專利名稱：一種大電流篩選大腸桿菌育種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物育種領(lǐng)域，涉及提高大腸桿菌BL21生長(zhǎng)量的方法，具體是通過(guò)控制直流電的電流大小，篩選出對(duì)大電流具有耐受性的菌株，使其在無(wú)電流壓力的情況下提高生長(zhǎng)量，并且使這種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)能夠保持多代。
背景技術(shù)：
電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝的影響是生物化工、生物醫(yī)藥以及環(huán)境工程的重要研究課題，引起眾多研究者的關(guān)注。微生物細(xì)胞的電解刺激技術(shù)已在酵母發(fā)酵體系、生物脫氮體系、有機(jī)廢水降解體系等領(lǐng)域中得到初步應(yīng)用，在工業(yè)微生物培養(yǎng)和環(huán)境修復(fù)電刺激方面顯示出良好的應(yīng)用前景。一般認(rèn)為小電流能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，而大電流對(duì)微生物細(xì)胞施加負(fù)面影響，對(duì)微生物起到殺菌的作用。所以，電解刺激技術(shù)中多使用小電流促進(jìn)微生物生長(zhǎng)，而大電流多用于食品殺菌、保存以及某些加工過(guò)程。然而極端環(huán)境下存活的微生物在撤銷環(huán)境壓力后可以得到某些遺傳特性，但是利用大電流篩選微生物以提高微生物生長(zhǎng)量的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。據(jù)《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》2001，33(1)報(bào)道，高翔等利用高壓力誘變大腸桿菌 TGUDH5 α P和HBlOlP得到了耐壓的突變菌株TG1P、DH5 α P和ΗΒ101Ρ，使其在220MPa高壓下的存活率提高了 2 3個(gè)數(shù)量級(jí)。據(jù)《現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2006,6 (4)報(bào)道，朱傳合等利用微波誘變阿維拉霉素產(chǎn)生菌SV獲得1株阿拉維霉素的突變菌株SV-15，產(chǎn)量達(dá)到21. 5mg/L，較出發(fā)菌提高119. 4%。據(jù)《BioresourceTechnology)) 2007,98(18)報(bào)道，Walid A Lotfy 等利用紫外線檸檬酸產(chǎn)生菌Aspergilbus-niger UMIP2564獲得成品收率達(dá)到60. 25%的變異菌株W5。據(jù)《微生物學(xué)通報(bào)》2010. 37(10)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室孫西同等通過(guò)小電流刺激大腸桿菌，提高了大腸桿菌的生長(zhǎng)量。但小電流刺激的大腸桿菌必須在通電情況下才能表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，一旦取消通電，其生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)很快消失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)具有清楚遺傳背景的大腸桿菌進(jìn)行大電流篩選得到耐受菌株， 撤銷電流壓力后，使獲得的大腸桿菌更具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，并且使這一優(yōu)勢(shì)能夠保持3 4代。本發(fā)明在小電流篩選大腸桿菌的基礎(chǔ)上，利用大電流篩選大腸桿菌，撤銷電流后獲得的大腸桿菌生長(zhǎng)量增加，并且使這種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)能夠保持多代。利用大電流篩選大腸桿菌的方法，需要選擇合適的電極、電流，并且控制電流大小使其維持恒定。一種大電流篩選大腸桿菌育種的方法，選擇在大電流環(huán)境中仍能存活的耐受菌株，撤銷電流壓力后，提高大腸桿菌的生長(zhǎng)量，并且使得這種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)能夠保持多代，其特征是選擇Yi-Ti或者Pt做電極，并且使陰極、陽(yáng)極之間保持0. 5 IOcm的距離。將大腸桿菌種子液置于50 130mA的大電流環(huán)境中培養(yǎng)8 24h，劃板，25°C 40°C恒溫培養(yǎng)12 96h。與現(xiàn)有微生物育種的方法相比，該方法具有能夠保持多代生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，簡(jiǎn)單易操作， 清潔無(wú)污染的特點(diǎn)。


圖1經(jīng)IOOmA直流電篩選后的大腸桿菌生長(zhǎng)曲線。圖2經(jīng)IlOmA直流電篩選后的大腸桿菌生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)例1 選用通用的模式菌大腸桿菌BL21，施加IOOmA直流電作用于大腸桿菌 BL21，篩選出大電流耐受菌株BL21E1001. 1種子培養(yǎng)取50 μ L甘油保存菌種，接入250mL裝有IOOmL培養(yǎng)基的錐形瓶中， 30°C,130r/min水浴搖床培養(yǎng)18小時(shí)。1. 2誘變培養(yǎng)取4mL種子液于裝有300mL培養(yǎng)基的三口玻璃電解瓶中，Yi-Ti電極做為陰極；Pt電極做為陽(yáng)極，控制電流大小保持IOOmA恒定，并且使大腸桿菌在電場(chǎng)環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。劃板，37°C恒溫箱培養(yǎng)48h，獲得大電流耐受菌BL21E100。1. 3100mA直流電篩選后的大腸桿菌的生長(zhǎng)量檢測(cè)經(jīng)IOOmA直流電處理后的大腸桿菌，用生長(zhǎng)曲線表示其生長(zhǎng)情況，如圖1所示，發(fā)現(xiàn)18hBL21E100較原菌的生長(zhǎng)量提高最大，AOD = 0.221。然后用干重表示大腸桿菌的生長(zhǎng)量，如表1所示，發(fā)現(xiàn)和原菌比較，BL21E100的生長(zhǎng)量?jī)?yōu)勢(shì)保持了 4代，其中第一代增長(zhǎng)率最大，比原菌提高了 36.8%。
權(quán)利要求
1.一種大電流篩選大腸桿菌育種的方法，其特征是選擇Yi-Ti或者Pt做電極，并且使陰極、陽(yáng)極之間保持0. 5 IOcm的距離；將大腸桿菌種子液置于50 130mA的大電流環(huán)境中培養(yǎng)8 24h，劃板，25°C 40°C恒溫培養(yǎng)12 96h，選擇在大電流環(huán)境中仍能存活的耐受菌株，撤銷電流壓力后，提高大腸桿菌的生長(zhǎng)量，并且使得這種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)能夠保持多代。
2.如權(quán)利要求1所述一種大電流篩選大腸桿菌育種的方法，其特征是將大腸桿菌置于大電流環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)，劃板，37°C恒溫箱培養(yǎng)48小時(shí)，篩選出大電流環(huán)境中的耐受菌株。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物育種領(lǐng)域，涉及一種大電流篩選大腸桿菌育種的方法，其特征是選擇Yi-Ti或者Pt做電極，并且使陰極、陽(yáng)極之間保持0.5～10cm的距離。將大腸桿菌種子液置于50～130mA的大電流環(huán)境中培養(yǎng)8～24h，劃板，25℃～40℃恒溫培養(yǎng)12～96h，選擇在大電流環(huán)境中仍能存活的耐受菌株，撤銷電流壓力后，提高大腸桿菌的生長(zhǎng)量，并且使得這種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)能夠保持多代。與現(xiàn)有微生物育種的方法相比，該方法具有能夠保持多代生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，簡(jiǎn)單易操作，清潔無(wú)污染的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102220306SQ20111011433
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者李明, 馬潔 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)