專利名稱：細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13多克隆抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白抗體的制備，尤其是涉及一種細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13(importin13簡稱imp 13)的多克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
真核細(xì)胞中大分子(蛋白質(zhì)和核酸)在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的轉(zhuǎn)移，是細(xì)胞最重要的功能之一?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，許多疾病的產(chǎn)生和發(fā)育的紊亂與細(xì)胞中蛋白質(zhì)的正確定位有極大的關(guān)聯(lián)。imp 13蛋白質(zhì)是細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體家族(importinβsuperfamily)中的一個新成員(Mingot et al.，Importin 13a novel mediator of nuclear import and export，The EMBO Journal，2001，20(14)3685-3694)，它指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多個功能蛋白的入核及出核過程。它也是目前在importinβ家族中所發(fā)現(xiàn)的唯一受發(fā)育時期和激素調(diào)控的細(xì)胞核質(zhì)受體蛋白(Zhang et al.，A Novel Karyopherin-βHomolog Is Developmentally and HormonallyRegulated in Fetal Lung，American Journal of Respiratory Cell Molecular Biology，2000，22451-459)，同時也是唯一發(fā)現(xiàn)的其細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移速度受發(fā)育調(diào)控的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白(Tao et al.，Nucleocytoplasmic Shuttling of lgl2 Is DevelopmentallyRegulated in Fetal Lung，American Journal of Respiratory Cell Molecular Biology，2004，30350-359)。獲得imp 13的相應(yīng)的抗體，對精確定位內(nèi)源的imp 13蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞中的分布有著重要的作用，從而更真實(shí)地反映它的生物學(xué)功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13抗體制備方法存在的不足，至今已知得到的imp 13的抗體是用體外合成的C端的20個左右氨基酸的多肽(Mingot et al.，Importin 13a novel mediator of nuclear import and export，The EMBO Journal，2001，20(14)3685-3694)作為抗原得到的抗體，因而它只能識別imp 13蛋白C端的氨基酸序列，為此提供一種以在生物體內(nèi)表達(dá)的具有生物活性的imp 13的全長蛋白做抗原制備抗imp 13多克隆抗體的方法。
本發(fā)明所述的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的多克隆抗體制備方法，其步驟為1)將表達(dá)全長細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13蛋白質(zhì)的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-imp 13轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的BL21到0D值為0.5～1.0；3)在培養(yǎng)的大腸桿菌BL21中加入IPTG至0.1-0.5mM，誘導(dǎo)；4)將誘導(dǎo)后的菌體離心收集，用PBS重懸，先加入DTT至終濃度1～10mM，后加溶菌酶溶菌，再超聲波破碎，把破碎后的菌液離心，收集上清；5)將上清與Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，孵育后離心收集beads；6)用谷胱甘肽洗脫下細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13；7)用純化后的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13作為抗原免疫兔子，得到細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的抗體，用不完全福氏佐劑加強(qiáng)；8)測抗細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的血清效價，取血，得到相應(yīng)的抗血清。
在步驟2)中，所述的培養(yǎng)其溫度為37℃。
在步驟3)中，所述的誘導(dǎo)其溫度最好為25℃，時間最好為2.5～5h。
在步驟4)中，所述的PBS其pH值為8.0，加入的DTT濃度最好為5mM，加溶菌酶溶菌的時間為30～60min，超聲波破碎最好35次，每次6s；然后把破碎后的菌液在4℃下，10000rpm離心10min，收集上清。
在步驟5)中，把上清與Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，最好在4℃下孵育過夜，第二天4℃下，500rpm離心5min收集beads。
在步驟6)中，用10mM谷胱甘肽洗脫下細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13。
在步驟7)中，所述的用純化后的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13作為抗原免疫兔子最好采用每只兔子每次用抗原蛋白200μg，間隔1周后用不完全福氏佐劑加強(qiáng)，連續(xù)4次。
在步驟8)中，所述的取血是在免疫第4次后1周取血，所測血清效價應(yīng)＞10000，若所測血清效價≤10000，則需再進(jìn)行免疫。
與現(xiàn)有的制備方法相比，由于用此方法得到的抗體是用在生物體內(nèi)自然合成的全長imp13蛋白做抗原得到的，imp 13蛋白的結(jié)構(gòu)沒有改變，因此得到的imp 13抗體不僅可以免疫變性后的imp 13線性蛋白，而且可以免疫有活性的具天然構(gòu)象imp 13蛋白，同時特異性很強(qiáng)。在以下的實(shí)施例中將結(jié)合圖1和圖2用Western blot和免疫熒光反應(yīng)來鑒定本發(fā)明的imp 13抗體不僅可以免疫變性的imp 13線性蛋白，而且還可以免疫具活性的imp 13蛋白以及此抗體的特異性。


