專利名稱：黑斑蛙抗微生物肽及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黑斑蛙抗微生物肽及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗生素的發(fā)現(xiàn)是藥物史上最重要的發(fā)現(xiàn)之一，其臨床應(yīng)用極大地降低了感染性疾病的死亡率。但是另一方面，抗生素的廣泛使用尤其是一些不合理的使用也導(dǎo)致了日益嚴(yán)重的抗生素耐受現(xiàn)象。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，抗生素大規(guī)模投入到臨床應(yīng)用后，一般在1-5 年內(nèi)就會出現(xiàn)耐受現(xiàn)象。為了監(jiān)測抗生素耐受現(xiàn)象，歐洲、亞洲先后成立了洲際范圍抗菌藥物耐受監(jiān)測機構(gòu)，我國也設(shè)立有相應(yīng)的檢測機構(gòu)——全國醫(yī)院感染監(jiān)控網(wǎng)。這種監(jiān)測行為可以通過抗生素耐受現(xiàn)象的變化趨勢對臨床用藥給予一定參考，但是為應(yīng)對抗生素耐受， 尋找新型抗菌藥物是一種中藥的途徑，目前新型抗菌藥物研究中具有較大臨床應(yīng)用潛力的是肽類抗菌物質(zhì)(目前統(tǒng)稱為抗菌肽)?？咕氖巧飪?nèi)在免疫的重要組成部分，一般小于50個氨基酸殘基，大多數(shù)在生理條件下帶有一定量的正電荷?？咕膶ξ⑸锏淖饔镁哂袕V譜性、高特異性、高生物活性的特點，而且抗菌肽還具有調(diào)節(jié)免疫的作用，具有極大地臨床應(yīng)用潛力。目前已在包括細(xì)菌、真菌、植物、動物等幾乎所有生物類別中鑒定到了抗菌肽類物質(zhì)的存在，其中尤其是兩棲動物來源的抗菌肽具有尤為豐富的多樣性，而在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中也有兩棲動物入藥的記載。發(fā)明人將本發(fā)明中的黑斑蛙(Mana nigromaculata )抗微生物肽氨基酸全序列及其編碼基因分別在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和基因數(shù)據(jù)庫進行比對搜索，均未發(fā)現(xiàn)有任何相同序列信肩、ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種新的具有強烈抗菌活性的黑斑蛙抗微生物肽及其基因和應(yīng)用。黑斑蛙抗微生物肽是中國兩棲類黑斑蛙中一種基因編碼的單鏈多肽，分子量為 1647. 02道爾頓，等電點11. 05，黑斑蛙抗微生物肽全序列為苯丙氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-纈氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸。
黑斑蛙抗微生物肽基因通過從黑斑蛙皮膚提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄、設(shè)計引物及PCR方法篩選得到，擴增引物長度為23個核苷酸，其序列為5，- ATGTTCACCACAAAGAAATCCAT-3',PCR 另一擴增引物為逆轉(zhuǎn)錄過程中加入的接頭引物，其序列為
5’ -TCGACGATTAGGCGGCCGACATGT-3’ ；將所獲得的陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定?；驕y序結(jié)果表明編碼黑斑蛙抗微生物肽的基因由316個核苷酸組成，自5’端至3’ 端序列為
atgttcacct tgaagaaaac cctcttactc cttttcttcc ttggaaccat caacctatct 60atctgtgagc aagagagaga tgccgatgag gaagaaagaa gggatgatcc atatgaaaca 120 gatgctgaag tggaaaaacg atttatacca cttgtgtcag gtctgttctc taggttgttg 180 ggaaagtaac caaaaatttt gaaactttgg aaatggaata ggaaatcatc tgatatggaa 240 tatcatcatt tagctaaacg ctcaacagat gtcttataaa aaataaataa atatgttgca 300
316
編碼黑斑蛙成熟抗微生物肽的cDNA序列為第142 - 186位核苷酸，其編碼的氨基酸序列為Phe lie Pro Leu Val Ser Gly Leu Phe Ser Arg Leu Leu Gly Lys。本發(fā)明采用自動多肽合成儀合成黑斑蛙抗微生物肽全序列，通過HPLC反相C18 柱層析脫鹽、純化后用HPLC方法鑒定其純度，以基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-T0F-MS)測定其精確分子量，并用自動氨基酸測序儀測定其氨基酸序列。本發(fā)明的有益效果在于
由黑斑蛙抗微生物肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，采用自動多肽合成儀合成的黑斑蛙抗微生物肽具有廣譜抗菌活性，且無溶血作用；該黑斑蛙抗微生物肽結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便、抗菌活性強、抗菌譜廣和無明顯副作用的特點。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實施例1黑斑蛙抗微生物肽基因克隆 1、黑斑蛙皮膚總RNA提取
