專利名稱：pGreen Max1 真核表達(dá)載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的載體及其制備方法，特別涉及的是一種 pGreen Maxl真核表達(dá)載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
真核表達(dá)載體主要用于在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)某些特定的蛋白，目前已有的真核表達(dá)載體主要有(l)pCMVp-NEO-BAN載體，該載體在大多數(shù)真核細(xì)胞中都可以高水平穩(wěn)定地表達(dá)外源目的基因，并可以利用G418進(jìn)行篩選。Q)pEGFPi^^JnU.S.Patent Nos. 5625048 issued on April 29，1997。pEGFP 載體的特點(diǎn)是可以表達(dá)綠熒光蛋白，通過固定波長(zhǎng)的光波激發(fā)可以發(fā)出綠熒光，該載體可以表達(dá)一個(gè)蛋白，使之與綠熒光形成融含蛋白，用于確定外源基因在細(xì)胞中的定位，同時(shí)， 該載體可以用G418來篩選。上述載體都有不足之處，pCMVp-NEO-BAN載體可以很好的表達(dá)外援蛋白，但篩選克隆和鑒定蛋白的表達(dá)量比較困難，不利于篩選。PEGFP載體可以比較簡(jiǎn)單的用于篩選和檢測(cè)蛋白的表達(dá)量，但是由于要與綠熒光蛋白融合形成融合蛋白，對(duì)目的蛋白構(gòu)象、后續(xù)加工和分布會(huì)有影響。pGreenMax 1載體很好的解決了這幾個(gè)問題。它可以通過G418先進(jìn)行初步的篩選克隆，然后可以根據(jù)細(xì)胞綠熒光的表達(dá)量來判斷穩(wěn)定細(xì)胞株的目的蛋白的表達(dá)量，并且綠熒光蛋白和目的蛋白不是形成融合蛋白，而是分別形成兩個(gè)蛋白，對(duì)于目的蛋白構(gòu)象和后續(xù)加工完全沒有影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種pGreen Maxl真核表達(dá)載體及其制備方法，本發(fā)明可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)蛋白或抗體，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)細(xì)胞株篩選提供穩(wěn)定篩選標(biāo)記。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及的pGreen Maxl真核表達(dá)載體，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表達(dá)載體重組獲得序列1，序列1共計(jì)7976bp，其中在第1769bp-2415bp之間插入了含有647bp的 Mex片段，在第3120bp-4^8bp之間插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列。本發(fā)明涉及的上述pGreen Max 1真核表達(dá)載體的制備方法，包括設(shè)計(jì)引物從質(zhì)粒中通過PCR的方法克隆得到Mex，并將PCR產(chǎn)物經(jīng)過SmaI位點(diǎn)定向插入到表達(dá)載體中，并經(jīng)過BamHI和NotI雙酶切將IRES-EGFP插入到載體中，構(gòu)建重組的pGreen Max真核表達(dá)載體。所述的pGreen Max 1真核表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟A、設(shè)計(jì)引物根據(jù)Mex序列設(shè)計(jì)引物，上游引物加入RiieI位點(diǎn)，引物序列如下Mex FGATATCGTTTAAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGAT
Mex R TGAGGCCTGAGTTCAGACCGGTB、目的片段的克隆以帶有Mex的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增模板1 μ 1，上下游引物10 μ M各1 μ 1，2. 5mM的dNTP底物4 μ 1，10倍緩沖液5 μ 1，pfu聚合酶1 μ 1，雙蒸水37 μ 1 ；95°C變性2分子；然后94°C變性30秒、55_65°C退火30秒、72°C延伸50秒，進(jìn)行 30-40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7-10分鐘；C、擴(kuò)增產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見一條約647bp的擴(kuò)增條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進(jìn)行純化；D、pMex真核載體的構(gòu)建D-1、酶切將載體用SmaI酶進(jìn)行酶切，酶切時(shí)在反應(yīng)體系中加入10倍緩沖液 2 μ 1, SmaI 1 μ 1，載體5 μ 1，無離子水12 μ 