專利名稱：檢測細(xì)胞內(nèi)氫離子的熒光探針及合成方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于檢測細(xì)胞內(nèi)氫離子的熒光探針；本發(fā) 明還涉及該熒光探針的合成方法；另外，該發(fā)明還涉及該熒光探針的用途。
背景技術(shù)：
氫離子濃度作為一個(gè)重要的新陳代謝及細(xì)胞內(nèi)的參數(shù)，在許多細(xì)胞過程中起到關(guān) 鍵的調(diào)節(jié)作用，比如細(xì)胞生長、鈣離子調(diào)節(jié)、酶活性、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)吞作用、化 學(xué)向性及其他的細(xì)胞過程。許多報(bào)道認(rèn)為一些疾病如癌癥、腎衰竭、肺病等與細(xì)胞質(zhì) 或者酸性細(xì)胞器內(nèi)的pH異常有關(guān)。因此，細(xì)胞內(nèi)pH的精確測量是非常重要的。目前，許多方法可用于檢測pH。比如微電極、核磁、吸收及熒光光譜方法。在 這些方法中，熒光法由于其非入侵的性質(zhì)、高的靈敏度和專一性，以及廣泛可用的熒 光染料在測定pH時(shí)比其他方法更為優(yōu)越。而且，熒光顯微成像技術(shù)通過使用熒光pH 探針能夠捕捉到細(xì)胞內(nèi)氫離子的時(shí)空分辨?，F(xiàn)在，兩類熒光pH探針已經(jīng)被開發(fā)， 一類是用于檢測細(xì)胞質(zhì)內(nèi)pH的探針，其 工作pH范圍大約是6.8-7.4 (K, M. Sun, C. K. McLaughlin, D. R. Lantero and R. A.Manderville, ■/ ^肌Ou;m. Soc. 2007, 129, 1894 -1895; M. S. Briggs, D. D. Burns, M. E, Cooper and S. J. Gregory, CTzew. Cowwww.， 2000, 2323—2324; J. A. Thomas, R. N. Buchsbaum， A. Zimniak and E. Racker,傷oc/ em. 1979, 18, 2210-2218; A. H. Lee and I. F.Tannock, Cancer Res. 1998, 58, 1901-1908; R. Pal and D. Parker, O^w. Cow附wt 2007， 474476);另一類是用于檢測酸性器官如溶酶體，內(nèi)涵體等的探針，其工作pH范圍 大約是4.5-6.0.(H,J. Lin, P. Herman, J. S. Kang and J. R. Lakowicz, jwa/.傷0c/7e肌2001, 294, 118-125; F. Galindo, M. I. Burguete, L. Vigara， S. V. Luis, N. Kabir, J. Gavrilovic and D. A. Russell, Jwgew. Oze附./脫五c/ 2005， 44, 6504-6508.) ; Bo Tang, Xia Liu, Kehua Xu, Hui Huang, Guiwen Yang and Liguo An, (;. .C0/;,w"",200/. i;/i:( — 3/2r: 眾所周知，細(xì)胞 內(nèi)pH的微小變化可能引起細(xì)胞的功能紊亂，理想的熒光探針應(yīng)當(dāng)靈敏的響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)pH的微小變化，并且能夠避免來自細(xì)胞生物本身的干擾。然而，目前可用的pH熒光探針有以下缺點(diǎn)低的靈敏度，有的激發(fā)在紫外區(qū)。激發(fā)在紫外區(qū)能夠損傷組織樣品 并且引起生物樣品自發(fā)熒光的干擾。另外，用于檢測酸性器官內(nèi)的理想的pH探針較 少，這被認(rèn)為是細(xì)胞生物學(xué)及醫(yī)學(xué)發(fā)展的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一旨在克服現(xiàn)有技術(shù)熒光探針的不足之處，提供一種具有高的 靈敏度、好的選擇性、好的光穩(wěn)定性以及工作pH在酸性范圍、適用于檢測細(xì)胞內(nèi)氫 離子的熒光探針；目的之二是提供工藝簡單、成本低廉的該熒光探針的合成方法；目 的之三是提供該熒光探針的用途。本發(fā)明的目的之一可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)該熒光探針具有下列結(jié)構(gòu)通式<formula>formula see original document page 5</formula>本發(fā)明的目的之二可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn) 該合成方法按如下步驟進(jìn)行a. 