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咽拭子標本手足口病EV71病毒real-timeRT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法

文檔序號:395386閱讀:567來源:國知局
專利名稱:咽拭子標本手足口病EV71病毒real-time RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及ー種咽拭子標本手足ロ病EV71病毒real-time RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)
腸道病毒71 型(EV71)是引起手足 ロ病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原體之一,并可能導致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病及并發(fā)癥,以嬰幼兒發(fā)病為主,個別重癥患兒病情進展快,易發(fā)生死亡。近年來,國內(nèi)外報道了多期腸病毒71型感染引起的手足ロ病群體性暴發(fā)的案例,成為威脅人類生命健康公共衛(wèi)生問題。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計數(shù)據(jù),僅2010年全國累計報告手足ロ病例192344例,比2009年同期上升了 38.,其中重癥2119例,死亡 94例。人是腸道病毒唯一宿主,患者和隱性感染者均為本病的傳染源。腸道病毒主要經(jīng)糞-口和/或呼吸道飛沫傳播,亦可經(jīng)接觸病人皮膚、粘膜泡疹液而感染。傳統(tǒng)的腸病毒感染的診斷主要方法是從糞便、咽拭子標本分離病毒,以及病毒的血清型分離鑒定。分子生物學技術(shù)為WHO (世界衛(wèi)生組織)推薦的病原檢測手段,其可在短時間內(nèi)確認病原、大幅節(jié)約檢測時間和成本,敏感度和特異性也超越現(xiàn)有各類實驗室檢測技木。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題,本發(fā)明的目的在于提供ー種快速有效、成本、低檢測周期短、能夠提供有效和臨床診斷和流行病監(jiān)測數(shù)據(jù)的咽拭子標本手足ロ病EV71病毒 real-time RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法。為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明咽拭子標本手足ロ病EV71病毒real-time RT-PCR檢測試劑盒,該試劑盒的引物和探針序列如下
lsy-VFP2 :5’ -TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’ ; lsy-VRP2 :5, - CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3,; lsy-Probe2 :5’ - CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3,。本發(fā)明咽拭子標本手足ロ病EV71病毒real-time RT-PCR檢測方法,具體為
1)根據(jù)EV71病毒基因序列,設(shè)計引物和探針序列如下 lsy-VFP2 :5’ -TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’ ; lsy-VRP2 :5, - CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3,; lsy-Probe2 :5’ - CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3,;
2)提取待測樣品RNA;3)以待測樣品RNA為模板,在包括步驟1)所述引物和探針序列的RTPCR反應(yīng)體系中進行RT PCR反應(yīng);
4)采用實時PCR檢測儀進行PCR擴增及結(jié)果分析,通過熒光定量檢測,根據(jù)熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度判斷結(jié)果,熒光RT PCR反應(yīng)呈陽性,則待測樣品含有EV71病毒核酸。進一歩,所述待測樣品為咽拭子標本,所述待測樣品RNA采用QIAGEN病毒RNA提取試劑盒提取。進ー步,所述RT PCR 反應(yīng)體系為2XOne Step RT-PCR Buffer III 12. 5μ 1, TaKaRa Ex Taq HS 5 U/μ 1 0. 5 μ l,PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5 μ 1 ,RNase Free dH20 4.5 μ 1, ROX Reference Dye II 50 X 0. 5 μ 1,Primer 40 μ mol/L 各 0. 5μ 1, Probe 10 μ mol/L 0. 5 μ 1。進一歩,所述RT PCR 反應(yīng)的反應(yīng)條件為42°C 8min ;95°C IOs ;95°C 5s ;58°C 34s, 45 Cycles ;退火溫度按、56°C、58°C、60°C分別試驗優(yōu)化,退火溫度為58度吋,反應(yīng)曲線呈典型的S型,熒光信號最強,本方法選擇58度作為退火溫度進行所述RT PCR反應(yīng)。本發(fā)明檢測方法僅需要咽拭子標本就可能檢測,方便了臨床醫(yī)生和ロ岸檢疫工作者采樣操作,具有成本低、檢測周期短,能夠提供有效和臨床診斷和流行病監(jiān)測數(shù)據(jù)。


圖1為實時PCR最低檢測限反應(yīng)曲線; 圖2為實時PCR重復(fù)性反應(yīng)曲線;
圖3為CUT OFF值的確定10倍梯度系列稀釋反應(yīng)曲線; 圖4為CUT OFF值的確定最低稀釋度檢測反應(yīng)曲線; 圖5為CUT OFF值的確定陰性樣本檢測反應(yīng)曲線。
具體實施例方式腸道病毒EV71在亞太地區(qū)的流行呈逐年上升趨勢,因此建立一種特異敏感高效快速的實驗室檢測方法非常重要。實現(xiàn)對可疑腸道病毒早期診斷是控制手足ロ足病傳播的有效方法之一。本發(fā)明建立的腸道病毒EV71實時熒光PCR檢測方法僅需要咽拭子標本就可以檢測,方便了臨床醫(yī)生和ロ岸檢疫工作者采樣操作。本研究建立的方法與腸道病毒診斷標準方法比對結(jié)果一至,但本方法所用試劑成本低、檢測周期短,能夠提供有效和臨床診斷和流行病監(jiān)測數(shù)據(jù)。本發(fā)明的關(guān)鍵步驟之一就是引物探針的設(shè)計,我們從NCBI數(shù)據(jù)庫檢索到截至 2011年3月1日的所有腸道病毒EV71病毒基因序列,經(jīng)相關(guān)生物信息學軟件反復(fù)比對設(shè)計,最終確定了該病毒VPl基因的保守區(qū)域設(shè)計,而且在試驗中我們也選取了多套自己設(shè)計的引物探針序列實驗比對,最終確定了一套最佳檢測用引物探針序列。本發(fā)明ー種咽拭子標本手足ロ病EV71病毒real-time RT-PCR檢測試劑盒,該試劑盒的引物和探針序列如下lsy-VFP2 :5’ -TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’ ; lsy-VRP2 :5, - CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3,; lsy-Probe2 :5’ - CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3,。本試劑盒中還包括dNTP,MgC12, RNase抑制劑,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶,Taq酶等,這些組分對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說屬于公知常識,可根據(jù)需要選用。本發(fā)明ー種咽拭子標本手足ロ病EV71病毒real-time RT-PCR檢測方法,具體過程為
