專利名稱：一種檢測(cè)乙肝病毒ymdd耐藥突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變的方法。
背景技術(shù)：
抗病毒治療是慢性乙型肝炎治療的關(guān)鍵，最終的目標(biāo)是最大程度抑制HBV復(fù)制， 減少肝硬化、肝細(xì)胞癌、肝功能失代償，延長(zhǎng)生存期，提高生活質(zhì)量。核苷酸類似物能阻斷 HBV DNA的合成，抑制病毒復(fù)制，而拉米夫定是HBV治療廣泛應(yīng)用的核苷類似物，能顯著降低血清中HBV DNA的水平，并可使ALT正?；透谓M織學(xué)改善。但長(zhǎng)期服用拉米夫定進(jìn)行抗病毒治療易出現(xiàn)HBV的YMDD基序發(fā)生突變，導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生，稱為YMDD變異。YMDD變異使患者體內(nèi)病毒復(fù)制出現(xiàn)反彈，病情加重。因此，及早、盡快的檢測(cè)出YMDD突變對(duì)患者實(shí)施個(gè)體化治療方案具有重要意義。此外，YMDD的突變不是一蹴而就的，由于乙肝病毒的準(zhǔn)種特點(diǎn)，YMDD的發(fā)生是一個(gè)在抗病毒藥物的選擇壓力的作用下不斷累積并最終表現(xiàn)為對(duì)核苷類似物的耐藥的過程。提高突變型DNA的檢測(cè)靈敏度，及早發(fā)現(xiàn)YMDD耐藥的出現(xiàn)，可以盡早更換抗病毒藥物，避免耐藥的發(fā)生。YMDD變異即HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的保守序列YMDD中M (蛋氨酸)被V (纈氨酸)或被I (異亮氨酸)所取代，是一種點(diǎn)突變。目前YMDD變異的分子生物學(xué)檢測(cè)方法很多，然而，這些方法在臨床實(shí)踐中費(fèi)時(shí)、技術(shù)要求高、對(duì)YMDD突變的檢測(cè)靈敏度不高、檢測(cè)費(fèi)用昂貴，無法實(shí)現(xiàn)突變DNA的定量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變的方法。該方法可定量檢測(cè)YMDD的耐藥突變YVDD，且特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高，耗時(shí)短、成本較低。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
本發(fā)明的一種檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變的方法，利用RT-ARMS-qPCR方法檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變。所述RT-ARMS-qPCR方法為根據(jù)乙型肝炎病毒基因序列的YMDD區(qū)域設(shè)計(jì)ARMS弓丨物；分別構(gòu)建野生型和突變型質(zhì)粒；以STOR Green為熒光檢測(cè)信號(hào)，在ARMS引物的存在下，以構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)野生型YMDD和突變型YVDD模板進(jìn)行定量。所述引物為
共同引物 KF :5’-TCA TMT TCC TCT KCA TCC TGC-3’ 野生型下游引物 MR :5，-CCC AAff ACC AVA TMA TCC AT-3’ 突變型下游引物 VR :5，-CCC AAff ACC AVA TMA TCC GC-3’ ； 其中M代表A或C ;K代表G或T ;W代表A或T ;V代表G或A或C。所述RT-ARMS-qPCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為采用25 μ L的反應(yīng)體系，2倍濃縮的 SYBR Premix Ex Taq 12. 5 μ L，引物對(duì)20 μ M各0. 4 μ L，50倍濃縮的 ROX Reference Dye 0. 5 μ L，HBV DNA模板2 μ L，dH20 9. 2 μ L ；于ΑΒΙ7000熒光PCR儀進(jìn)行反應(yīng)并檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件95°C 30s，然后按95°C 5s,61°C 31s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，熒光檢測(cè)在60°C。制備出高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能否準(zhǔn)確定量模板的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體上(TA克隆)，優(yōu)點(diǎn)是重組質(zhì)粒穩(wěn)定，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品純化方式簡(jiǎn)單，易于定量測(cè)定和大量擴(kuò)增、純化和保存，是實(shí)時(shí)熒光定量PCR中最常使用的定量標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明首先對(duì)已經(jīng)鑒定為野生型YMDD和突變型YVDD的標(biāo)本，通過PCR擴(kuò)增得到363bp 大小的DNA片段，將其與pMDIS-T載體進(jìn)行TA克隆，構(gòu)建出含PCR產(chǎn)物片段的重組質(zhì)粒， 經(jīng)PCR初步鑒定和預(yù)期結(jié)果吻合，核苷酸序列測(cè)定顯示插入的片段序列與Genbank報(bào)道的序列一致，說明我們已經(jīng)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，可以將其作為YMDD、YVDD定量的標(biāo)準(zhǔn)品，為 RT-ARMS-qPCR方法的建立奠定了基礎(chǔ)。