圖1為用自制的imp 13抗體和抗HA的抗體(對照)所做的Western blot圖。在圖1A中，用自制的imp 13抗體抗細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)及轉(zhuǎn)染pIMP13-HA質(zhì)粒的293T細(xì)胞表達(dá)的IMP 13蛋白。其中，1、imp 13純化蛋白；2、PC 12細(xì)胞；3、293T細(xì)胞；4、轉(zhuǎn)染了pIMP13-HA質(zhì)粒的293T細(xì)胞。在圖1B中，用抗HA抗體做轉(zhuǎn)染pIMP13-HA的293T細(xì)胞的Western blot檢測，以此作為陽性對照。
圖2為在PC 12細(xì)胞中用自制的imp 13的抗體所做的免疫熒光染色圖。
圖3為在HeLa細(xì)胞中用自制的imp 13的抗體所做的免疫熒光染色圖。
圖4為imp 13蛋白純化電泳圖。在圖4中，1、marker；2、沒有用IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白；3、用IPTG誘導(dǎo)后的菌體蛋白；4、菌體裂解后的上清；5、純化的imp 13蛋白。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例11、培養(yǎng)BL21。把重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，37℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的BL21到OD值0.7。圖4第2道給出培養(yǎng)的未加IPTG誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)化了表達(dá)重組質(zhì)粒的BL21全菌蛋白電泳圖。
2、在BL21中誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13。在培養(yǎng)的大腸桿菌BL21培養(yǎng)液中加入IPTG至0.15mM，25℃誘導(dǎo)4h。圖3第3道給出誘導(dǎo)后的目的蛋白表達(dá)的BL21全菌蛋白電泳圖。
3、裂解表達(dá)細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的BL21。把誘導(dǎo)后的菌體離心收集后，用PBS(pH8.0)重懸，加DTT至終濃度5mM，加溶菌酶溶菌1h，再超聲波破碎35次，每次6s。然后把破碎后的菌液在4℃條件下，10000rpm離心10min，收集上清。圖4第4道給出表達(dá)目的蛋白的BL21裂解后上清中的蛋白電泳圖。
4、細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13與Glutathione-Sepharose-4B親合結(jié)合。將上清與Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃孵育過夜后再于4℃500rpm離心5min，收集beads。
5、層析法純化得到有生物活性的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13。用10mM谷胱甘肽從beads上洗脫下細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13。圖4第5道給出細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13純化后的情況。
6、用純化的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13做抗原去免疫兔子。每只兔子每次用抗原蛋白150μg，間隔1周后用不完全福氏佐劑加強(qiáng)。連續(xù)4次。
7、得到了細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的抗體。于免疫第4次后1周取少量血清，測效價＞10000，取血，得到相應(yīng)的抗血清。
所得到的抗體是用在生物體內(nèi)自然合成的全長imp 13蛋白做抗原得到的，imp 13蛋白的結(jié)構(gòu)沒有改變，不僅可以免疫變性后的imp 13線性蛋白，而且可以免疫有活性的具天然構(gòu)象imp 13蛋白，而且特異性很強(qiáng)。圖1和圖2就是用Western blot和免疫熒光反應(yīng)來鑒定本發(fā)明imp 13抗體的，不僅可以免疫變性的imp 13線性蛋白，而且還可以免疫具活性的imp 13蛋白以及此抗體的特異性。
實(shí)施例2與實(shí)施例1類似，其不同在于把重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，37℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的BL21到OD值0.5。在培養(yǎng)的大腸桿菌BL21培養(yǎng)液中加入IPTG至0.5mM，25℃誘導(dǎo)2.5h。裂解表達(dá)細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的BL21。把誘導(dǎo)后的菌體離心收集后，用PBS(pH8.0)重懸，加DTT至終濃度1mM，加溶菌酶溶菌30min，再超聲波破碎30次，每次6s。然后把破碎后的菌液在4℃條件下，11000rpm離心8min，收集上清。細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13與Glutathione-Sepharose-4B親合結(jié)合。將上清與Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃孵育過夜后再于4℃500rpm離心5min，收集beads。用純化的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13做抗原去免疫兔子。每只兔子每次用抗原蛋白200μg，間隔1周后用不完全福氏佐劑加強(qiáng)，連續(xù)4次。得到了細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的抗體。于免疫第4次后1周取少量血清，測效價＞10000，取血，得到相應(yīng)的抗血清。
實(shí)施例3與實(shí)施例1類似，其不同在于把重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，37℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的BL21到OD值1.0。在培養(yǎng)的大腸桿菌BL21培養(yǎng)液中加入IPTG至0.3mM，25℃誘導(dǎo)3h。把誘導(dǎo)后的菌體離心收集后，用PBS(pH8.0)重懸，加DTT至終濃度5mM，加溶菌酶溶菌40min，再超聲波破碎40次，每次5s。然后把破碎后的菌液在4℃條件下，9500rpm離心12min，收集上清。將上清與Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃孵育過夜后再于4℃450rpm離心6min，收集beads。用純化的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13做抗原去免疫兔子，每只兔子每次用抗原蛋白200μg，間隔1周后用不完全福氏佐劑加強(qiáng)，連續(xù)4次。得到了細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的抗體。于免疫第4次后1周取少量血清，測效價＞10000，取血，得到相應(yīng)的抗血清。
