專利名稱：一種可提高蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的短肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種可提高蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的短肽。
背景技術(shù)：
植物生物反應(yīng)器指通過基因工程途徑，以整株植物或植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物作為 “化學(xué)工廠”，通過大規(guī)模培養(yǎng)，生產(chǎn)具有高經(jīng)濟(jì)附加值的醫(yī)用蛋白(活性多肽、人疫苗、抗體等)、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料及其它一些次生代謝產(chǎn)物等的方法。植物生物反應(yīng)器與動(dòng)物和微生物生物反應(yīng)器相比，具有生產(chǎn)成本較低，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)物無毒副作用，安全性好等特性。當(dāng)用動(dòng)物或其細(xì)胞作為生物反應(yīng)器時(shí)，在培養(yǎng)過程中很可能會(huì)感染病毒，而這些病毒對(duì)人類健康具有潛在的危害；細(xì)菌作為生物反應(yīng)器多用來生產(chǎn)特定的蛋白，但細(xì)菌不能對(duì)目的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工及修飾，且細(xì)菌本身可能是人類病原物。植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)特定的蛋白或代謝產(chǎn)物時(shí)，不含致病微生物或潛在的致病微生物，對(duì)人畜安全，大大提高了表達(dá)產(chǎn)物的生物安全性。并且，在植物中所表達(dá)的蛋白能夠進(jìn)行正確的糖基化、磷酸化、酰胺化及翻譯后的加工，因此，所表達(dá)產(chǎn)物與高等動(dòng)物細(xì)胞的產(chǎn)物具有相當(dāng)?shù)纳锘钚院兔庖咴?，是用來生產(chǎn)醫(yī)用蛋白的理想材料。1989年，Hiatt等報(bào)道了從小鼠中克隆IgG的重鏈和輕鏈基因?qū)霟煵荼磉_(dá)免疫球蛋白，就此開創(chuàng)了植物抗體的先河。Benvenuto等報(bào)道了將編碼重鏈可變區(qū)(VH)的基因在煙草中表達(dá)，其表達(dá)量約占可溶性蛋白的1.0%。Duing等利用大麥α-淀粉酶的信號(hào)肽序列分別和編碼成熟單克隆抗體重鏈、輕鏈的cDNA構(gòu)建成重組基因，轉(zhuǎn)化到煙草中表達(dá)， 用親和層析法分析證明重組抗體具有生物活性。Firek等報(bào)道了 Single chain Fv (Sc Fv, 單鏈Fv)在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在k Fv的N-端整合有信號(hào)肽序列raia的情況下，其轉(zhuǎn)化的煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系要比轉(zhuǎn)化不含信號(hào)序列的^Fv的煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系積累的& Fv蛋白量要高。2005年，Hull等報(bào)道了在煙草中表達(dá)炭疽桿菌保護(hù)抗原的特異性單克隆抗體，且在活體內(nèi)或體外均表現(xiàn)出消除毒素活性的作用。Shchelkimov等將編碼艾滋病病毒中致免疫的ENV、GAC抗原表位及乙肝表面抗原的嵌合基因?qū)敕巡⒌靡员磉_(dá)，研究了一種能同時(shí)抗兩種病毒的疫苗。Fitchen等將小鼠ZP3蛋白的一個(gè)含13個(gè)氨基酸殘基的抗原決定簇表達(dá)在煙草花葉病毒的衣殼蛋白中，用受感染植物中提取的含融合蛋白的病毒樣顆粒免疫小鼠，結(jié)果產(chǎn)生了抗ZP3的特異性血清抗體。這些研究表明了利用植物細(xì)胞生產(chǎn)人類所需各種蛋白的可行性。到目前為止，人們利用植物生物反應(yīng)器已經(jīng)成功地表達(dá)的重組蛋白有人胰島素、 紅細(xì)胞生成素、干擾素、溶菌酶、人生長(zhǎng)激素、人表皮生長(zhǎng)因子、人凝血因子、白細(xì)胞介素、人血紅蛋白、人血清蛋白等。但是，在植物反應(yīng)器研究中存在一個(gè)較為突出的問題，即目標(biāo)蛋白的表達(dá)量低。生產(chǎn)植物疫苗或在植物中表達(dá)抗體以及藥用蛋白，其表達(dá)量必須達(dá)到一定水平時(shí)才具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值。因此，建立高效穩(wěn)定的新型植物生物反應(yīng)器技術(shù)體系，提高外源蛋白在植物細(xì)胞或植物生物反應(yīng)器中的表達(dá)水平具有重要產(chǎn)業(yè)價(jià)值。使用特定的信號(hào)肽指引目標(biāo)蛋白定向到合適的亞細(xì)胞部位(如細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)外體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、葉綠體、液泡等)， 被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白高效表達(dá)的有效方法。例如，利用葉綠體基因組拷貝數(shù)多的特點(diǎn)，將外源基因整合到葉綠體基因組中，可使其拷貝數(shù)達(dá)到100 10 000個(gè)/細(xì)胞，可明顯提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的積累。Kmi等將融合了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列(SEKDEL)的霍亂毒素β 亞單位在萵苣中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白有較高水平的積累?？梢?