jìn)氧化還原反應(yīng)，優(yōu)選5~48°C左右。
[0068]氧化還原反應(yīng)后，可以在5~48°C下放置I小時(shí)~5天(120小時(shí))左右。
[0069]根據(jù)本發(fā)明的方法，重折疊率至少為10%，往往會(huì)達(dá)到30%。
[0070]〔任意步驟(iii):純化〕
恢復(fù)了高級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白，可以通過(guò)常規(guī)方法、例如超濾、透析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、疏水性相互作用層析、反向?qū)游觥⒂H和層析等進(jìn)行純化。
[0071]在本發(fā)明人的之前的申請(qǐng)(國(guó)際公開第2009-136568號(hào))中報(bào)道了:使用I~3%的預(yù)定的?；劝彼岜砻婊钚詣┰赑H6.5~9.0下增溶改性蛋白，之后，使用精氨酸緩沖液進(jìn)行稀釋，使表面活性劑濃度降低至0.02~0.5%，由此可以有效地重建蛋白結(jié)構(gòu)。
[0072]雖然多聚體蛋白具有通過(guò)非共價(jià)鍵締合的若干個(gè)亞單元，但即使使用預(yù)定的?；劝彼岜砻婊钚詣?月桂酰-L-Glu)在預(yù)定pH下增溶多聚體蛋白，之后僅憑用精氨酸緩沖液進(jìn)行稀釋，也無(wú)法結(jié)束重折疊。雖然不拘泥于任何的理論，但推測(cè)是亞單元間的締合被月桂酸_L-Glu抑制。
[0073]本發(fā)明有悖于此，雖然不拘泥于任何的理論，但本發(fā)明推測(cè)如下:通過(guò)用月桂酰-L-Glu抑制亞單元間的締合，起初只是促進(jìn)亞單元的結(jié)構(gòu)形成，之后用緩沖液置換認(rèn)為是抑制締合的因子的月桂酰-L-Glu而將其除去，其結(jié)果，引起亞單元之間的締合，結(jié)束重折疊。
[0074]使用如此操作而制備的多聚體蛋白，可以得到癌癥、免疫疾病、生活習(xí)慣病等各種疾病的治療藥、臨床檢查用試劑、研究用試劑等。這些藥物組合物除了含有通過(guò)本發(fā)明的方法得到的多聚體蛋白外，還可以含有賦形劑或載體等。
實(shí)施例
[0075]〔參考例I〕
包含HyHEL-10 scFv SA全長(zhǎng)的不溶性顆粒的沉淀物的制備
構(gòu)建以大腸桿菌BL21株(DE3)為生產(chǎn)宿主的、單鏈抗體可變區(qū)(HyHEL-10 scFv)與全長(zhǎng)型鏈霉親和素(SA全長(zhǎng))的融合蛋白(HyHEL-10 scFv SA全長(zhǎng))的生產(chǎn)系統(tǒng)(Ueda等人，Gene.1993，129，129-34.Lin, Y.等人，Cancer Res.2006，66，3884-3892.)。
[0076]按照常規(guī)方法，使用帶有擋板的三角燒瓶，將所構(gòu)建的生產(chǎn)菌在2XYT培養(yǎng)基中、在28°C下振蕩培養(yǎng)18小時(shí)(4L)，使HyHEL-10 scFv SA全長(zhǎng)在大腸桿菌的菌體內(nèi)以不溶性顆粒的形式蓄積。收集其菌體，懸浮于20mM Tris-鹽酸鹽、0.5M NaCl、pH8.1中，進(jìn)行超聲波破碎。將得到的懸浮液在6000g、30分鐘的條件下進(jìn)行離心分離，回收包含HyHEL-10 scFvSA全長(zhǎng)不溶性顆粒的沉淀物。
[0077]回收的沉淀物依次用2%的Triton X-100水溶液、丙酮進(jìn)行清洗。之后，用純凈水(^ ') Q水)清洗，完全除去Triton X-100。再次在上述條件下進(jìn)行離心分離操作，得到包含不溶性顆粒的沉淀物。
[0078]將得到的每IOOmg的沉淀物分到4支Eppendorf離心管中。將各管稱作管I~4。
[0079]需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，只要沒有特別說(shuō)明，則單位“％”是指“質(zhì)量％”。
[0080]〔參考例2〕
包含Dl.3 scFv SA全長(zhǎng)的不溶性顆粒的沉淀物的制備
在參考例I中，除了使用Dl.3 scFv作為單鏈抗體可變區(qū)來(lái)代替HyHEL-10 scFv,構(gòu)建其與全長(zhǎng)型鏈霉親和素(SA全長(zhǎng))的融合蛋白(D1.3 scFv SA全長(zhǎng))的生產(chǎn)系統(tǒng)(Fischmann, T.0.等人，J.Biol.Chem.1991，266，12915-12920.Lin, Y.等人，Cancer Res.2006, 66，3884-3892.)以外，進(jìn)行與參考例I相同的操作，得到包含Dl.3scFv SA全長(zhǎng)的不溶性顆粒的沉淀物。
[0081]〔實(shí)驗(yàn)1〕
(I)制備5%的月桂酰-L-Glu溶液(20mM磷酸鈉、pH8.5)。
[0082](2)將該溶液中的0.2ml加入到管I中、0.25ml加入到管2中、0.3ml加入到管3中、0.35ml加入到管4中,增溶管中的沉淀物。將管I~4在室溫下渦旋后,輕輕地進(jìn)行離心分離(10000rpm、l分鐘)，消去所產(chǎn)生的泡。
