專利名稱：探針?lè)z測(cè)cho細(xì)胞dna含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA(即中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞基因組DNA)含量的方法。
背景技術(shù)：
基因工程領(lǐng)域所用基因表達(dá)系統(tǒng)大致分為原核、酵母、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。與其它系統(tǒng)相比，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的糖基化修飾，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)也日漸成熟和完善。因此，通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)制備治療性重組蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)成為當(dāng)今生物制藥領(lǐng)域的主流技術(shù)，目前已經(jīng)上市和正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的蛋白質(zhì)藥物中，70%來(lái)自于哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 而這其中CHO細(xì)胞是最常用的細(xì)胞系。為了確保治療性重組蛋白質(zhì)藥物的產(chǎn)品質(zhì)量，歐美食品和藥品管理局以及我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局都對(duì)藥品中宿主細(xì)胞殘留DNA量提出了明確的要求。分子雜交分析以及Threshold immunoassay分析具有靈敏度低、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、不易定量檢測(cè)等缺陷?；蚩截悢?shù)是指某一種基因或某一段特定的DNA序列在基因組中出現(xiàn)的次數(shù)。對(duì) CHO細(xì)胞基因工程細(xì)胞株進(jìn)行基因拷貝數(shù)的分析對(duì)于評(píng)價(jià)基因工程細(xì)胞株的穩(wěn)定性、遺傳特性具有重要的意義。而選擇合適的內(nèi)參是準(zhǔn)確分析某一特定基因拷貝數(shù)的基礎(chǔ)。定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、 自動(dòng)化程度高和實(shí)時(shí)性等特點(diǎn)。Taqman探針是基于與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)的一類寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’端，而淬滅基團(tuán)則在3’末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。 隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。Taqman探針技術(shù)因其靈敏度較高，特異性強(qiáng)，是目前備受推崇的熒光定量PCR 使用技術(shù)。MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度。本發(fā)明的熒光PCR方法采用Taqman探針技術(shù)，克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法靈敏度低、實(shí)施費(fèi)用高等缺點(diǎn)，提供一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)、準(zhǔn)確率高的定量熒光PCR檢測(cè)方法以及用于該方法的試齊U盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)來(lái)定性與定量檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA 的方法，本方法可用于檢測(cè)治療蛋白質(zhì)藥物、重組疫苗及單克隆抗體等產(chǎn)品CHO細(xì)胞殘留DNA，從而對(duì)重組蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)。本發(fā)明采用GeneBank登錄號(hào)為EF540878. 1的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異引物和 Taqman探針，以提取的CHO細(xì)胞基因組DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種熒光定量PCR檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA的方法，采用GeneBank登錄號(hào)為EF540878. 1 的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)及Taqman探針，對(duì)待測(cè)樣本提取DNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待檢樣本中CHO細(xì)胞DNA的量。所述待檢樣本可為但不限于CHO細(xì)胞表達(dá)或生產(chǎn)的治療蛋白質(zhì)藥物、重組疫苗或單克隆抗體。所述的特異引物對(duì)序列為Primer-F 的核苷酸序列為5，-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3，(SEQ ID NO 1)；Primer-R 的核苷酸序列為5，-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3，(SEQ ID NO 2)；所述Taqman探針序列核苷酸為Probe :5，-CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3，(SEQ ID NO :3)。其中所述Taqman探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，熒光報(bào)告基團(tuán)優(yōu)選為FAM，也可為其它具有相似功能的基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)，淬滅基團(tuán)為MGB或BHQ1，也可為其它具有相似功能的基團(tuán)。