，尋找特定的信號(hào)肽，是建立高效、穩(wěn)定的植物生物反應(yīng)器蛋白表達(dá)體系的重要途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可提高蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，命名為SP。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種編碼SP短肽的核苷酸序列，其堿基序列如SEQ ID NO 2 所示。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種含有堿基序列如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體為植物表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供SP短肽在利用植物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供所述表達(dá)載體在生產(chǎn)蛋白質(zhì)中的應(yīng)用，所述植物表達(dá)載體在生產(chǎn)蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)1)克隆Sali3_2基因及編碼SP短肽的核苷酸序列片段；2)構(gòu)建SP-GFP融合蛋白植物表達(dá)載體pCAMBIA1302_SP_GFP ；3)將植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-SP-GFP利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)SP-GFP基因煙草懸浮細(xì)胞；4) SP-GFP的亞細(xì)胞定位；5)提取轉(zhuǎn)基因煙草懸浮細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，并用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)GFP 及SP-GFP細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，證明轉(zhuǎn)SP-GFP基因細(xì)胞系中的GFP的積累量約為轉(zhuǎn)GFP 基因細(xì)胞系的3倍。本發(fā)明克隆了一種編碼SP短肽的核苷酸序列，構(gòu)建pCAMBIA1302-SP-GFP植物表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)SP-GFP基因煙草，以表達(dá)SP-GFP。對(duì)比分析轉(zhuǎn)GFP和轉(zhuǎn) SP-GFP的細(xì)胞系中GFP的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1) SP的存在可使目的蛋白在表達(dá)后儲(chǔ)存到植物細(xì)胞液泡中；2) SP的存在可提高細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的積累量。與對(duì)照的無SP片段的目的基因相比，有SP的融合基因在煙草細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量提高了 200%。轉(zhuǎn)SP-GFP的細(xì)胞其GFP 積累于液泡中，并且該細(xì)胞中GFP的積累量要是轉(zhuǎn)GFP的細(xì)胞中的積累量的3倍之多。證明SP短肽在植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)目的蛋白時(shí)對(duì)提高目的蛋白的表達(dá)量有重要應(yīng)用價(jià)值。


圖1植物表達(dá)載體pCAMBIA1302質(zhì)粒圖譜；圖 2 表達(dá)載體 pCAMBIA1302-SALI3-2-GFP 質(zhì)粒圖譜；圖3SALI3-2蛋白氨基酸序列結(jié)構(gòu)示意圖4表達(dá)載體pCAMBIA1302-SP-GFP構(gòu)建流程圖；圖5在潮霉素抗性平板上篩選的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞圖(自左至右分別為未轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了 GFP的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了 SP-GFP的細(xì)胞)；圖6轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞中的熒光分布圖(上轉(zhuǎn)PCAMBIA1302-SP-GFP的煙草細(xì)胞， 下轉(zhuǎn)pCAMBIA1302的煙草細(xì)胞；左暗視野下，中激發(fā)光下，右合并后；紅色為細(xì)胞膜染料FM4-64發(fā)光情況，激發(fā)光波長(zhǎng)M3nm ；綠色為GFP融合蛋白發(fā)光情況，激發(fā)光為488nm ；黃色為合并后紅、綠熒光共定位；Bar = 20ym)；圖7BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖8表達(dá)GFP，S-GFP蛋白的煙草細(xì)胞提取液?jiǎn)挝缓量说鞍椎南鄬?duì)熒光強(qiáng)度；圖9蛋白SDS-PAGE和蛋白免疫印跡，1.轉(zhuǎn)SP-GFP的細(xì)胞蛋白提取液，2.轉(zhuǎn)GFP 的細(xì)胞蛋白提取液，3.未轉(zhuǎn)基因細(xì)胞蛋白提取液；上考馬司亮蘭染色，下jestern-blot， 一抗anti-GFP (來源于兔)，二抗HRP-IgG (羊抗兔)；圖10流式細(xì)胞儀比較細(xì)胞中的平均熒光強(qiáng)度圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)路線做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1克隆Sali3_2基因及編碼SP短肽的核苷酸序列片段以大豆(Glycine max. L)白農(nóng)六號(hào)(由吉林省白城農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供)未成熟種子的cDNA為模版，進(jìn)行聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)，獲得插入的目的基因片段&ili3-2。