1，37°C水浴4個(gè)小時(shí)，酶切后的載體片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收；D-2、連接回收的Mex的片段和載體用T4連接酶進(jìn)行體外連接反應(yīng)；D-3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐霉素 100 μ 1/ml的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)；D-4、篩選重組真核表達(dá)載體的陽性克隆將菌落放大培養(yǎng)，純化提取質(zhì)粒；D-5、利用SpeI進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序，證實(shí)得到序列1的pMex真核表達(dá)質(zhì)粒；E、得到IRES-EGFP序列在質(zhì)粒中利用BamHI和NotI雙酶切得到IRES-EGFP序列，并經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見一條約1300bp的條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction KitDNA純化試劑盒進(jìn)行純化；F、pGreen Max 1真核表達(dá)載體的構(gòu)建F-1、酶切將載體用BamHI和NotI雙酶切，酶切時(shí)在反應(yīng)體系中加入10倍緩沖液 2 μ 1，BamHIly 1, NotIy 1, pMex載體5 μ 1，無離子水12 μ 1，37°C水浴4個(gè)小時(shí)，酶切后的載體片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收；F-2、連接回收的IRES-EGFP片段和載體用T4連接酶進(jìn)行體外連接反應(yīng)；F-3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐霉素 100 μ 1/ml的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)；F-4、篩選重組真核表達(dá)載體的陽性克隆將菌落放大培養(yǎng)，純化提取質(zhì)粒；F-5、利用HindIII進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序，證實(shí)得到序列1的pMex真核表達(dá)質(zhì)粒。步驟C中所述的PCR產(chǎn)物，其純化方法步驟如下①從瓊脂糖凝膠中將PCR產(chǎn)物DNA條帶切下，轉(zhuǎn)入離心管中，加入2倍體積的結(jié)合緩沖液，55°C下溫浴7分鐘使得凝膠溶解；②將離心管中溶解的凝膠溶液轉(zhuǎn)移到試劑盒自帶的DNA吸附柱中，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；③向DNA吸附柱中加入700 μ 1漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液， 再加入500 μ 1漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2
分鐘，室溫放置5分鐘；④將DNA吸附柱加入一個(gè)新的離心管中，加入65°C預(yù)熱的洗脫緩沖液70 μ 1， 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，離心管底的溶液即為回收的PCR產(chǎn)物DNA片段。步驟D-2中所述的連接，其連接方法如下在反應(yīng)體系中加入回收的PCR產(chǎn)物DNA片段8 μ 1和載體片段2 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，T4DNA連接酶1 μ 1，去離子水7 μ 1，16°C反應(yīng)10h。步驟F-2所述的連接方法是在反應(yīng)體系中加入回收的DNA片段8 μ 1和載體片段 2 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，去離子水7μ 1，16°C反應(yīng)10h。步驟D-3所述的轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其轉(zhuǎn)化大腸桿菌方法步驟如下①取連接產(chǎn)物IOul加到50ul的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻，冰浴30min.②42°C熱激90s，快速轉(zhuǎn)到冰浴2_;3min，注意不要搖動(dòng)管。③向管中加入500ul 的 LB 培養(yǎng)基，150rmp，37°C，45min.④將菌液全部涂到LB平板上，含100ug/ml Amp.⑤將平板正置直至液體全部吸收。⑥倒置平板，于37°C培養(yǎng)12_16h.步驟D-4中所述的篩選重組真核表達(dá)載體陽性克隆，其篩選重組真核表達(dá)載體陽性克隆方法步驟如下①挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落，接種到2ml含有氨芐青霉素(100μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C，150rpm，搖床培養(yǎng) 12 16hr ；②取1-1. 