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)反應(yīng)體系中含有DNA模板、Taq酶、dNTPs、Rox染料、 Mg2+、PCR緩沖液、Taqman探針、正向引物和反向引物。Taq酶、dNTPs、Rox染料、Mg2+及PCR 緩沖液均為常見組分，其含量亦為常規(guī)。一般而言，所述PCR反應(yīng)體系中，正向引物濃度為0. 2-lymol/L，反向引物濃度為0. 2-1 μ mol/L，探針濃度為0. 2-3ymol/L, Taq酶用量為 50000-200000U/L，dNTP 含量為 0. 1-0. 5mM/L, Mg2+ 濃度為 3. 0-6. OmM/L，引物總濃度為 0. 4-2. 0 μ mol/L, PCR緩沖液則稀釋為IX。反應(yīng)體系一般可設(shè)為30 μ L。所述DNA模板可以來(lái)自待測(cè)樣本，也可以來(lái)自參考品或陽(yáng)性質(zhì)控品。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，每次檢測(cè)均設(shè)立參考品，陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。參考品為CHO細(xì)胞基因組DNA，其DNA濃度可為1. 0X 107_5. 0X 107fg/μ L，如3. 0X107fg/ ul。使用時(shí)用DNA稀釋液稀釋成7個(gè)濃度梯度，分別為3.0X105fg/y l,3.0X104fg/y 1, 3. OX 103fg/ μ 1，3. 0X 102fg/ μ 1，3. 0X 101 / μ 1，及 3. Ofg/ μ 1。其中陽(yáng)性質(zhì)控品為 CHO 細(xì)胞基因組DNA，濃度可為3. OX 103fg/ul，陰性對(duì)照品為純水。所述DNA稀釋液可為常規(guī)。 優(yōu)選由EDTA、NaOH和iTris-HCl溶液配制而成，其中iTris-HCl濃度為5. 0-10. OmM/L, EDTA 的濃度為0. 5-1. OmM/L,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6. 0-8. 5。該DNA稀釋液能高效稀釋低濃度的DNA樣品，而且適合于PCR擴(kuò)增。所有待檢樣品均需通過(guò)提取后溶解于DNA稀釋液或純水中。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序優(yōu)選為95°C預(yù)變性IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待檢樣本中CHO細(xì)胞DNA的量?；谏鲜鰺晒舛縋CR檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA的方法，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種熒光定量PCR檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA的試劑盒，包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、參考品、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品以及DNA稀釋液，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液含有Taq酶、dNTPs、Rox染料、Mg2+、PCR緩沖液、正向引物、反向引物以及Taqman探針，其中，所述正向引物、反向引物及Taqman探針為Genebank登錄號(hào)為EF540878. 1序列的特異性引物及探針。較佳的，試劑盒中，所述正向引物、反向引物及Taqman探針的核苷酸序列如前所述。所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中，正向引物濃度為0.2-1.0ymol/L，反向引物濃度為
0.2-1. Oymol/L, Taqman 探針濃度為 0. 2-3. Oymol/L, Taq 酶用量為 50000-200000U/L， dNTP 含量為 0. 1-0. 5mM/L，Mg2+濃度為 3. 0-6. OmM/L，引物總濃度為 0. 4-2. 0 μ mol/L，PCR 緩沖液則稀釋為IX。所述參考品為CHO細(xì)胞基因組DNA，其CHO細(xì)胞基因組DNA的濃度可為
1.OX 107-5. 0X 107fg/y L，如3. 0X107f g/ul。其中陽(yáng)性質(zhì)控品為CHO細(xì)胞基因組DNA，濃度可為3. OX 103fg/ul，陰性對(duì)照品為純水。所述DNA稀釋液可為常規(guī)。優(yōu)選由EDTA、Na0H和 Tris-HCl溶液配制而成，其中iTris-HCl濃度為5. 0-10. 0mM/L, EDTA的濃度為0. 5-1. OmM/ L，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6. 0-8. 5。本發(fā)明的試劑盒可以與常規(guī)市購(gòu)DNA提取試劑盒組合使用，也可進(jìn)一步包括DNA 提取液，所述DNA提取液可采用常規(guī)市購(gòu)的DNA提取試劑盒中所含試劑。本發(fā)明提供的實(shí)施熒光定量PCR方法可以定量檢測(cè)出CHO細(xì)胞DNA的濃度低于 3. Ofg/ul，表明本方法具有非常好的靈敏度，且具有較高的特異性。本發(fā)明提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以檢測(cè)重組蛋白產(chǎn)程中間樣品、半成品、 成品等樣品中的CHO細(xì)胞殘留DNA，還為分析CHO細(xì)胞中特定基因的拷貝數(shù)提供內(nèi)參。可以為重組蛋白藥物的生產(chǎn)提供可靠的質(zhì)控證據(jù)，為重組蛋白藥物研發(fā)和安全生產(chǎn)提供重要支持。