先將羅丹明類熒光染料溶于有機(jī)溶劑中，再按照羅丹明類熒光染料氧氯化磷-l: 2-5重量份配比于攪拌下緩慢加入氧氯化磷，然后于40-6(TC加熱回流反應(yīng)-； 小時(shí)；b. 反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，減壓除去溶劑，先加入有機(jī)溶劑溶解后，再按照羅丹明類熒光染料氫離子響應(yīng)基團(tuán)=1: l-3重量份配比加入氫離子響應(yīng)基團(tuán)，混合后于80-10(TC加熱回流1-2小時(shí)；c. 然后冷卻至室溫，減壓除去有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品；d. 硅膠柱層析分離得結(jié)構(gòu)通式為的產(chǎn)品。本發(fā)明的目的之二還可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)所述的羅丹明類熒光染料選自羅丹明B、羅丹明6G、羅丹明800、羅丹明IIO。 所述的氫離子響應(yīng)基團(tuán)選自苯甲酰肼、對甲苯基苯甲酰肼、鄰甲基苯甲酰肼、間甲基 苯甲酰肼。所說的有機(jī)溶劑選自二氯甲垸、三氯甲垸、乙腈、乙醇。本發(fā)明代表性的化合物顯示在下面的合成方案中羅丹明類熒光染料與氧氯化磷溶于二氯甲烷中，反應(yīng)完畢后，減壓除去溶劑。產(chǎn) 物溶于乙腈中，不斷攪拌下加入苯甲酰肼，混合物加熱回流得到探針分子，最后經(jīng)過 分離得熒光探針產(chǎn)品。本發(fā)明檢測細(xì)胞內(nèi)氫離子的熒光探針在使用時(shí)沒有特殊的限制，通常，可以將探 針分子溶解在生理鹽水、緩沖液或由乙醇、乙腈、二甲亞砜等水溶性有機(jī)溶劑，然后 加入含有細(xì)胞組織的適當(dāng)緩沖液中進(jìn)行測試。本發(fā)明的目的之三可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn) 本發(fā)明的檢測細(xì)胞內(nèi)氫離子的新型熒光探針用于化學(xué)模擬生物體系中氫離子的 檢測，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的氫離子的分析檢測和熒光成像檢測，以及醫(yī)學(xué)上病 變組織中氫離子的檢測。本發(fā)明以羅丹明類熒光染料、氧氯化磷和苯甲酰肼為原料，合成的熒光探針 NMR (CDC13, 300MHz) S (ppm): 1.71(12H), 3.33(8H), 6.38 (4H), 6.72(2H), 7.18(1H), 7.42(3H), 7.53(4H), 8.00(1H)l3C NMR (CDC13, 300MHz) S (ppm): 12.7, 44.5, 66.5, 97.8， 104.6, 108.2, 123.7, 124.4， 127.6, 128.5， 129,4， 129.5, 131.7, 132.8, 133.3， 149.2, 151.5, 154.0, 165.6.本發(fā)明的重要貢獻(xiàn)在于合成的熒光探針分子具有高的靈敏度與選擇性，好的光穩(wěn) 定性與細(xì)胞通透性，可以有效避免細(xì)胞內(nèi)自發(fā)熒光的干擾，減少對生命體的損傷，有 利于活體檢測；本發(fā)明熒光探針分子的設(shè)計(jì)基于羅丹明無熒光閉環(huán)結(jié)構(gòu)與強(qiáng)熒光的開 環(huán)結(jié)構(gòu)。pH滴定實(shí)驗(yàn)表明酸性條件下在4.2-6.0的pH范圍熒光強(qiáng)度能增加100倍有 余，p《a是4.85，這對研究細(xì)胞內(nèi)的酸性器官是非常有意義的；另外，我們將探針應(yīng) 用到動物的肝癌細(xì)胞內(nèi)(HepG2 cells)通過激光共聚焦顯微成像技術(shù)進(jìn)一步證明了該 探針的價(jià)值。本發(fā)明的探針分子具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。特別是該探針分子測定靈敏度非常 高，光穩(wěn)定性非常好；并且具有良好的選擇性，細(xì)胞的滲透性好和毒副作用小。另外 該系列探針分子結(jié)構(gòu)簡單，合成工藝簡易且效率高、成本低廉，適用于檢測細(xì)胞內(nèi)氫 離子的熒光探針；