5ml培養(yǎng)物倒入1. 5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然后再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩余菌液4°C保存；③將細(xì)胞沉淀漩渦震蕩打散后，重懸于100 μ 1冰預(yù)冷的堿裂解液I中，漩渦震蕩， 使細(xì)菌懸浮均勻；④組菌重懸液中加入200 μ 1堿裂解液II，上下翻轉(zhuǎn)離心管5次，使菌體充分裂解， 直至形成透亮的溶液，置于冰上(< 5min)；⑤加入150 μ 1冰預(yù)冷的堿裂解液III，上下翻轉(zhuǎn)離心管8次，使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，并將離心管置于冰上1 :3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400 μ 1的上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中；⑥加400 μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震蕩充分混合有機(jī)相和水相，13000rpm 離心2min，取上清于新離心管中；⑦用2 2. 5體積的乙醇(850 μ 1)室溫沉淀核酸，混合均勻，室溫靜置2min。 13000rpm離心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉；⑧加Iml左右70%乙醇于沉淀中，顛倒離心管數(shù)次，洗滌管壁與沉淀，如沉淀偏離管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出(若沉淀漂浮，用槍頭將其置于離心管底部)；⑨打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發(fā)，直至離心管內(nèi)沒有可見的液體存在；⑩加50 μ 1 TE緩沖液(含20 μ g/ml RNase Α)于離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻，貯存于_20°C。步驟D-5中所述的酶切鑒定和測(cè)序，其酶切鑒定和測(cè)序方法如下在反應(yīng)體系中加入提取的重組真核表達(dá)載體5 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，限制性內(nèi)切酶SpeI Iy 1，去離子水13μ 1，37°C反應(yīng)池；經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離后鑒定pMex的目的條帶，SpeI酶切后可切出約1. 3kb和5. 3kb的兩個(gè)片段，與預(yù)期相符，表明目的片段已正確的插入載體中；步驟F-5中的酶切鑒定和測(cè)序，其酶切鑒定和測(cè)序方法如下在反應(yīng)體系中加入提取的重組真核表達(dá)載體5 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，限制性內(nèi)切酶HindIII Iy 1，去離子水13μ 1，37°C反應(yīng)池；經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離后鑒定pGreen Max 1的目的條帶，HindIII酶切后可切出約4. 9kb,2. 9kb和230bp的三個(gè)片段，與預(yù)期相符，表明目的片段已正確的插入載體中。本發(fā)明應(yīng)用的是EFl α啟動(dòng)子，是人體內(nèi)高表達(dá)蛋白的啟動(dòng)子，可以避免外源啟動(dòng)子對(duì)細(xì)胞的不良影響。同時(shí)該載體可以利用綠熒光的發(fā)光來表征蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)， 便于細(xì)胞株的篩選?？稍诟弋a(chǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞株的篩選提供蛋白表達(dá)及篩選的標(biāo)記，為蛋白高效表達(dá)提供了很好的載體，也為細(xì)胞株的篩選提供一種新的方法和便利。


圖1是本發(fā)明的PCR的電泳照片；其中可以看到500bp到750bp之間有一個(gè)明顯的條帶，條帶大小與預(yù)期的647bp 大致相等，與預(yù)期相符，表明Mex序列PCR成功。圖2是本發(fā)明的pMex質(zhì)粒的酶切鑒定的電泳圖片；其中經(jīng)過SpeI酶切后，可以切出1.31Λ和5. 31Λ兩個(gè)條帶，與預(yù)期相符，表明Mex 片段已正確的插入到載體當(dāng)中。圖3是pMex和IRES-EGFP的酶切電泳照片；其中經(jīng)過BamHI和NotI酶切，載體大小為6. 6kb, IRES-EGFP序列為1. 3kb,與預(yù)