圖1參考品擴(kuò)增曲線。擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，每個(gè)濃度的擴(kuò)增曲線均勻疊和在一起，表明本方法重復(fù)性好。圖2參考品標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖可知，當(dāng)參考品濃度為3.0X105fgl·! l，3.0X104fg/ μ 1,3. 0X103fg/y 1,3. 0X102fg/y 1,3. OXIO'fg/y 1,3. Ofg/μ 1 時(shí)，樣品的 Ct 值為-之間，檢測(cè)下線低于3. Ofg/ul。繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3. 445，相關(guān)系數(shù)(R2) = 0.999， 擴(kuò)增效率為95. 1%。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到3. Ofg/μ 1。圖3樣品定量分析的擴(kuò)增曲線。擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，表明提取樣品可用本方法進(jìn)行定量分析。圖4樣品定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)參考品濃度為3.0X106fg/y l，3.0X105fgy 1， 3. 0X104fgy 1,3. 0X103fgy 1,3. OX 102fg/μ 1，3. OX 101 /μ 1,3. Ofg/μ 1 時(shí)，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3. 351，相關(guān)系數(shù)(R2) = 1.0，擴(kuò)增效率為98. 789%。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性及擴(kuò)增效率良好，所分析樣品均在標(biāo)準(zhǔn)曲線分析范圍內(nèi)。圖5實(shí)施例3特異性分析擴(kuò)增曲線圖6實(shí)施例3特異性分析標(biāo)準(zhǔn)曲線
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，所列實(shí)例旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1 熒光定量PCR法檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA殘留的引物設(shè)計(jì)及參考品制備1、材料和試劑DNTPs, Taq DNA聚合酶、熒光染料及PCR緩沖液為市售產(chǎn)品，7500Fast熒光定量 PCR儀為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品，DNA稀釋液由本實(shí)驗(yàn)室采用分析純?cè)噭┡渲?，基因組 DNA提取試劑盒為美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品。2、引物及探針的設(shè)計(jì)與合成以 Genebank 登錄序列(Genebank 登錄號(hào) EF540878. 1)為模板，使用 Primer Primer 5. 0軟件(美國(guó)I^remierBiosoft公司)設(shè)計(jì)PCR引物及探針，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，從中選擇如下組合。Primer-F 的核苷酸序列為5，-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3，；Primer-R 的核苷酸序列為5，-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3，；Probe :5， -CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3，弓丨物及探針由上海生工生物工程有限公司合成。3、檢測(cè)參考品制備及檢測(cè)培養(yǎng)CHO細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS無(wú)菌洗滌2次，按基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取CHO細(xì)胞基因組DNA，分光光度法測(cè)定其在260nm(A-260)測(cè)定其濃度并稀釋成 30ng/y l(3.0X107fg/y 1)，分裝后_20°C儲(chǔ)存，作為參考品使用。取7支新的1. 5mL低吸附離心管，分別標(biāo)記為SDO、SDl、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6， 向每管中各加入45 μ L DNA稀釋緩沖液(Tris-HCl 10mM/L, EDTA ImM/L，pH為8)。SDO管中加入5yL CHO DNA參考品(3.0X107f g/ul)，渦旋混勻器充分混勻，之后每一管依次加入5 μ L上一濃度梯度稀釋液，各管加入DNA后均用渦旋混勻器充分混勻，再進(jìn)行下一個(gè)梯度稀釋。參考品制備后，配置如下PCR反應(yīng)體系PCR 體系=PCR 緩沖液(IOX) 3. O μ 1 ；dNTP (2mM/L) 2. O μ 1 ；MgCl2 (50mM/L) 2. O μ 1 ； Rox 染料(50Χ)0·6μ 1 ；正向引物(ΙΟμπιοΙ/υ .Ομ 1 ；反向引物(ΙΟμπιοΙ/υ .Ομ 1 ；探針 (10ymol/L)l. 5μ 1 Taq 酶(50U/μ 1)0. 1μ 1 ；模板 9.5 μ 1 ；純水 9.3 μ 1。PCR反應(yīng)體系配置完成后，在ABI 7500Fast型熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為95°C預(yù)變性IOmin ；95°C 15s，60°C 60s, 40個(gè)循環(huán)；分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，圖2所示。實(shí)施例2熒光定量PCR法檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA濃度在分析CHO細(xì)胞基因拷貝數(shù)的應(yīng)用1、目的為分析目的基因的基因拷貝數(shù)提供內(nèi)參。2、制備 CHO 細(xì)胞 DNA收集不同細(xì)胞株、不同傳代次數(shù)的CHO細(xì)胞，用基因組DNA提取試劑盒提取基因組 DNA，先用分光光度法初步測(cè)定所提基因組DNA的濃度，將樣品做適當(dāng)稀釋，使各樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。3、選用7個(gè)濃度的參考品，參考品濃度分別為3.0X106fg/l·! l，3.0X105fg/l·! 1，3. 0X104fg/y 1,3. 0X103fg/y 1，3. OX 102fg/μ 1,3. OX IOlfg/μ 1,3. Ofg/μ 1 參考實(shí)施例1所述方法進(jìn)行定量PCR分析。