A.活體黑斑蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入IOml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，于20ml 玻璃勻漿器中勻漿10分鐘。B.加入等體積酚/氯仿溶液，振蕩混勻，室溫放置10分鐘，4°C，12000rpm離心10 分鐘，吸取上層水相液體。C.上清液中加入1/2體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下7500g離心10分鐘， 沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為黑斑蛙皮膚總RNA。2、黑斑蛙皮膚RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈
黑斑蛙皮膚RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈采用日本TAKARA公司的Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H")試劑盒進行。A.取黑斑蛙皮膚總RNA 500 μ g溶于500 μ 1 DEPC水中待用。B.在0. 2ml無菌無RNA酶的離心管加入1 μ 1黑斑蛙皮膚RNA、1 μ 1逆轉(zhuǎn)錄引物 (5，-TCGACGATTAGGCGGCCGACATGTTTTTTTTTTTTTCTTT-3，)及 4ul DEPC 水，混勻后 70°C保溫 10分鐘后迅速在冰上急冷5分鐘。C.瞬時離心使模板RNA/引物的變性溶液聚集于離心管底部。D.加入 2ul 5XM-MLV 緩沖液、0.5ul dNTP 混合物(各 10 mM)、0. 25ul RNase Inhibitor (40 U/μ l)、0.25ul RTase M-MLV (RNase H" ) (200 U/μ 1)禾口 Iul DEPC 水， 42°C保溫1小時后，70°C保溫15分鐘后冰上冷卻，得到的cDNA溶液可直接用于黑斑蛙抗微生物肽編碼基因的擴增。3、黑斑蛙抗微生物肽編碼基因的擴增A. 95°C 預(yù)熱 PCR 儀。B.將2μ1 cDNA第一鏈(第2步驟中的產(chǎn)物)、75. 5μ 1去離子水、10μ1 PCR緩沖液、8 μ 1 dNTP 混合物(各 2. 5uM)、2 μ 1 5，PCR 引物(5，- ATGTTCACCACAAAGAAATCCAT-3，)、 2μ1 3，PCR 引物(5，-TCGACGATTAGGCGGCCGACATGT-3，)以及 0. 5 μ 1 大腸桿菌 DNA 聚合酶放入離心管中進行反應(yīng)。C.在PCR儀中按以下程序擴增
(1)預(yù)變性
95 0C5分秒鐘
(2)25個循環(huán)
95 0C30秒鐘
56 0C30秒鐘
72 0C30秒鐘
(3)后擴增
72 0C5分鐘
D.循環(huán)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用TIANGEN公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒進行抽提回收，步驟如下
(1)將PCR產(chǎn)物與等體積的膜結(jié)合緩沖液顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱， 室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。12000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。(2)加入700 μ 的漂洗液(含乙醇)于離心純化柱中，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。(3)重復(fù)步驟2。(4) 12000 rpm 離心 3 分鐘。(5)將離心純化柱置于新的離心管中。(6)加入30μ1超純水，在室溫下靜置5分鐘。(7) 12000 rpm離心1分鐘，管底物即為純化過的黑斑蛙抗微生物肽編碼基因PCR產(chǎn)物。4、大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備
(1)挑取單個DH5ci菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1:100再接種于50ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩2小時。當(dāng)0D600 值達(dá)到0. 35時，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。(2)將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個50ml預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，冰上放置lOmin，使培養(yǎng)物冷卻。(3)培養(yǎng)物于4°C下4100 rpm離心lOmin，吸出培養(yǎng)液，并將管倒置1 min，使殘留