期大小相符。圖4是pGreen Max 1質(zhì)粒酶切照片；其中，經(jīng)過HindIII酶切，可以切出三個(gè)條帶，分別是4. 9kb、2. 9kb和230bp的條帶，與預(yù)期條帶相符，表明IRES-EGFP序列已經(jīng)正確插入到pMex載體當(dāng)中。圖5是轉(zhuǎn)染了蛋白A重組真核表達(dá)載體的細(xì)胞其中，轉(zhuǎn)染以后，細(xì)胞中可以表達(dá)綠熒光蛋白，可以用于細(xì)胞株的篩選。圖6是轉(zhuǎn)染了蛋白A重組真核表達(dá)載體的細(xì)胞的上清免疫熒光的照片圖7為抗體B蛋白電泳照片。其中，轉(zhuǎn)染以后，在細(xì)胞的上清中可以檢測(cè)到蛋白A的表達(dá)。表明載體構(gòu)建成功并可以應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的擔(dān)載蛋白的組織工程纖維支架及其制備和體外釋放實(shí)驗(yàn)實(shí)施作詳細(xì)說明以下實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。以下實(shí)施例中載體及基因來源說明特異引物由上海生工合成；載體構(gòu)建中使用的限制性內(nèi)切酶BamIII、NotI、pfu酶和T4連接酶均!^ermentas公司產(chǎn)品(生工生物工程 (上海)有限公司，021-37772180)；載體構(gòu)建中使用的DNA純化試劑盒為索萊寶公司(上海索寶生物科技有限公司，上海市徐匯區(qū)欽江路)產(chǎn)品，按說明書進(jìn)行；載體轉(zhuǎn)染(PEI為sigma公司產(chǎn)品)及分泌表達(dá)檢測(cè)試劑均為市售試劑。未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1pGreen Maxl真核表達(dá)載體構(gòu)建方法A、設(shè)計(jì)引物根據(jù)Mex序列設(shè)計(jì)引物，上游引物加入RiieI位點(diǎn)，引物序列如下Mex FGATATCGTTT AAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGATMex R TGAGGCCTGAGTTCAGACCGGTB、目的片段的克隆以帶有Mex的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增模板1 μ 1，上下游引物10 μ M各1 μ 1， 2. 5mM的dNTP底物4 μ 1，10倍緩沖液5 μ 1，pfu聚合酶1 μ 1，雙蒸水37 μ 1 ；95°C變性2分子；然后94°C變性30秒、55-65°C退火30秒、72°C延伸50秒，進(jìn)行30-40個(gè)循環(huán)；最后72°C 延伸7-10分鐘；C、擴(kuò)展產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后，可見一條約647bp的擴(kuò)增條帶，將目的條帶切下，用公司瓊脂糖凝膠純化試劑盒進(jìn)行純化，方法是C-I、從瓊脂糖凝膠中將PCR產(chǎn)物DNA條帶切下，轉(zhuǎn)入離心管中，加入2倍體積的結(jié)合緩沖液，55°C下溫浴7分鐘使得凝膠溶解；C-2、將離心管中溶解的凝膠溶液轉(zhuǎn)移到試劑盒自帶的DNA吸附柱中，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；C-3、向DNA吸附柱中加入700 μ 1漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液，再加入500 μ 1漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心 2分鐘，室溫放置5分鐘；C-4、將DNA吸附柱加入一個(gè)新的離心管中，加入65°C預(yù)熱的洗脫緩沖液70 μ 1， 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，離心管底的溶液即為回收的PCR產(chǎn)物DNA片段。如圖1所示，可以看到500bp到750bp之間有一個(gè)明顯的條帶，條帶大小與預(yù)期的 647bp大致相等，與預(yù)期相符，表明Mex序列PCR成功。D、pMex真核表達(dá)載體的構(gòu)建D-1、酶切將載體用SmaI酶切，酶切的片段和載體經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收的方法是在反應(yīng)體系中加入10倍緩沖液2 μ 1，SmaI 1 μ 1，載體5 μ 1，無離子水 12 μ 1，37°C水浴4個(gè)小時(shí)。D-2、連接回收的Mex片段和載體用T4連接美俄進(jìn)行體外連接反應(yīng)方法是在反應(yīng)體系中加入回收的PCR產(chǎn)物DNA片段8μ 1和載體片段2μ 1，10倍緩沖液2μ 1，T4DNA連接酶1 μ 1，去離子水7 μ 1，16°C反應(yīng)10h。D-3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素100μ 1/ml的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)，方法是a、取連接產(chǎn)物IOul加到50ul的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻，冰浴30min.b、42°C熱激90s，快速轉(zhuǎn)到冰浴2_;3min，注意不要搖動(dòng)管。c、向管中加入 500ul 的 LB 培養(yǎng)基，150rmp，37°C，45min.