擴(kuò)增結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3，圖4所示。4、通過(guò)定量PCR方法分析目的基因的表達(dá)情況，再以各個(gè)樣品CHO細(xì)胞DNA濃度為內(nèi)參進(jìn)行校正。實(shí)施例3熒光定量PCR法檢測(cè)CHO細(xì)胞殘留DNA的應(yīng)用及特異性分析1、制備包括以下PCR擴(kuò)增反應(yīng)液及稀釋液PCR 體系=PCR 緩沖液(IOX) 3. 0 μ 1 ；dNTP (2mM/L) 2. 0 μ 1 ；MgCl2 (50mM/L) 2. 0 μ 1 ； Rox 染料(50Χ)0·6μ 1 ；正向引物(10μπιο1/υ ·0μ 1 ；反向引物(10μπιο1/υ ·0μ 1 ；探針 (10ymol/L)l. 5μ 1 Taq 酶(50U/μ 1)0. 1μ 1 ；模板 9.5 μ 1 ；純水 9.3 μ 1。DNA稀釋液以去離子水為溶劑，Tris-HCl濃度為5. 0mM/L,EDTA的濃度為1. OmM/ L，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為8. 0。2、樣品采集、運(yùn)送和保存樣品采集包括各種用CHO細(xì)胞做為宿主細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白藥物半成品、成品等，按照國(guó)家生物制品檢定所取樣要求進(jìn)行操作，密封送檢。用作分析本方法特異性所用細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)、質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室自制。樣品保存和運(yùn)送樣品可立即用于檢測(cè)，也可保存于-20°C待檢，保存期為6個(gè)月。 樣品運(yùn)送時(shí)應(yīng)保存于0°c -8°c。3、檢測(cè)步驟a)樣品處理與DNA提取本例測(cè)定樣品包括Wil2_S細(xì)胞基因組DNA(30pg/l·! 1)，正常人血清基因組DNA(批號(hào)CP18)，pHLXlOl質(zhì)粒(IO7拷貝/ μ 1)，利妥昔單克隆抗體成品(羅氏公司，批號(hào) Β6029)，HLX-01單克隆抗體半成品(本公司生產(chǎn)，批號(hào)RS20110102)，CHO細(xì)胞基因組DNA 樣品(提取的CHO基因組DNA做為陽(yáng)性樣品，紫外分光光度法定量其濃度為30pg/ul)。采用磁珠富集法提取DNA。提取樣品時(shí)，同時(shí)提取陽(yáng)性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品，陰性質(zhì)控品用于判斷提取過(guò)程中有無(wú)污染，陽(yáng)性質(zhì)控品用于測(cè)定提取收率。所有待檢樣品均需通過(guò)提取后溶解于試劑盒所帶DNA稀釋液或純水中。b) PCR擴(kuò)增與結(jié)果分析檢測(cè)時(shí)設(shè)立參考品，陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。參考品使用時(shí)用DNA稀釋液稀釋成 6 個(gè)濃度梯度，分別為 3. 0X 105fg/ μ 1, 3. 0X 104fg/ μ 1, 3. 0X 103fg/ μ 1, 3. 0X 102fg/ μ 1，3. OXIOWg/y 1，及 3. Ofg/μ 1。PCR反應(yīng)液配置完成后。在ABI 750(FaSt型熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為95°C預(yù)變性IOmin ；95°C 15s,60°C lmin,40個(gè)循環(huán)。同時(shí)加參考品檢測(cè)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.998，大于 0. 99，擴(kuò)增效率為104%介于95% -105%之間。測(cè)定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測(cè)樣品中CHO細(xì)胞DNA殘留量，樣品檢測(cè)結(jié)果如附圖5、圖6所示，其中Wi 12-S細(xì)胞基因組 DNA，正常人血清基因組DNA，pHLXlOl質(zhì)粒，利妥昔單克隆抗體成品，HLX-01單克隆抗體原液，檢測(cè)結(jié)果Ct值均低于檢測(cè)下限；CHO細(xì)胞基因組DNA樣品的Ct值為19. 34，參照同一次實(shí)驗(yàn)中線性定量參考品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可以判定樣品中CHO細(xì)胞殘留DNA的濃度為33. 7pg/ PL·結(jié)果表明本試劑盒具有較好的專一性。
實(shí)施例4試劑盒的制備本方法也可進(jìn)一步開發(fā)為檢測(cè)試劑盒，實(shí)施例如下制備包括以下組成成分的試劑盒DNA稀釋液(lml/管)1管、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液(lml/管)1管、陰性質(zhì)控品(150 μ 1/ 管)2管、陽(yáng)性質(zhì)控品(150 μ 1/管)2管、參考品(50 μ 1/管)1管。陽(yáng)性質(zhì)控品為CHO細(xì)胞基因組DNA，濃度可為3. 0 X 103fg/ul。所述陰性對(duì)照品為純水。參考品為CHO細(xì)胞基因組DNA，濃度為3. 0 X 107fg/ul。DNA稀釋液(選自以下任一)配方一以去離子水為溶劑，Tris-HCl濃度為5. OmM/L, EDTA的濃度為1. OmM/L, 用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為8. 5。配方二 以去離子水為溶劑，Tris-HCl濃度為8mM/L，EDTA的濃度為0. 7mM/L,用 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為8.0。配方三以去離子水為溶劑，Tris-HCl濃度為10. OmM/L, EDTA的濃度為0. 5mM/L, 用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6.0。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)液Taq 酶 100000U/L，dNTP 含量為 0. 5mM/L, Mg2+ 濃度為 5mM/L，Rox 染料(50X)20ml/L, PCR緩沖液(IOX) 100ml/L，正向引物濃度為0. 5 μ mol/L，反向引物濃度為0. 5 μ mol/L, Taqman探針濃度為0. 8 μ mol/L,混合配置。試劑盒準(zhǔn)備完成后，儲(chǔ)存于-20°C。