1)根據(jù)EV71病毒基因序列,設(shè)計引物和探針序列如下 lsy-VFP2 :5’ -TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’ ; lsy-VRP2 :5, - CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3,; lsy-Probe2 :5’ - CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3,;
2)提取待測樣品RNA;
3)以待測樣品RNA為模板,在包括步驟1)所述引物和探針序列的RTPCR反應(yīng)體系中進行RT PCR反應(yīng);
4)采用實時PCR檢測儀進行PCR擴增及結(jié)果分析,通過熒光定量檢測,根據(jù)熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度判斷結(jié)果,熒光RT PCR反應(yīng)呈陽性,則待測樣品含有EV71病毒核酸。其具體分析過程和處理過程如下 1、材料與方法
1.1材料
1. 1. 1陽性標本腸道病毒EV71型和柯薩奇病毒A16型病毒株均為武漢生物制品研究所基因工程室提供。81份EV71陽性咽拭子標本由四川國際旅行衛(wèi)生保健中心提供。 人A型流感病毒、2009甲型Hmi流感病毒、B型流感病毒陽性咽拭子標本均為本實驗室測序確證樣本、H5N1和H9N2核酸為北京⑶C饋贈。1. 1. 2陰性標本采集的156份正常人咽拭子來自深圳ロ岸醫(yī)院正常人群。1. 2 方法
1.2.1引物和探針的設(shè)計
從NCBI-Genebank獲取腸病毒EV71的基因序列利用軟件BI0EDIT5. 0對各型基因組序列進行比對找出一段高度保守區(qū)用primer express3. 0和I^rimer 5設(shè)計引物和探針 (見表1),并且對所設(shè)計的引物探針進行NCBI-BLAST檢索,其結(jié)果為100%與EV71同源,理論上排除了其他微生物或人類基因組擴增的可能性。Taq-man探針修飾5’ -FAM 3’ -TAMRA, PCR產(chǎn)物的大小為86bp。表1引物和探針的名稱、序列和堿基的數(shù)量
權(quán)利要求
1.咽拭子標本手足ロ病EV71病毒real-timeRT-PCR檢測試劑盒,其特征在于,該試劑盒的引物和探針序列如下lsy-VFP2 :5’ -TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’ ; lsy-VRP2 :5, - CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3,; lsy-Probe2 :5’ - CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3,。
2.咽拭子標本手足ロ病EV71病毒real-timeRT-PCR檢測方法,其特征在干,該檢測方法具體為1)根據(jù)EV71病毒基因序列,設(shè)計引物和探針序列如下 lsy-VFP2 :5’ -TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’ ; lsy-VRP2 :5, - CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3,; lsy-Probe2 :5’ - CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3,;2)提取待測樣品RNA;3)以待測樣品RNA為模板,在包括步驟1)所述引物和探針序列的RTPCR反應(yīng)體系中進行RT PCR反應(yīng);4)采用實時PCR檢測儀進行PCR擴增及結(jié)果分析,通過熒光定量檢測,根據(jù)熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度判斷結(jié)果,熒光RT PCR反應(yīng)呈陽性,則待測樣品含有EV71病毒核酸。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測方法,其特征在干,所述待測樣品為咽拭子標本,所述待測樣品RNA采用QIAGEN病毒RNA提取試劑盒提取。
4.如權(quán)利要求2所述的檢測方法,其特征在干,所述RTPCR反應(yīng)體系為2X0ne Step RT-PCR Buffer III 12. 5μ 1,TaKaRa Ex Taq HS 5 U/μ 1 0· 5 μ 1,PrimeScript RT Enzyme Mix II 0. 5 μ 1,RNase Free dH20 4.5 μ 1,ROX Reference Dye II 50X 0. 5μ 1,Primer 40ymol/L 各 0.5 μ 1,Probe 10ymol/L 0. 5 μ 1。
5.如權(quán)利要求2所述的檢測方法,其特征在干,所述RTPCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為 42°C8min ;95°C IOs ;95°C 5s ;58°C 34s, 45 Cycles ;退火溫度按 、56°C、58°C、60°C分別試驗優(yōu)化,退火溫度為58度吋,反應(yīng)曲線呈典型的S型,熒光信號最強,本方法選擇58度作為退火溫度進行所述RT PCR反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種咽拭子標本手足口病EV71病毒real-timeRT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法,其采用設(shè)計引物和探針序列如下:lsy-VFP25’-TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’;lsy-VRP25’-CCGCRCTGCTGAAGAAACTA-3’;lsy-Probe25’-CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC-3’;本發(fā)明檢測方法僅需要咽拭子標本就可能檢測,方便了臨床醫(yī)生和口岸檢疫工作者采樣操作,具有成本低、檢測周期短,能夠提供有效和臨床診斷和流行病監(jiān)測數(shù)據(jù)。
文檔編號C12Q1/70GK102559924SQ201110099249
公開日2012年7月11日 申請日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者劉勝牙, 葉健忠, 葉衛(wèi)翔, 朱玉蘭, 王佃鵬, 甄勝西, 黃彤文 申請人:深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心
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