d、將菌液全部涂到LB平板上，含100ug/ml Amp.e、將平板正置直至液體全部吸收。f、倒置平板，于37°C培養(yǎng)12_16h.D-4、篩選重組真核表達(dá)載體的陽性克隆將菌落放大培養(yǎng)，純化提取質(zhì)粒，方法是a.挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落，接種到2ml含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C，150rpm，搖床培養(yǎng) 12 16hr。b.取l_1.5ml培養(yǎng)物倒入1. 5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然后再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩余菌液4°C保存。c.將細(xì)胞沉淀漩渦震蕩打散后，重懸于ΙΟΟμ 1冰預(yù)冷的堿裂解液I中，漩渦震蕩， 使細(xì)菌懸浮均勻。d.細(xì)菌重懸液中加入200 μ 1堿裂解液II，上下翻轉(zhuǎn)離心管5次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(< 5min)。e.加入150 μ 1冰預(yù)冷的堿裂解液III，上下翻轉(zhuǎn)離心管8次，使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，并將離心管置于冰上1 3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400 μ 1的上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中。f.加400μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震蕩充分混合有機(jī)相和水相，13000rpm 離心2min，取上清于新離心管中。g.用2 2. 5體積的乙醇(850 μ 1)室溫沉淀核酸，混合均勻，室溫靜置2min。 13000rpm離心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉。h.加Iml左右70%乙醇于沉淀中，顛倒離心管數(shù)次，洗滌管壁與沉淀，如沉淀偏離管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出(若沉淀漂浮，用槍頭將其置于離心管底部)。i.打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發(fā)，直至離心管內(nèi)沒有可見的液體存在。j.加50 μ 1 TE緩沖液(含2 μ g/ml RNaseA)于離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻。貯存于_20°C。D-5、酶切鑒定和測(cè)序，證實(shí)得到的序列是真核表達(dá)質(zhì)粒，方法是在反應(yīng)體系中加入提取的重組真核表達(dá)載體5 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，限制性內(nèi)切酶SpeI 1μ 1，去離子水13μ 1，37°C反應(yīng)；如圖2所示，經(jīng)過SpeI酶切后，可以切出1. 31Λ和5. 31Λ兩個(gè)條帶，與預(yù)期相符， 表明Mex片段已正確的插入到載體當(dāng)中；E、得到 IRES-EGFP 序列在質(zhì)粒中利用BamHI和NotI雙酶切得到IRES-EGFP序列，并經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見一條約1300bp的條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進(jìn)行純化如圖3所示，經(jīng)過BamHI和NotI酶切，載體大小為6. 61Λ，IRES-EGFP序列為1. 3kb, 與預(yù)期大小相符。
F、pGreen Max真核表達(dá)載體的構(gòu)建F-1、酶切將載體用BamHI和NotI雙酶切，酶切后的載體片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收。方法是在反應(yīng)體系中加入10倍緩沖液2 μ 1，BamHI 1 μ l,NotI μ 1， pMex載體5μ 1，無離子水12μ 1，37°C水浴4個(gè)小時(shí)。F-2、連接回收的IRES-EGFP片段和載體用T4連接酶進(jìn)行體外連接反應(yīng)，方法是 在反應(yīng)體系中加入回收的DNA片段8μ 1和載體片段2μ 1，10倍緩沖液2μ 1，T4DNA連接酶 1μ 1，去離子水7μ 1，16°C反應(yīng)IOh0F-3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐霉素 100 μ 1/ml的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)；F-4、篩選重組真核表達(dá)載體的陽性克隆將菌落放大培養(yǎng)，純化提取質(zhì)粒；F-5、利用HindIII進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序，證實(shí)得到序列1的pMex真核表達(dá)質(zhì)粒。 方法是在反應(yīng)體系中加入提取的重組真核表達(dá)載體5 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，限制性內(nèi)切酶HindIII 1 μ 1，去離子水13 μ 1，37°C反應(yīng)濁；如圖4所示，用瓊脂糖凝膠電泳分離后鑒定pGreen Max 1的目的條帶，經(jīng)過 HindIII酶切，可以切出三個(gè)條帶，分別是4. 9kb,2. 9kb和230bp的條帶，與預(yù)期條帶相符， 表明IRES-EGFP序列已經(jīng)正確插入到pMex載體當(dāng)中。進(jìn)行重組真核表達(dá)載體的測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示該重組真核表達(dá)載體的序列1大小為，在與Mex、IRES-EGFP序列完全一致，說明成功構(gòu)建了命名為pGreen Max 1真核表達(dá)載體，如序列1所示。實(shí)施例2真核表達(dá)載體的表達(dá)蛋白A、重組真核表達(dá)載體的獲得以蛋白A和蛋白B為例來進(jìn)行說明。A-I、得到含有蛋白A和抗體B的重組載體通過PCR等技術(shù)獲得蛋白A和抗體B的序列，利用T4DNA連接酶的體外連接，得到含有蛋白A和抗體B的重組載體。