圖1是該探針的單晶結(jié)構(gòu)。圖2是本發(fā)明實(shí)施例的熒光探針分子在酸性緩沖溶液中，其熒光強(qiáng)度和氫離子濃 度的關(guān)系及pH滴定曲線。橫坐標(biāo)為波長(nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。圖3是本發(fā)明實(shí)施例的熒光探針分子的光穩(wěn)定性。橫坐標(biāo)為時(shí)間(s)，縱坐標(biāo)是熒 光強(qiáng)度。圖4是本發(fā)明實(shí)施例的熒光探針分子對氫離子具有很好的選擇性。1: H+;2: H+ + Cu2+;3: H++Zn2+;4: H++Ca2+; 5: 1^++"82+.橫坐標(biāo)為各種離子，縱坐標(biāo)為加入各 種離子前后探針溶液的熒光強(qiáng)度。
圖5是本發(fā)明實(shí)施例的熒光探針分子研究動物的肝癌細(xì)胞(H印G2 cells)的激 光共聚焦顯微成像。(左)為動物的肝癌細(xì)胞用熒光探針在37'C下孵育30分鐘的激光 共聚焦照片，(右)為亮場照片以表明細(xì)胞活力。
具體實(shí)施例方式探針的合成實(shí)施例1:a. 先將羅丹明B溶于有機(jī)溶劑中，再按照羅丹明B:氧氯化磷=1: 2重量份配 比于攪拌下緩慢加入氧氯化磷，然后于40。C加熱回流反應(yīng)6小時(shí)；b. 反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，減壓除去溶劑，先加入乙腈溶解后，再按照羅丹明B: 苯甲酰肼=1: 1重量份配比加入苯甲酰肼，混合后于10(TC加熱回流1小時(shí)；C.然后冷卻至室溫，減壓除去有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品；最后用硅膠柱分離組分， 洗脫劑為甲醇三氯甲垸=1: 15 (V/V)，減壓蒸發(fā)去除殘余溶劑，真空干燥得產(chǎn)品。 實(shí)施例2:a. 先將羅丹明B溶于有機(jī)溶劑中，再按照羅丹明B:氧氯化磷=1: 5重量份配 比于攪拌下緩慢加入氧氯化磷，然后于60。C加熱回流反應(yīng)4小時(shí)；b. 反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，減壓除去溶劑，先加入乙腈溶解后，再按照羅丹明B:苯甲酰肼=1: 3重量份配比加入苯甲酰肼，混合后于8(TC加熱回流2小時(shí)；C.然后冷卻至室溫，減壓除去有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品；最后用硅膠柱分離組分，
洗脫劑為甲醇三氯甲烷=1: 15 (V/V),減壓蒸發(fā)去除殘余溶劑，真空干燥得產(chǎn)品。 實(shí)施例3:a. 先將羅丹明B溶于有機(jī)溶劑中，再按照羅丹明B:氧氯化磷=1: 3重量份配比于攪拌下緩慢加入氧氯化磷，然后于5(TC加熱回流反應(yīng)5小時(shí)；b. 反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，減壓除去溶劑，先加入乙腈溶解后，再按照羅丹明B: 苯甲酰肼=1: 2重量份配比加入苯甲酰肼，混合后于9(TC加熱回流1.5小時(shí)；C.然后冷卻至室溫，減壓除去有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品；最后用硅膠柱分離組分， 洗脫劑為甲醇三氯甲垸=1: 15 (v/v),減壓蒸發(fā)去除殘余溶劑，真空干燥得產(chǎn)品。 實(shí)施例4:將1.0克(2.3mmol)羅丹明B于15mL二氯甲烷溶解后，逐滴滴加氧氯化磷0.4mL， 然后于60'C加熱回流反應(yīng)4小時(shí)，冷卻至室溫，減壓除去溶劑，產(chǎn)物溶于25mL乙 腈中，不斷攪拌下加入0.31克苯甲酰肼，混合物于10(TC加熱回流1小時(shí)，冷卻至室 溫，減壓除去溶劑得到熒光探針粗品，最后用硅膠柱分離組分，洗脫劑為甲醇三氯 甲烷=1: 15 (Wv),減壓蒸發(fā)去除殘余溶劑，真空干燥得熒光探針產(chǎn)品。實(shí)施例5:將1.0克(2.3 mmol)羅丹明B于15mL 二氯甲烷溶解后，逐滴滴加氧氯化磷0.8mL， 然后于4(TC加熱回流反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，減壓除去溶劑，產(chǎn)物溶于125mL乙 腈中，不斷攪拌下加入0.93克苯甲酰肼，混合物于8(TC加熱回流2小時(shí)，冷卻至室 溫，減壓除去溶劑得到熒光探針粗品，最后用硅膠柱分離組分，洗脫劑為甲醇三氯 甲垸=1: 15 (v/v)，減壓蒸發(fā)去除殘余溶劑，真空干燥得熒光探針產(chǎn)品。實(shí)施例6:將1.0克(2.3mmol)羅丹明B于15mL二氯甲烷溶解后，逐滴滴加氧氯化磷0.6mL， 然后于50。