我們確定了優(yōu)化的RT_ARMS-qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，重復(fù)性較好，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)可反應(yīng)方法的精密度，一般要求重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的精密度< 5%，本發(fā)明通過重復(fù)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，YMDD高、中、低濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi)CV 值分別為1. 06%、1. 1 禾口 1. 71%，批間CT值為4. 88%，YVDD高、中、低濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi) CT值分別為0. 96%、1· 11%和1. 29%，批間CT值為2. 63%，均能夠滿足臨床的要求。本發(fā)明的方法特異性好，只對(duì)與引物相對(duì)應(yīng)的模板DNA有特異性擴(kuò)增，對(duì)不相應(yīng)的DNA和空白無擴(kuò)增；線性范圍寬，從IO1-IO8濃度的模板都有較好的線性范圍。該方法簡(jiǎn)便、快速、可靠，可同時(shí)鑒別正常、純合和雜合突變，可滿足臨床YMDD、YVDD和YIDD定量的需要。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明采用序列特異性引物和熒光染料STOR Green I進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，縮短檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作步驟，而且不需要擴(kuò)增后的分析過程，減少了產(chǎn)物污染的可能，與Taqman探針需雙標(biāo)記方法比較，SYBR Green I不需要設(shè)計(jì)合成熒光探針，簡(jiǎn)化了設(shè)計(jì)思路，成本較低。并結(jié)合熔解曲線分析，具有反應(yīng)的特異性。


圖 1 為 YMDD、YVDD 普通 PCR 電泳圖譜，其中 Lane 1 :DNA Marker ；Lane 2-7 模板為YMDD野生型，Lane 8-10模板為YVDD突變型；Lane 2-4退火溫度為60°C，Line 5-10退火溫度為61 °C ；
圖2為質(zhì)粒和菌落PCR電泳結(jié)果，其中Lanel =DNA Marker ；Lane2 =M質(zhì)粒PCR產(chǎn)物； Lane3 :M 菌落 PCR 產(chǎn)物；Lane 4、5 :V 質(zhì)粒 PCR 產(chǎn)物；Lane 6、7 :V 菌落 PCR 產(chǎn)物； 圖3為野生型YMDD重組質(zhì)粒的部分序列圖； 圖4為突變型YVDD重組質(zhì)粒的部分序列圖； 圖5為YMDD定量標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線圖； 圖6為熒光定量PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖7為YVDD定量標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線； 圖8為熒光定量PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖9為YMDD熒光定量PCR檢測(cè)下限，注最高稀釋度(曲線a)為IO5Copies/μ 1、最低稀釋度(曲線b)為IO1拷貝數(shù)/μ 1;
圖10為YVDD熒光定量PCR檢測(cè)下限，注最高稀釋度(曲線a)為IO5Copies/μ 1、最低稀釋度(曲線b)為IO1拷貝數(shù)/μ 1;
圖11為RT-ARMS-qPCR定量檢測(cè)YMDD的特異性；圖12為RT-ARMS-qPCR定量檢測(cè)YVDD的特異性；
圖13為YMDD批內(nèi)重復(fù)性的熒光曲線，注從左至右依次為IO7拷貝數(shù)/μ 1、105拷貝數(shù)/μ1、103拷貝數(shù)/μ ；
圖14為YVDD批內(nèi)重復(fù)性的熒光曲線，從左至右依次為IO7 copies/μ IUO5 copies/ μ1>IO3 copies/μ 1。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
材料及試劑來源 大腸埃希菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞 pMD 18-T Vector 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒高純質(zhì)粒小量制備試劑盒 2XHotStart Taq PCR MasterMix
SYBR Z. Premix Ex Taq X-Gal、IPTG、DMF1.引物的設(shè)計(jì)與合成 1. 1 ARMS實(shí)驗(yàn)原理
主要原理是人為制造引物與模板間的堿基錯(cuò)配，致使擴(kuò)增受阻。前提是PCR的關(guān)鍵酶一耐熱的7 ^ DNA聚合酶缺乏外切(3' -5')校正活性，利用這一特性在靠近已知突變位點(diǎn)3'端引入2個(gè)不配對(duì)的核苷酸，顯著增加等位基因特異的修飾引物與野生型和突變型靶序列結(jié)合的特異性。ARMS系統(tǒng)需要兩種形式的引物，“正常引物”只與野生型模板結(jié)合，不與突變型模板結(jié)合；“突變型”引物只與突變型模板結(jié)合，不與正常野生型模板結(jié)合。1. 2SYBR Green I 的作用原理
熒光染料STOR Green I能特異性地結(jié)合到雙鏈DNA上，而不結(jié)合到單鏈DNA上，并且結(jié)合后的染料的發(fā)光強(qiáng)度會(huì)明顯增加，沒有結(jié)合的染料在溶液中只能發(fā)出很微弱的熒光。 在PCR延伸過程中，隨著雙鏈的延長(zhǎng)，有更多的染料結(jié)合到雙鏈DNA中，從而進(jìn)一步將熒光信號(hào)放大，當(dāng)DNA變性時(shí)，熒光信號(hào)會(huì)下降，幾乎檢測(cè)不到。因此，在每次PCR循環(huán)延伸過程結(jié)束時(shí)的檢測(cè)可觀察到一個(gè)動(dòng)態(tài)擴(kuò)增過程。1.3引物序列