A-2、重組表達(dá)載體的提取與純化用于轉(zhuǎn)染的pGreen Max 1重組蛋白A和pGreen Max 1重組抗體B的質(zhì)粒用質(zhì)粒小量抽提的方法進(jìn)行提取與純化，具體操作步驟如下a.挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落，接種到2ml含有氨芐青霉素(100μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C，150rpm，搖床培養(yǎng) 12 16hr。b.取l_1.5ml培養(yǎng)物倒入1. 5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然后再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩余菌液4°C保存。c.將細(xì)胞沉淀漩渦震蕩打散后，重懸于100μ 1冰預(yù)冷的堿裂解液I中，漩渦震蕩， 使細(xì)菌懸浮均勻。d.細(xì)菌重懸液中加入200 μ 1堿裂解液II，上下翻轉(zhuǎn)離心管5次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(< 5min)。e.加入150 μ 1冰預(yù)冷的堿裂解液III，上下翻轉(zhuǎn)離心管8次，使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，并將離心管置于冰上1 3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400 μ 1的上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中。f.加400μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震蕩充分混合有機(jī)相和水相，13000rpm 離心2min，取上清于新離心管中。g.用2 2. 5體積的乙醇(850 μ 1)室溫沉淀核酸，混合均勻，室溫靜置2min。 13000rpm離心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉。h.加Iml左右70%乙醇于沉淀中，顛倒離心管數(shù)次，洗滌管壁與沉淀，如沉淀偏離管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出(若沉淀漂浮，用槍頭將其置于離心管底部)。i.打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發(fā)，直至離心管內(nèi)沒有可見的液體存在。j.加50 μ 1 TE緩沖液(含2 μ g/ml RNaseA)于離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻。貯存于_20°C。B、蛋白A重組真核表達(dá)載體和抗體B重組真核表達(dá)載體在細(xì)胞中的分泌表達(dá)轉(zhuǎn)染腺病毒ElA基因的人腎上皮細(xì)胞系四31~細(xì)胞培養(yǎng)與含有10% FCS(胎牛血清)的DMEM完全培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞均勻的鋪在IOcm培養(yǎng)皿中，具體步驟按照PEI介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行1、分別將DNA和PEI加入無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)液Iml中混勻，然后將兩液混合成轉(zhuǎn)染液，室溫放置10-20分鐘；2、吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用無抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)液輕輕洗兩次，加入 3ml無抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)液；3、按蛋白A重組表達(dá)載體IOyg/皿，將轉(zhuǎn)染液逐滴加入培養(yǎng)皿中，置于5% 二氧化碳、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)后，置換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)M-48小時(shí)后，手機(jī)細(xì)胞培養(yǎng)上清；4、取轉(zhuǎn)染上清，用濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，通過免疫印記 (Western Blot)檢測(cè)蛋白A和抗體B的分泌表達(dá)情況。如圖5所示，轉(zhuǎn)染以后，細(xì)胞中可以表達(dá)綠熒光蛋白，可以用于細(xì)胞株的篩選。如圖6所示，轉(zhuǎn)染以后，在細(xì)胞的上清中可以檢測(cè)到蛋白A的表達(dá)。表明載體構(gòu)建成功并可以應(yīng)用。如圖7所示，蛋白為抗體B的蛋白。蛋白大小為19kD左右。通過圖片可以很好的看出細(xì)胞上清中含有該抗體并且可以很好的檢測(cè)出該蛋白，表明該載體可以應(yīng)用。上述實(shí)施例pGreen Max 1真核表達(dá)載體作為在真核細(xì)胞中獲取目的蛋白或抗體的應(yīng)用，用于制備大量所需目的蛋白以進(jìn)行臨床前研究，并為高產(chǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞株的篩選提供蛋白表達(dá)及篩選的標(biāo)記，為蛋白高效表達(dá)提供了很好的載體，也為細(xì)胞株的篩選提供一種新的方法和便利。
權(quán)利要求