權(quán)利要求
1.一種熒光定量PCR檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA的方法，采用GeneBank登錄號(hào)為EF540878. 1 的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)及Taqman探針，對(duì)待測(cè)樣本提取DNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待檢樣本中CHO細(xì)胞DNA的量。
2.如權(quán)利要求1所述熒光定量PCR檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA的方法，其特征在于，所述的特異引物對(duì)包括正向引物I^rimer-F和反向引物I^rimer-R，其中Primer-F 序列為5，-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3，，Primer-R 序列為5’ -TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3，；所述 Taqman 探針序列為5’ -CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3，。
3.如權(quán)利要求1所述熒光定量PCR檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)反應(yīng)體系中含有DNA模板、Taq酶、dNTPs、Rox染料、Mg2+、PCR緩沖液、 Taqman探針、正向引物和反向引物。
4.如權(quán)利要求1所述熒光定量PCR檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，每次檢測(cè)均設(shè)立參考品，陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。
5.如權(quán)利要求1所述熒光定量PCR檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40個(gè)循環(huán)。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述熒光定量PCR檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA的方法，其特征在于，所述待檢樣本可為但不限于CHO細(xì)胞表達(dá)或生產(chǎn)的治療蛋白質(zhì)藥物、重組疫苗或單克隆抗體。
7.一種熒光定量PCR檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA的試劑盒，包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、參考品、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品以及DNA稀釋液，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液含有Taq酶、dNTPs、R0X染料、 Mg2+、PCR緩沖液、正向引物、反向引物以及Taqman探針，其中，所述正向引物、反向引物及 Taqman探針為Genebank登錄號(hào)為EF540878. 1序列的特異性引物及探針。
8.如權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述的特異引物對(duì)包括正向引物ft~imer-F 和反向引物I^imer-R，其中Primer-F 序列為5’ -ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3’ ；Primer-R 序列為5’ -TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3，；所述 Taqman 探針序列為5’ -CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3，。
9.如權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中，正向引物濃度為 0. 2-1. 0 μ mol/L,反向引物濃度為 0. 2-1. 0 μ mol/L, Taqman 探針濃度為 0. 2-3. 0 μ mol/L, Taq 酶用量為 50000-200000U/L，dNTP 含量為 0. 1-0. 5mM/L, Mg2+ 濃度為 3. 0-6. OmM/L，引物總濃度為0. 4-2. 0 μ mol/L, PCR緩沖液則稀釋為IX。
10.如權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述參考品為CHO細(xì)胞基因組DNA，所述陽(yáng)性質(zhì)控品為CHO細(xì)胞基因組DNA，所述陰性對(duì)照品為純水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種探針?lè)z測(cè)CHO細(xì)胞DNA含量的方法，采用GeneBank登錄號(hào)為EF540878.1的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)及Taqman探針，對(duì)待測(cè)樣本提取DNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待檢樣本中CHO細(xì)胞DNA的量。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了基于該方法的試劑盒。本發(fā)明可以精確定量檢測(cè)來(lái)源于CHO細(xì)胞的治療蛋白質(zhì)藥物、重組疫苗及單克隆抗體等產(chǎn)品中CHO細(xì)胞殘留DNA含量，本方法還為分析CHO細(xì)胞中特定基因的拷貝數(shù)提供內(nèi)參。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154503SQ20111009920
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者劉世高, 周雙宬, 姜偉東, 張二輝, 郎國(guó)竣, 郭新軍, 馬辰 申請(qǐng)人:上海復(fù)宏漢霖生物技術(shù)有限公司