在該片段中含有編碼SP短肽的核苷酸片段。PCR引物如下所示SF 5' -cacaggat jccatggt aatttcgatgctcag-3 ‘,帶有 Nco I 酶切位點(diǎn)SR 5' -tgcgc Itctagat aacaacaacgttagtctgatagga-3‘,帶有 XbaI 的酶切位點(diǎn)實(shí)施例2構(gòu)建SP-GFP融合蛋白植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-SP_GFP首先，構(gòu)建植物表達(dá)載體 PCAMBIA1302-SALI3-2-GFP 設(shè)定引物 SF (5, -cacaggat |ccatggj aatttcgatgctcag-31，帶有 Nco I 酶切位點(diǎn)) 和 SR(5 ‘ -tgcgc jtctagaj aacaacaacgttagtctgatagga-3 ‘,帶有 XbaI 的酶切位點(diǎn))，以大豆(Glycine max. L)白農(nóng)六號(hào)(由吉林省白城農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供)未成熟種子的cDNA 為模版，進(jìn)行聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)，獲得插入的目的基因片段&ili3_2。將獲得的&ili3-2 目的基因片段利用Nco I和)(ba I進(jìn)行雙酶切并獲得酶切產(chǎn)物；利用Nco I和Spe I對(duì) PCAMBIA1302質(zhì)粒(質(zhì)粒圖譜如圖1所示)進(jìn)行雙酶切，并獲得載體酶切產(chǎn)物；連接插入片段Sali3-2和載體酶切片段，轉(zhuǎn)化TOPlO大腸桿菌，鑒定獲得&ili3-2_GFP融合表達(dá)載體 pCAMBIA1302-Sali3-2-GFP(質(zhì)粒圖譜如圖2所示)，Sali3_2基因片段位于35S啟動(dòng)子和 GFP基因之間，即片段順序?yàn)?5S-Sali3-2-GFP。其次，獲得35S-SP核苷酸片段，構(gòu)建SP-GFP融合蛋白植物表達(dá)載體 PCAMBIA1302-SP-GFP大豆SALI3-2蛋白由276個(gè)氨基酸組成，利用Expasy網(wǎng)的軟件分析，發(fā)現(xiàn)大豆 SALI3-2蛋白N端為一信號(hào)肽序列，其斷裂位點(diǎn)可能發(fā)生于第19與第20位氨基酸之間(SignalP 3. 0 server)，中間53個(gè)氨基酸為保守片段，C端包含有完整的BURPdomain保守序列(如圖3所示)。由于信號(hào)肽只有19個(gè)氨基酸，在pCAMBIA1302的第9787位自帶Hind III，設(shè)計(jì)上游引物SPF(5 ‘ -gcatgc jaagcttl ggcactgg-3 ‘，帶有Hind III酶切位點(diǎn))，下游引物 SPR (5 ‘ -gcatg jactagtj gctctctcctgcaagag-3 ‘，帶有 Spe I 的酶切位點(diǎn))，以質(zhì)粒 PCAMBIA1302-SALI3-2-GFP為模板，利用該對(duì)引物進(jìn)行聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)(PCR反應(yīng)條件為 94°C，30s ；55°C,60s ；72°C，30s，26 個(gè)循環(huán)后 72°C延伸 IOmin)，獲得 35S-SP 核苷酸片段的PCR產(chǎn)物，利用Hind III和Spe I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切并獲得插入片段35S-SP ；利用Hind III和Spe I對(duì)pCAMBIA1302質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并獲得酶切后的載體片段；將獲得的目的基因片段和載體酶切片段用T4連接酶在18°C下進(jìn)行連接過夜。利用常規(guī)的CaCl2 處理轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO大腸桿菌，經(jīng)卡那霉素抗性平板篩選獲得陽性克隆，并進(jìn)行菌落PCR鑒定(使用引物SPF和SPR，PCR反應(yīng)條件為94°C，30s ；55 °C,60s ；72 °C, 30s, 30個(gè)循環(huán)后72°C延伸lOmin。獲得產(chǎn)物長(zhǎng)度為760bp)，獲得SP-GFP融合表達(dá)載體 PCAMBIA1302-SP-GFP,如圖4所示，SP片段位于35S啟動(dòng)子和GFP基因之間，即片段順序?yàn)?5S-SP-GFP。再經(jīng)上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序確認(rèn)了構(gòu)建的重組質(zhì)粒的正確性。其中SP片段的核苷酸序列如SEQ ID NO :2，具體為atggaatt tcgatgctca gtcatctctt ttaccattct cttctctctt gctcttgcag gagagagc,對(duì)應(yīng)的氨基酸序歹丨J如 SEQ ID N0:1,具體為MEFRCSVISFTILFSLALAGES，共22個(gè)氨基酸，前19個(gè)氨基酸為推測(cè)的信號(hào)肽序列。實(shí)施例3煙草懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化將pCAMBIA1302-SP-GFP載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LB4404，篩選并鑒定獲得轉(zhuǎn)入了 PCAMBIA1302-SP-GFP的農(nóng)桿菌。挑取該根癌農(nóng)桿菌陽性單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含有50mg/L Kan和50mg/LRif)中，28°C振蕩培養(yǎng)36 48h ；取ImL農(nóng)桿菌菌液擴(kuò)接于50mL LB液體培養(yǎng)基(含有50mg/L Kan和50mg/L Rif)中，振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為0. 