1.一種pGreen Maxl真核表達(dá)載體，其特征在于，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表達(dá)載體重組獲得序列1，序列1共計(jì)7976bp，其中在第1769bp-2415bp之閥插入了含有647bp 的Mex片段，在第3120bp-4^8bp之間插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的pGreen Maxl真核表達(dá)載體的制備方法，其特征在于， 包括設(shè)計(jì)引物從質(zhì)粒中通過PCR的方法克隆得到Mex，并將PCR產(chǎn)物經(jīng)過SmaI位點(diǎn)定向插入到表達(dá)載體中，并經(jīng)過BamHI和NotI雙酶切將IRES-EGFP插入到載體中，構(gòu)建重組的 pGreen Max真核表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的pGreenMaxl真核表達(dá)載體的制備方法，其特征是，包括如下步驟A、設(shè)計(jì)引物根據(jù)Mex序列設(shè)計(jì)引物，上游引物加入RiieI位點(diǎn)，引物序列如下 Mex F :GATATCGTTT AAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGATMex R TGAGGCCTGAGTTCAGACCGGTB、目的片段的克隆以帶有Mex的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增模板Iy1，上下游引物 ΙΟμΜ各1μ 1，2. 5mM的dNTP底物4μ 1，10倍緩沖液5μ l，pfu聚合酶1μ 1，雙蒸水37μ 1 ； 95°C變性2分子；然后94°C變性30秒、55_65°C退火30秒、72°C延伸50秒，進(jìn)行30-40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7-10分鐘；C、擴(kuò)增產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，將一條約647bp的擴(kuò)增目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進(jìn)行純化；D、pMex真核載體的構(gòu)建D-1、酶切將載體用SmaI酶進(jìn)行酶切，酶切時(shí)在反應(yīng)體系中加入10倍緩沖液2 μ 1， SmaI 1μ 1，載體5μ 1，無離子水12μ 1，37°C水浴4個(gè)小時(shí)，酶切后的載體片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收；D-2、連接回收的Mex的片段和載體用T4連接酶進(jìn)行體外連接反應(yīng)； D-3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐霉素 100 μ 1/ml的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)；D-4、篩選重組真核表達(dá)載體的陽性克隆將菌落放大培養(yǎng)，純化提取質(zhì)粒； D-5、利用SpeI進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序，證實(shí)得到序列1的pMex真核表達(dá)質(zhì)粒；E、得到IRES-EGFP序列在質(zhì)粒中利用BamHI和NotI雙酶切得到IRES-EGFP序列，并經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離后，將一條約1300bp的目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進(jìn)行純化；F、pGreenMax 1真核表達(dá)載體的構(gòu)建F-1、酶切將載體用BamHI和NotI雙酶切，酶切時(shí)在反應(yīng)體系中加入10倍緩沖液 2 μ 1，BamHIly 1, NotIy 1, pMex載體5 μ 1，無離子水12 μ 1，37°C水浴4個(gè)小時(shí)，酶切后的載體片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收；F-2、連接回收的IRES-EGFP片段和載體用T4連接酶進(jìn)行體外連接反應(yīng)； F-3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐霉素 100 μ 1/ml的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)；F-4、篩選重組真核表達(dá)載體的陽性克隆將菌落放大培養(yǎng)，純化提取質(zhì)粒； F-5、利用HindIII進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序，證實(shí)得到序列1的pMex真核表達(dá)質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的pGreenMaxl真核表達(dá)載體的制備方法，其特征是，步驟C中所述的PCR產(chǎn)物，其純化方法步驟如下①從瓊脂糖凝膠中將PCR產(chǎn)物DNA條帶切下，轉(zhuǎn)入離心管中，加入2倍體積的結(jié)合緩沖液，55°C下溫浴7分鐘使得凝膠溶解；②將離心管中溶解的凝膠溶液轉(zhuǎn)移到試劑盒自帶的DNA吸附柱中，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心 2分鐘；③向DNA吸附柱中加入700μ 1漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液，再加入500 μ 1漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，室溫放置5分鐘；④將DNA吸附柱加入一個(gè)新的離心管中，加入65°C預(yù)熱的洗脫緩沖液70μ 1，13000轉(zhuǎn) /分鐘離心2分鐘，離心管底的溶液即為回收的PCR產(chǎn)物DNA片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的pGreenMaxl真核表達(dá)載體的制備方法，其特征是，步驟D-2 中所述的連接，其連接方法如下在反應(yīng)體系中加入回收的PCR產(chǎn)物DNA片段8 μ 1和載體片段2 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，去離子水7μ 1，16°C反應(yīng)10h。步驟F_2 所述的連接方法是在反應(yīng)體系中加入回收的DNA片段8 μ 1和載體片段2 μ 1，10倍緩沖液 2 μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，去離子水7μ 1，16°C反應(yīng)10h。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的pGreenMaxl真核表達(dá)載體的制備方法，其特征是，步驟D-3 所述的轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其轉(zhuǎn)化大腸桿菌方法步驟如下①取連接產(chǎn)物IOul加到50ul的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻，冰浴30min.；②42°C熱激90s，快速轉(zhuǎn)到冰浴2-aiiin，注意不要搖動(dòng)管；③向管中加入500ul的LB培養(yǎng)基，150rmp，37°C，45min.