[0083](3)向各管中加入20mM的磷酸鈉(pH7)，定容至0.5ml，將管I~4的最終的月桂酰-L-Glu濃度分別調(diào)整至2.0%、2.5%、3.0%、3.5%。使用微小pH電極將管內(nèi)的pH調(diào)節(jié)至7.3左右，之后在37°C下加熱30分鐘，從沉淀物中提取不溶性顆粒，使其溶解。需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，只要沒有特別說(shuō)明，則在25°C下測(cè)定pH。
[0084](4)將得到的各溶液轉(zhuǎn)移到另外的Eppendorf離心管中，在14000rpm(18700 Xg)下離心分離10分鐘，回收上清I~4。
[0085](5)作為稀釋用溶液，制備0.404M的精氨酸鹽酸鹽溶液(ImM EDTA、80mM Tris-鹽酸鹽、pH7.2)。
[0086](6)使用7.425ml的該稀釋用溶液，在5 °C下稀釋之前回收的各0.075ml的上清I~4，最終分別調(diào)整成0.1%的月桂酰-L-Glu、0.4M的精氨酸鹽酸鹽(ImM EDTA、80mMTris-鹽酸鹽、pH7.2、7.5ml)。蛋白濃度調(diào)整至0.05mg/ml。
[0087](7)已稀釋的上清I~4在5°C下保持18小時(shí)，之后用離心分離型超濾膜(AmiconUltra 15、分子量截留IOkDa ;MiIIipore制)濃縮3倍，調(diào)整至2.5ml。
[0088](8)將各2.5ml的3倍濃縮液負(fù)載到用緩沖液(50mM Tris-鹽酸鹽、0.2M NaCl,ImM EDTA、pH7.2)事先平衡好的凝膠過(guò)濾用柱(PD-10柱、GE Healthcare制)上，接著，用
3.0ml相同的緩沖液展開，回收全量的濃縮液。由此，用緩沖液置換柱內(nèi)的濃縮液。
[0089](9)將這些濃縮液在5°C下保持18小時(shí)后，在14000rpm(18700Xg)下離心分離10分鐘。將 30//L 該上清供給凝膠過(guò)濾 HPLC (柱:Superdex 200 10/300 GL, GE Healthcare制；展開液:0.1M磷酸鈉、0.8M精氨酸鹽酸鹽、pH6.8 ;檢測(cè)方法:225nm的紫外吸收；定量用標(biāo)準(zhǔn)品:純化抗血管性血友病因子單克隆抗體(W096/17078))，定量已形成四聚體結(jié)構(gòu)的HyHEL-10 scFv SA全長(zhǎng)。結(jié)果見表1。
[0090][表 I]
【權(quán)利要求】
1.多聚體蛋白的制備方法，所述多聚體蛋白是由使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白和能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的蛋白或其功能性片段融合而得到的單體蛋白組成的，該制備方法包括下述步驟: 步驟(A)，準(zhǔn)備在微生物的菌體內(nèi)呈不溶性顆粒形態(tài)的蛋白，該蛋白為使具有免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的蛋白與能夠形成亞單元結(jié)構(gòu)的其他蛋白融合而得到的單體蛋白； 步驟(B)，利用含有月桂酰谷氨酸或其鹽的水溶液增溶步驟(A)中準(zhǔn)備的單體蛋白；步驟(C)，在含有精氨酸或精氨酸衍生物的緩沖液中稀釋步驟(B)中得到的溶液，降低月桂酰谷氨酸或其鹽的濃度；以及 步驟(D)，利用選自下述(dl)~(d4)的方法，將步驟(C)中得到的溶液的溶劑置換成緩沖液， (dl)選自凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、疏水性相互作用層析和它們的組合的柱層析； (d2)超濾法； (d3)透析法；以及 (d4) (dl)~(d3)中的兩種以上的組合。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，單體蛋白為scFv與鏈霉親和素的融合蛋白。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中，上述scFv選自HyHEL-1OscFv和Dl.3 ScFv0
4.權(quán)利要求2或3所述的`方法，其中，鏈霉親和素為全長(zhǎng)鏈霉親和素或其功能性片段。
5.權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，精氨酸或精氨酸衍生物選自具有碳原子數(shù)I~6的?；木彼帷⒕彼岫□?、精胺和精氨酸。
6.權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，精氨酸或精氨酸衍生物為精氨酸鹽酸鹽。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK103608463SQ201280030917
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月23日
【發(fā)明者】江島大輔, 佐藤春奈, 津本浩平, 伊達(dá)雅代 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社