5取 ImL農(nóng)桿菌菌液，4000rpm離心2min，棄上清；加入等體積的煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液重懸沉淀， 取200 μ L農(nóng)桿菌加入到5mL培養(yǎng)4天的煙草懸浮細(xì)胞中，再加入5 μ L 100 μ M乙酰丁香酮 (AS)，混勻，26°C靜止培養(yǎng)，兩天后收集共培養(yǎng)物于1. 5mL的EP管，低速離心，然后用煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，將煙草懸浮細(xì)胞涂布于篩選培養(yǎng)基上(含有Hyg 50mg/L和 Cef250mg/L)J8°C，避光培養(yǎng)，4-6 周。由圖5可知，非轉(zhuǎn)基因的煙草細(xì)胞在篩選平板上沒有細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)染了 GFP 和SP-GFP的細(xì)胞在平板上均有細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織，細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織即為轉(zhuǎn)基因的候選細(xì)胞團(tuán)。取這些細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到新鮮的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，2周后轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，經(jīng)PCR擴(kuò)增SP片段、GFP和抗潮霉素基因片段進(jìn)行鑒定，確定為轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系。實(shí)施例4 SP-GFP的亞細(xì)胞定位用移液槍吸取50 μ L繼代時(shí)間為4 5天、分裂旺盛的煙草懸浮細(xì)胞到激光共聚焦專用皿，再滴加5 μ L的膜染料FM4-64 (濃度為5 μ mol/L)，混勻，在OlympusFVlOOO型激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的分布情況。激發(fā)光為488nm、吸收光為500 550nm 觀察SP-GFP綠色熒光；激發(fā)光為546nm、吸收光為430-640nm觀察FM4-64標(biāo)記的細(xì)胞膜， 采圖時(shí)，圖像中的標(biāo)記物顏色為紅色。
由圖6可見，轉(zhuǎn)染了 SP-GFP的細(xì)胞其細(xì)胞內(nèi)綠色熒光分布在液泡中，轉(zhuǎn)染了 GFP 的細(xì)胞其綠色熒光分布在細(xì)胞質(zhì)、核中。實(shí)施例5總蛋白定量提取總蛋白取生長(zhǎng)旺盛的懸浮細(xì)胞，在4°C，3000rpm條件下離心5min，去掉培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。然后將細(xì)胞放到加好液氮的研缽中研磨，200mg的粉末中加進(jìn)500ul冷的蛋白裂解液(50mM Tris-HCl, pH8. 0 ;150mM Nacl ；0. 001 %聚乙烯吡咯烷酮；0. 02 %疊氮鈉)，混勻后，在4°C條件下振蕩 15-20分鐘。在4°C，12000rpm條件下離心15分鐘?？焖賹⑸锨逦M(jìn)另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白?？偟鞍锥坷肂radford試劑(如表1所示)對(duì)蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue G-250)染色?？捡R斯亮藍(lán)-蛋白質(zhì)的結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比。表 1 Brandford i式齊[J [Bradford, 1976]
權(quán)利要求
1.一種可提高蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0:1ο
2.編碼權(quán)利要求1所述短肽的核苷酸序列，其堿基序列如SEQID N0:2所示。
3.含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求3所述表達(dá)載體為植物表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求1所述短肽在利用植物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述表達(dá)載體在生產(chǎn)蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求4所述植物表達(dá)載體在生產(chǎn)蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，公開了一種可提高蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO1。本發(fā)明構(gòu)建了SP-GFP融合蛋白植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-SP-GFP；將植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-SP-GFP利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)SP-GFP基因煙草懸浮細(xì)胞；提取轉(zhuǎn)基因煙草懸浮細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，并用流式細(xì)胞儀分析GFP及SP-GFP的平均熒光強(qiáng)度，證明轉(zhuǎn)SP-GFP基因細(xì)胞系中的GFP的積累量約為轉(zhuǎn)GFP基因細(xì)胞系的3倍。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102321161SQ20111027170
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者唐玉林, 歐忠華, 鄭易之 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)