專利名稱：解淀粉芽孢桿菌及其在番茄早疫病菌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤指一種解淀粉芽孢桿菌B-004，同時還涉及該菌株對番茄早疫病菌的抑制作用。
背景技術(shù)：
早疫病菌是番茄果實采后腐爛變質(zhì)的主要病原菌之一。目前對該病的防治主要是低溫貯藏結(jié)合化學防腐劑的應(yīng)用。但低溫處理需要較大的投資，且容易造成番茄貯藏中的冷害問題，導致番茄在低溫期間或出庫后短期內(nèi)出現(xiàn)腐爛。另一方面，長期使用化學藥劑會導致病菌產(chǎn)生抗藥性，降低化學藥劑的防病效果，同時防腐劑對人體健康及環(huán)境產(chǎn)生不良影響。生物防治因無毒、高效、成本低，作為一種控制采后病害的新途徑成為研究的熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對番茄早疫病菌有明顯抑制作用的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)B-004。本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)B-004，已于2011 年1月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC NO. 4557。本發(fā)明菌株B-004具有下述性質(zhì)本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌B-004在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上于37°C培養(yǎng)M小時，菌落呈圓形，表面褶皺粘稠，菌落不透明，顏色為白色。將本發(fā)明菌株B-004活化進行革蘭氏染色、芽孢染色，于光學顯微鏡下觀察到菌株為桿狀，少鏈，芽孢中生，革蘭氏染色陽性。本發(fā)明菌株的生理生化特征見下表1 表1本發(fā)明菌株B-004的生理生化檢測表
生理生化特征結(jié)果生理生化特征結(jié)果明膠液化+H2S一葡萄糖產(chǎn)酸+接觸酶試驗+葡萄糖產(chǎn)氣一V. P+乳糖產(chǎn)酸一M. R一乳糖產(chǎn)氣一淀粉水解+55 0C一檸檬酸鹽試驗+7. 5%NaCl+
注陽性+、陰性_。通過對本發(fā)明菌株B-004的菌落形態(tài)、菌體觀察及生理生化性狀檢測，參照《伯杰氏手冊》初步確定本菌株B-004為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) 0 通過分析本菌株遺傳特征的保守序列16S rDNA，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明菌株B-004與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性為99 %，兩者處于系統(tǒng)樹的同一分支，結(jié)合本發(fā)明菌株B-004的菌落形態(tài)、菌體觀察及生理生化性狀檢測結(jié)果，可以判定本發(fā)明菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的一個新種，命名為解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)B—004。培養(yǎng)及發(fā)酵條件培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源并無特殊的規(guī)定，培養(yǎng)基中可含有常用于微生物培養(yǎng)的碳源、 氮源及其他營養(yǎng)源。其中，碳源可為可溶性淀粉、藕粉、葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等。氮源可為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NH4N03、NH4C1、(MM)2SO4等。其他營養(yǎng)源可為含鉀、鐵、鋅、鈉、 錳、鎂及鈣之類的金屬鹽等。對溫度、時間等培養(yǎng)條件并無嚴格的限制，以適于本發(fā)明菌株的生長為宜。為提高本發(fā)明菌株有效成分的產(chǎn)量，通過單因素試驗對本發(fā)明菌株的培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，最佳培養(yǎng)基為可溶性淀粉20g，酵母膏8g，CaCl25g，蒸餾水1000mL。為進一步提高有效抗菌物質(zhì)的含量，對本發(fā)明菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以接種量2%，初始pH7. 0，裝液量100mL/250mL，轉(zhuǎn)速210r/min，30°C振蕩培養(yǎng)4 為發(fā)酵條件時，其抑菌活性最高，經(jīng)優(yōu)化條件二次驗證，抑菌圈從0. 2cm提高到了 0. 7cm，為進行發(fā)酵罐放大試驗提供了基礎(chǔ)。在制造以本發(fā)明所述菌株為有效成分的農(nóng)用殺菌劑時，可使用該領(lǐng)域內(nèi)已知的各種載體，并能配制成粉劑或水劑等劑型，配制成粉劑時需加10%乳糖作為保護劑、5%蛋白胨作再水化劑。殺菌劑中本發(fā)明菌株的濃度為IO6 108CFU/mL。本發(fā)明菌株對番茄采后早疫病菌具有明顯拮抗效果，可抑制番茄早疫病菌的生長，達到防病效果，并可進一步制造以本發(fā)明所述菌株為有效成分的農(nóng)用殺菌劑，從而，對利用生物防治途徑來控制番茄貯藏期早疫病具有積極的現(xiàn)實意義。