C加熱回流反應(yīng)5小時(shí)，冷卻至室溫，減壓除去溶劑，產(chǎn)物溶于125mL乙 腈中，不斷攪拌下加入0.60克苯甲酰肼，混合物于9(TC加熱回流1.5小時(shí)，冷卻至室 溫，減壓除去溶劑得到熒光探針粗品，最后用硅膠柱分離組分，洗脫劑為甲醇三氯 甲烷=1: 15 (v/v),減壓蒸發(fā)去除殘余溶劑，真空干燥得熒光探針產(chǎn)品。實(shí)施例7:將羅丹明6G替換羅丹明B，其他分別同實(shí)施例l-6。 實(shí)施例8:'.將羅丹明IIO替換'羅丹明B,其他分別同實(shí)施例1-6。實(shí)施例9:將羅丹明800替換羅丹明B，，其他分別同實(shí)施例1-6。 實(shí)施例10:將三氯甲烷替換二氯甲垸，其他分別同實(shí)施例1-9。實(shí)施例11:將乙腈替換二氯甲垸，其他分別同實(shí)施例1-9。 實(shí)施例12:將乙醇替換二氯甲烷，其他分別同實(shí)施例1-9。實(shí)施例13:將對甲基苯甲酰肼替換苯甲酰肼，其他分別同實(shí)施例1-12。 實(shí)施例14:將鄰甲基苯甲酰肼替換苯甲酰肼，其他分別同實(shí)施例1-12。實(shí)施例15:將間甲基苯甲酰肼替換苯甲酰肼，其他分別同實(shí)施例1-12。
權(quán)利要求
1、檢測細(xì)胞內(nèi)氫離子的熒光探針，其特征在于該熒光探針具有下列結(jié)構(gòu)通式
2、權(quán)利要求l所述檢測細(xì)胞內(nèi)氫離子的熒光探針的合成方法，其特征在于該方 法按如下步驟進(jìn)行a. 先將羅丹明類熒光染料溶于有機(jī)溶劑中，再按照羅丹明類熒光染料氧氯化磷=1: 2-5重量份配比于攪拌下緩慢加入氧氯化磷，然后于40-6(TC加熱回流反應(yīng)4-6小時(shí)；b. 反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，減壓除去溶劑，先加入有機(jī)溶劑溶解后，再按照羅丹明類熒光染料氫離子響應(yīng)基團(tuán)=1: l-3重量份配比加入氫離子響應(yīng)基團(tuán)，混合后于80-10(TC加熱回流1-2小時(shí)；C.然后冷卻至室溫，減壓除去有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品； d.硅膠柱層析分離得結(jié)構(gòu)通式為
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的羅丹明類熒光染料選自、 羅丹明B、羅丹明6G、羅丹明800、羅丹明110。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的氫離子響應(yīng)基團(tuán)選自苯甲酰肼、對甲苯基苯甲酰肼、鄰甲基苯甲酰肼、間甲基苯甲酰肼。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于所說的有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、 三氯甲烷、乙腈、乙醇。
6、 權(quán)利要求1所述的檢測細(xì)胞內(nèi)氫離子的熒光探針用于化學(xué)模擬生物體系中氫 離子的檢測，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的氫離子的分析檢測和熒光成像檢測，以及醫(yī) 學(xué)上病變組織中氫離子的檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測細(xì)胞內(nèi)氫離子的熒光探針及合成方法和用途，該方法按如下步驟進(jìn)行a.先將羅丹明類熒光染料溶于有機(jī)溶劑中，再按照羅丹明類熒光染料∶氧氯化磷＝1∶2-5重量份配比于攪拌下緩慢加入氧氯化磷，然后于40-60℃加熱回流反應(yīng)4-6小時(shí)；b.反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，減壓除去溶劑，先加入有機(jī)溶劑溶解后，再按照羅丹明類熒光染料∶氫離子響應(yīng)基團(tuán)＝1∶1-3重量份配比加入氫離子響應(yīng)基團(tuán)，混合后于80-100℃加熱回流1-2小時(shí)；c.然后冷卻至室溫，減壓除去有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品；d.硅膠柱層析分離得產(chǎn)品。
文檔編號G01N33/52GK101149374SQ20071011326
公開日2008年3月26日 申請日期2007年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日
發(fā)明者波 唐, 崔麗娟, 張文申, 徐克花, 閆從斌 申請人:山東師范大學(xué)