的培養(yǎng)基流盡。(4)每 50ml 初始培養(yǎng)液用 30ml 預(yù)冷的 0. lmol/L CaCl2-MgCl2 溶液(80mmol/L MgCl2, 20mmol/L CaCl2)重懸細(xì)胞沉淀。(5)重懸液于4°C下4100 rpm離心lOmin，吸出上清液，并將管倒置1 min以使殘留的液體流盡。(6)每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2溶液重懸細(xì)胞沉淀，分裝后
5、連接及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
(1)在微量離心管中加入1 μ Takara pMD19_T simple載體、4 μ 1黑斑蛙抗微生物肽編碼基因PCR產(chǎn)物及5 μ 1的連接酶緩沖混合物。(2) 16°C反應(yīng) 3 小時。(3)全量(10 μ 1)加入至100 μ 1 DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。(4) 42°C加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。(5)加入37°C溫浴過的LB培養(yǎng)基890 μ 1，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。(6)取200 μ 1涂布于含有X-Gal、IPTG、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16 小時以形成單菌落。6、黑斑蛙抗微生物肽基因克隆篩選及鑒定
挑取上述單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)4小時，進行 PCR擴增。擴增引物及擴增條件與前述黑斑蛙抗微生物肽編碼基因的擴增條件相同。將經(jīng) PCR確證的陽性克隆進行質(zhì)粒提取后，以美國Applied BiOSyStemS3730A全自動核苷酸序列測定儀進行核苷酸序列的測定。測序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer M13_47(5， CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3，)，測序結(jié)果基因自5，端至3，端序列為
atgttcacct tgaagaaaac cctcttactc cttttcttcc ttggaaccat caacctatct 60 atctgtgagc aagagagaga tgccgatgag gaagaaagaa gggatgatcc atatgaaaca 120 gatgctgaag tggaaaaacg atttatacca cttgtgtcag gtctgttctc taggttgttg 180 ggaaagtaac caaaaatttt gaaactttgg aaatggaata ggaaatcatc tgatatggaa 240 tatcatcatt tagctaaacg ctcaacagat gtcttataaa aaataaataa atatgttgca 300 SLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSL316
黑斑蛙抗微生物肽基因核苷酸的序列長度為316個堿基，序列類型核酸；鏈數(shù)單鏈； 拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀；序列種類=CDNA ；來源黑斑蛙皮膚。編碼黑斑蛙成熟抗微生物肽的序列為第142 - 186位核苷酸，其對應(yīng)的氨基酸序列為
Phe lie Pro Leu Val Ser Gly Leu Phe Ser Arg Leu Leu Gly Lys 。實施例2黑斑蛙抗微生物肽的制備及藥理實驗 1、黑斑蛙抗微生物肽的制備
(1)黑斑蛙抗微生物肽的制備方法根據(jù)編碼黑斑蛙抗微生物肽的基因推導(dǎo)出黑斑蛙抗微生物肽的氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫
鹽、純化。(2)純化的黑斑蛙抗微生物肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，并采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F-MS)測定其精確分子量，最后用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)以進行確證。黑斑蛙抗微生物肽是中國兩棲類動物黑斑蛙中一種基因編碼的單鏈多肽，分子量為1647. 02道爾頓，等電點11. 05，黑斑蛙抗微生物肽全序列為苯丙氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-纈氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸。
2、黑斑蛙抗微生物肽的藥理實驗 (1)抗菌活性檢測