實(shí)施例4與實(shí)施例1類似，其不同在于把重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，37℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的BL21到OD值0.8。在培養(yǎng)的大腸桿菌BL21培養(yǎng)液中加入IPTG至0.1mM，25℃誘導(dǎo)5h。把誘導(dǎo)后的菌體離心收集后，用PBS(pH8.0)重懸，加DTT至終濃度10mM，加溶菌酶溶菌50min，再超聲波破碎35次，每次6s。然后把破碎后的菌液在4℃條件下，10000rpm離心10min，收集上清。將上清與Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃孵育過夜后再于4℃500rpm離心5min，收集beads。用純化的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13做抗原去免疫兔子，每只兔子每次用抗原蛋白200μg，間隔1周后用不完全福氏佐劑加強(qiáng)，連續(xù)4次。得到了細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的抗體。于免疫第4次后1周取少量血清，測效價＞10000，取血，得到相應(yīng)的抗血清。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白13抗體制備方法，其特征在于其步驟為1)將表達(dá)全長細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13蛋白質(zhì)的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-imp 13轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的BL21到OD值為0.5～1.0；3)在培養(yǎng)的大腸桿菌BL21中加入IPTG至0.1～0.5mM，誘導(dǎo)；4)將誘導(dǎo)后的菌體離心收集，用PBS重懸，先加入DTT至終濃度1～10mM，后加溶菌酶溶菌，再超聲波破碎，把破碎后的菌液離心，收集上清；5)將上清與Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，孵育后離心收集beads；6)用谷胱甘肽洗脫下細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13；7)用純化后的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13作為抗原免疫兔子，得到細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的抗體，用不完全福氏佐劑加強(qiáng)；8)測抗細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13的血清效價，取血，得到相應(yīng)的抗血清。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體13抗體制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述的培養(yǎng)其溫度為37℃。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體13抗體制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述的誘導(dǎo)其溫度為25℃，時間為2～5h。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體13抗體制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述的PBS其pH值為8.0，加入的DTT濃度為5mM，加溶菌酶溶菌的時間為30～60min，超聲波破碎35次，每次6s；然后把破碎后的菌液在4℃下，10000rpm離心10min，收集上清。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體13抗體制備方法，其特征在于在步驟5)中，把細(xì)菌裂解上清與Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，在4℃下孵育過夜，第二天4℃下，500rpm離心5min收集beads。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體13抗體制備方法，其特征在于在步驟6)中，用10mM谷胱甘肽洗脫下細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13。
7.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體13抗體制備方法，其特征在于在步驟7)中，每只兔子每次用抗原蛋白200μg，間隔1周后用不完全福氏佐劑加強(qiáng)，連續(xù)4次。
8.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體13抗體制備方法，其特征在于在步驟8)中，所述的取血是在免疫第4次后1周取血，所測血清效價應(yīng)＞10000，若所測血清效價≤10000，則需再進(jìn)行免疫。
全文摘要
核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體13蛋白的表達(dá)、純化及其抗體制備方法，涉及一種蛋白表達(dá)、純化及抗體制備，尤其是涉及一種核質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白受體13(imp 13)抗體的制備方法。提供一種以在生物體內(nèi)合成的有生物活性的imp 13的全長蛋白做抗原制備核質(zhì)轉(zhuǎn)移受體蛋白13抗體的方法。步驟為將全長importin 13基因插入到表達(dá)質(zhì)粒pGEX－4T－2，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，在BL21中表達(dá)目的蛋白；經(jīng)層析法純化得到有生物活性的蛋白用純化后的蛋白做抗原去免疫兔子，得到了imp 13的抗體，用不完全福氏佐劑加強(qiáng)，測效價，取血，得到相應(yīng)的抗血清。
文檔編號C07K16/18GK1807596SQ20061000538
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月19日
發(fā)明者陶濤, 彭梓 申請人:廈門大學(xué)