根據(jù)ARMS實(shí)驗(yàn)原理，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特點(diǎn)，按照引物設(shè)計(jì)的原則，設(shè)計(jì)ARMS 引物，總共有三條引物，一種為共同引物(KF)，另外兩條引物分別為①含野生型YMDD片段擴(kuò)增引物(MR)，該引物與共同引物構(gòu)成一對(duì)引物，只對(duì)含有正常位點(diǎn)YMDD的基因片段進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；②含突變型YVDD片段擴(kuò)增引物(VR)，該引物與共同引物構(gòu)成一對(duì)引物，只對(duì)含 YVDD突變位點(diǎn)的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，為了增加反應(yīng)的特異性，在3'端增加兩個(gè)錯(cuò)配堿基，序列加下劃線。由上海生物工程有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為36;3bp。引物序列如下
KF 5' -TCA TMT TCC TCT KCA TCC TGC-3，(396-416) MR 5'-CCC AAff ACC AVA TMA TCC AT-3' (739-758)
天根生化(北京)有限公司寶生物工程(大連)有限公司北京百泰克生物技術(shù)有限公司北京百泰克生物技術(shù)有限公司天根生化(北京)有限公司寶生物工程(大連)有限公司上海捷瑞生物工程有限公司。VR 5' -CCC AAff ACC AVA TMA TCC GC-3' (739-758) 2. HBV-DNA YMDD、YVDD標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 2. 1 HBV DNA的提取
用上海捷瑞生物工程有限公司的病毒基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)抽提HBV DNA (從已經(jīng)鑒定為YMDD野生型和YVDD突變型的標(biāo)本中提取，取自福州市傳染病醫(yī)院)，具體操作按說明書進(jìn)行。 2. 2常規(guī)PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件 2. 2. 1反應(yīng)體系見表1 表1常規(guī)PCR反應(yīng)體系
反應(yīng)體系組成成份各成份體積(ul)PCR MasterMx (2Χ) MgCl (25mmoLL) KF (20μηιο1 L) MRYR (20iimdL) 摸板 ddH;0OJ 3.0 0.4 0.4 6-一總體枳25
2. 2. 2擴(kuò)增條件
940C 3min — {94°C 30s，61°C 30s, 72°C 45s} 35 個(gè)循環(huán)—72°C 5min。2. 3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收純化
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變的方法，其特征在于利用RT-ARMS-qPCR方法檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變的方法，其特征在于所述 RT-ARMS-qPCR方法為根據(jù)乙型肝炎病毒基因序列的YMDD區(qū)域設(shè)計(jì)ARMS引物；分別構(gòu)建野生型和突變型質(zhì)粒；以SYBR Green為熒光檢測(cè)信號(hào)，在ARMS引物的存在下，以構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)野生型YMDD和突變型YVDD模板進(jìn)行定量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變的方法，其特征在于所述引物為共同引物 KF :5’-TCA TMT TCC TCT KCA TCC TGC-3’ 野生型下游引物 MR :5，-CCC AAff ACC AVA TMA TCC AT-3’ 突變型下游引物 VR :5，-CCC AAff ACC AVA TMA TCC GC-3’ ； 其中M代表A或C ;K代表G或T ;W代表A或T ;V代表G或A或C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變的方法，其特征在于所述 RT-ARMS-qPCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為采用25 μ L的反應(yīng)體系，2倍濃縮的STOR Premix Ex Taq 12. 5 μ L，引物對(duì) 20 μ M 各 0. 4 μ L，50 倍濃縮的 ROX Reference Dye 0. 5 μ L, HBV DNA模板2 μ L，dH20 9. 2 μ L ；于ΑΒΙ7000熒光PCR儀進(jìn)行反應(yīng)并檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件95°C 30s，然后按95°C 5s,61°C 31s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，熒光檢測(cè)在60°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變的方法，該方法利用RT-ARMS-qPCR方法檢測(cè)乙肝病毒YMDD耐藥突變。本發(fā)明采用序列特異性引物和熒光染料SYBRGreenⅠ進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，縮短檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作步驟，而且不需要擴(kuò)增后的分析過程，減少了產(chǎn)物污染的可能，與Taqman探針需雙標(biāo)記方法比較，SYBRGreenⅠ不需要設(shè)計(jì)合成熒光探針，簡(jiǎn)化了設(shè)計(jì)思路，成本較低。并結(jié)合熔解曲線分析，具有反應(yīng)的特異性。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102230020SQ20111013529
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月24日
發(fā)明者商紅艷, 歐啟水 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院