采用二倍稀釋法進行最小抑制濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)的檢測，受試菌株為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白假絲酵母菌。三種菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長出后，用接種環(huán)挑取單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。在紫外分光光度計上檢測菌液0D600，根據(jù)1 0D600=1 X IO9 CFU/ml將菌液用液體LB培養(yǎng)基稀釋至 2X IO5 CFU/ml。在無菌96孔板各孔中預(yù)先加入100 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，然后在第一孔中加入100 μ 1稀釋到一定濃度的經(jīng)0. 22Mffl微孔濾膜過濾除菌的黑斑蛙抗微生物肽樣品，混勻后取100 μ 1加入第2孔，依次倍比稀釋，從第10孔吸出100 μ 1棄去，至此二倍濃度梯度樣品即制備好。各孔的濃度分別為 320 ug/ml、160 ug/ml、80ug/ml、40 ug/ml、20 ug/mlUO ug/ml、5 ug/ml、2.5 ug/ml U. 25 ug/ml和0. 625ug/ml。同時設(shè)立陰性對照和陽性對照。以肉眼觀察未見微生物生長濃度為最小抑制濃度。(2)溶血活性檢測
人靜脈采血，將人靜脈血與阿氏液按1:1比例混合置于離心管中，1000 rpm離心5 min，生理鹽水洗滌至上清液不再呈紅色為止。將已進行洗滌的紅細(xì)胞加生理鹽水稀釋成 IO7-IOVml濃度的懸浮液。上述稀釋好的紅細(xì)胞懸浮液與溶解于生理鹽水的不同濃度的樣品37°C保溫30 min，再于1000 rpm離心5 min，上清液于MOnm測吸收值。陰性對照使用生理鹽水，陽性對照使用Triton X-100。各孔的黑斑蛙抗微生物肽終濃度分別為500ug/ml、 400 ug/ml,300 ug/ml,200 ug/ml、100ug/ml 和 50 ug/ml。根據(jù)測得的吸光度值計算樣品的溶血率。從以上的抗菌和溶血活性實驗結(jié)果顯示，黑斑蛙抗微生物肽對菌株均具有良好的抗菌活性，其中對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白假絲酵母菌的最小抑制濃度(MIC)分別為10ug/ml、5 ug/ml和10ug/ml，且在500 ug/ml濃度時仍沒有明顯的溶血活性。這表明黑斑蛙抗微生物肽具有很強的抗菌作用，同時其安全性高，可做為新型抗菌藥物進行應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.黑斑蛙抗微生物肽是中國兩棲類動物黑斑蛙中一種基因編碼的單鏈多肽，其特征是分子量為1647. 02道爾頓，等電點11. 05，多肽氨基酸全序列為苯丙氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-纈氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸。
2.權(quán)利要求1所述黑斑蛙抗微生物肽的基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由316個核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為atgttcaccttgaagaaaaccctcttactccttttcttccttggaaccatcaacctatct60atctgtgagcaagagagagatgccgatgaggaagaaagaagggatgatccatatgaaaca120gatgctgaagtggaaaaacgatttataccacttgtgtcaggtctgttctctaggttgttg180ggaaagtaacgaaactttggaaatggaataggaaatcatctgatatggaa240tatcatcatttagctaaacgctcaacagatgtcttataaa3.3.3. 3.3.3. 3.3.atatgttgca300316
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黑斑蛙抗微生物肽基因核苷酸序列，其特征在于第 142186位核苷酸編碼黑斑蛙成熟抗微生物肽，其編碼的氨基酸序列為Phe lie Pro Leu Val Ser Gly Leu Phe Ser Arg Leu Leu Gly Lys 。
4.權(quán)利要求1所述的黑斑蛙抗微生物肽的應(yīng)用，其特征是作為新型抗感染藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黑斑蛙抗微生物肽及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。黑斑蛙抗微生物肽是中國兩棲類動物黑斑蛙中分離的一種基因編碼的單鏈多肽，分子量為1647.02道爾頓，等電點為11.05，黑斑蛙抗微生物肽全序列為苯丙氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-纈氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸。其編碼基因由316個核苷酸組成，其中編碼成熟部分的為第142–186位核苷酸。人工合成的黑斑蛙抗微生物肽具有強大的抗菌作用，同時其安全性高，并且還具有序列簡單、合成方便的優(yōu)點，可做為新型抗感染藥物進行應(yīng)用。
文檔編號C12N15/12GK102250216SQ201110174650
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者余旭亞, 孟慶雄, 宋玉竹, 李濤 申請人:昆明理工大學(xué)