具體實施例方式實施例1將從湖南長沙周邊農(nóng)戶菜園采集的番茄果實，參照文獻(劉杰鳳，韓寒冰，張進鳳，等.茄類內(nèi)生菌的分離及拮抗細菌的篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37 (3) :1160 1162)方法，采用研磨液培養(yǎng)法，將新鮮無病害番茄用流水洗凈，切成小塊，在75 %的酒精中浸泡3min，5% NaClO處理5min，無菌水反復沖洗5次，置于滅菌的研缽中研磨成漿液。將研磨液置80°C水浴保溫30min后，用無菌水稀釋10倍，取0. ImL涂布于NA培養(yǎng)基中，37°C 培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)，挑取形態(tài)特征相異的菌落于NA培養(yǎng)基上劃線分離，37°C培養(yǎng)4 后，取單菌落重復劃線分離3次，純化(李娟，陳亮，陳立，等.獼猴桃細菌性葉枯病生防芽孢桿菌篩選及田間防效[J].中國生物防治，2010, ) :235 239)，即可得到本發(fā)明菌株，純化后菌株轉(zhuǎn)接NA斜面保存?zhèn)溆?。實施?，本發(fā)明菌株對番茄早疫病菌的抑制作用1、將本發(fā)明菌株采用傳統(tǒng)的平板對峙方法[孫建波，王宇光，趙平娟，等.香蕉枯萎病生防細菌的篩選、鑒定及其抑菌作用[J].中國生物防治，26C3) :347 351]進行拮抗
4試驗，得知，本發(fā)明菌株對番茄早疫病菌具有拮抗能力，測得抑菌圈直徑為0. 4cm02、參照文獻[周防震.番茄采后病害拮抗酵母菌的篩選和應(yīng)用[D].華中農(nóng)業(yè)大學，2004]方法，將本發(fā)明菌株經(jīng)培養(yǎng)后配成106、107、及108CFU/mL濃度，與103、104、 105SpOreS/mL三種濃度的番茄早疫病菌孢子液等體積(0. ImL)混合于NA改良培養(yǎng)基，
培養(yǎng)5d后觀察結(jié)果，得知，本發(fā)明菌株濃度為106、IO7,108CFU/mL,能完全抑制ΙΟ3、104、 105spores/mL濃度的番茄早疫病菌孢子生長。3、番茄果實貯藏試驗本試驗所用番茄果實采自湖南農(nóng)業(yè)大學周邊農(nóng)田，果實新鮮、健壯、無機械損傷， 品種為早豐1號、西優(yōu)5號。果實采收后清水洗凈，自然涼干，按下表2的處理方法噴灑番茄果實。自然涼干，單果包裝后室溫下貯藏，每組處理30個番茄果實，每隔15d檢查發(fā)病情況。表2番茄果實貯藏試驗設(shè)計
權(quán)利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌株，其特征在于該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)B-004,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2011年1月17日，保藏編號為CGMCC NO. 4557。
2.如權(quán)利要求1所述的菌株在抑制番茄早疫病菌中的作用。
3.如權(quán)利要求1所述的菌株作為有效成分在制備農(nóng)用殺菌劑中的作用。
4.如權(quán)利要求3所述的菌株在農(nóng)用殺菌劑中的濃度為IO6 108CFU/mL。
全文摘要
一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)B-004，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2011年1月17日，保藏編號為CGMCC NO.4557。該菌株對番茄采后早疫病菌具有明顯拮抗效果，可抑制番茄早疫病菌的生長，并可進一步制造以本發(fā)明所述菌株為有效成分的農(nóng)用殺菌劑，對利用生物防治途徑來控制番茄貯藏期早疫病具有積極的現(xiàn)實意義。
文檔編號C12N1/20GK102154187SQ20111009511
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者夏菠, 易有金, 童志丹 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學