；④將菌液全部涂到LB平板上，含100ug/mlAmp.；⑤將平板正置直至液體全部吸收；⑥倒置平板，于37°C培養(yǎng)12-16h.。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的pGreenMaxl真核表達(dá)載體的制備方法，其特征是，步驟D-4 中所述的篩選重組真核表達(dá)載體陽性克隆，其篩選重組真核表達(dá)載體陽性克隆方法步驟如下①挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落，接種到2ml含有氨芐青霉素(100yg/ml)的LB培養(yǎng)基中， 37°C，150rpm，搖床培養(yǎng) 12 IMir ；②取1-1.5ml培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然后再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩余菌液4°C保存；③將細(xì)胞沉淀漩渦震蕩打散后，重懸于100μ 1冰預(yù)冷的堿裂解液I中，漩渦震蕩，使細(xì)菌懸浮均勻；④細(xì)菌重懸液中加入200μ 1堿裂解液II，上下翻轉(zhuǎn)離心管5次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上< 5min ；⑤加入150μ 1冰預(yù)冷的堿裂解液III，上下翻轉(zhuǎn)離心管8次，使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，并將離心管置于冰上1 :3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400μ 1 的上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中；⑥加400μ1體積比為1 1的酚氯仿，震蕩充分混合有機(jī)相和水相，13000rpm離心2min，取上清于新離心管中；⑦用2 2.5體積的乙醇850 μ 1室溫沉淀核酸，混合均勻，室溫靜置anin。13000rpm 離心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉；⑧加Iml左右70%乙醇于沉淀中，顛倒離心管數(shù)次，洗滌管壁與沉淀，如沉淀偏離管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出，若沉淀漂浮，用槍頭將其置于離心管底部；⑨打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發(fā)，直至離心管內(nèi)沒有可見的液體存在；⑩加含20μ g/ml RNase A的50 μ 1 TE緩沖液于離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻， 貯存于-20°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的pGreenMaxl真核表達(dá)載體的制備方法，其特征是，步驟D-5 中所述的酶切鑒定和測(cè)序，其酶切鑒定和測(cè)序方法如下在反應(yīng)體系中加入提取的重組真核表達(dá)載體5 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，限制性內(nèi)切酶 SpeI Iy 1，去離子水13μ 1，37°C反應(yīng)池；經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離后鑒定pMex的目的條帶，SpeI酶切后可切出約1. 3kb和5. 3kb的兩個(gè)片段，表明目的片段已正確的插入載體中。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的pGreenMaxl真核表達(dá)載體的制備方法，其特征是，步驟F-5 中的酶切鑒定和測(cè)序，其酶切鑒定和測(cè)序方法如下在反應(yīng)體系中加入提取的重組真核表達(dá)載體5 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，限制性內(nèi)切酶 HindIII Iy 1，去離子水13μ 1，37°C反應(yīng)濁；經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離后鑒定pGreen Maxl的目的條帶，HindIII酶切后可切出約4. 9kb,2. 9kb和230bp的三個(gè)片段，表明目的片段已正確的插入載體中。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的pGreen Maxl真核表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于， PGreen Maxl真核表達(dá)載體作為在真核細(xì)胞中獲取目的蛋白或抗體的應(yīng)用，并為高產(chǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞株的篩選提供蛋白表達(dá)及篩選的標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的pGreen Max1真核表達(dá)載體及其制備方法。由Mex、IRES-EGFP片段和真核表達(dá)載體重組獲得序列1，序列1共計(jì)7976bp，其中在第1769bp-2415bp之間插入了含有647bp的Mex片段，在第3120bp-4428bp之間插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列；制備方法包括設(shè)計(jì)引物從質(zhì)粒中通過PCR的方法克隆得到Mex，并將PCR產(chǎn)物經(jīng)過SmaI位點(diǎn)定向插入到表達(dá)載體中，并經(jīng)過BamHI和NotI雙酶切將IRES-EGFP插入到載體中，構(gòu)建重組的pGreenMax真核表達(dá)載體。本發(fā)明載體作為在真核細(xì)胞中獲取目的蛋白或抗體的應(yīng)用，并為高產(chǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞株的篩選提供蛋白表達(dá)及篩選的標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102242143SQ20111009937
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者徐維果, 李大偉, 武正華, 金龍 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)