專利名稱：用于檢測(cè)梨火疫病菌的一步雙重pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明“用于檢測(cè)梨火疫病菌的一步雙重PCR方法”，專用于檢測(cè)梨火疫病菌，屬于農(nóng)作物病害防治和植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
梨火疫病菌(Erwina amylovora)是梨、蘋果及其他薔薇科植物上的一種毀滅性細(xì)菌病害，最早發(fā)現(xiàn)預(yù)1780年，現(xiàn)主要分布在中北美、大洋州、歐洲、西亞、埃及、日本、韓國(guó)等40多個(gè)國(guó)家或地區(qū)。1951-1960的十年間，美國(guó)平均每年損失400萬(wàn)美元。我國(guó)目前尚未發(fā)現(xiàn)有該病害的危害，被列為我國(guó)的對(duì)外一類檢疫對(duì)象。
梨火疫病主要危害花、葉、嫩梢、果實(shí)等，一般減產(chǎn)25％。
我國(guó)果樹(shù)栽培面積很大，據(jù)1998年統(tǒng)計(jì)，蘋果的栽培面積達(dá)284萬(wàn)hm2，梨樹(shù)面積達(dá)94萬(wàn)hm2，與世界各國(guó)相比，蘋果和梨樹(shù)栽培面積及總產(chǎn)均居世界首位。隨著國(guó)際貿(mào)易的不斷擴(kuò)大，我國(guó)開(kāi)始從日本和韓國(guó)引進(jìn)優(yōu)良果樹(shù)品種的種苗，從美國(guó)、澳大利亞等國(guó)家進(jìn)口各種水果，如不嚴(yán)格檢疫，則很可能將梨火疫病菌帶入我國(guó)。該病一旦傳入，勢(shì)必會(huì)對(duì)我國(guó)的果樹(shù)栽培與生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重危害，同時(shí)也將影響我國(guó)優(yōu)質(zhì)水果的出口創(chuàng)匯。
加強(qiáng)檢疫必需建立一套快速而準(zhǔn)確的分子檢測(cè)方法，但國(guó)際上已有多種方法1)半選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)鑒定；2)血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如ELISA和免疫熒光；3)DNA雜交和PCR技術(shù)等。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)梨火疫病的檢測(cè)尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法。
在植物病原細(xì)菌檢測(cè)和鑒定中應(yīng)用較為廣泛的是PCR技術(shù)。PCR技術(shù)檢測(cè)是利用特異性的引物，在DNA聚合酶的催化下，對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無(wú)來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果。PCR技術(shù)檢測(cè)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，快速和簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
國(guó)外根據(jù)梨火疫病菌中pEA29質(zhì)粒的部分序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物來(lái)檢測(cè)梨火疫病菌。但對(duì)于不含有pEA29質(zhì)粒的梨火疫病菌無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)梨火疫病菌的一步雙重PCR方法。該方法根據(jù)梨火疫病菌的pEA29質(zhì)粒和基因組ams基因序列，設(shè)計(jì)二對(duì)特異性引物，在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)梨火疫病菌。是對(duì)梨火疫病菌pEA29質(zhì)粒特異性引物檢測(cè)方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。對(duì)于不含有pEA29質(zhì)粒的梨火疫病菌菌株也可以進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，本方法采用多重PCR技術(shù)，兩對(duì)引物在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間，可以試劑盒的形式在我國(guó)口岸大規(guī)模推廣。
技術(shù)方案用于檢測(cè)梨火疫病菌的一步雙重PCR方法，包括1)用于檢測(cè)梨火疫病菌的樣品制備a)以菌膿做為模板將-80℃保存的梨火疫病菌活化，首先挑取菌液在NA培養(yǎng)基(牛肉浸膏3克，酵母浸粉0.5克，蛋白胨5克，葡萄糖10克，蒸餾水1000毫升，pH7.0-7.2)上，28℃，培養(yǎng)1-2天，挑取菌膿，直接加到PCR反應(yīng)體系中。
b)以新鮮培養(yǎng)的菌液做為模板從NA培養(yǎng)基上挑取菌膿，加到NA液體培養(yǎng)基中，28℃，振蕩培養(yǎng)1天，取1μl菌液做為PCR擴(kuò)增的模板，直接加到PCR反應(yīng)體系中。
2)用于檢測(cè)梨火疫病菌的特異性引物primer A/B和primier E/F，其引物序列為PrimerA5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’PrimerB5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’PrimerE5’-AATAAGGTGCCTGGTAATG-3’PrimerF5’-GGTGGAATGAGACTGGGTA-3’其中primer A/B引物序列來(lái)自該菌的特有的pEA29質(zhì)粒，在梨火疫病菌中特異性擴(kuò)增出1.0kb的產(chǎn)物；primer E/F引物序列來(lái)自改菌的染色體，在梨火疫病菌中特異性擴(kuò)增出1.5kb的產(chǎn)物。
3)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系primer A/B引物對(duì)和primer E/F引物對(duì)在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，其中10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl210μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primer A/B和primer E/F各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，模板為新鮮培養(yǎng)的梨火疫病菌1μl或菌膿，以無(wú)菌水補(bǔ)足，終體積為50μl。
4)PCR擴(kuò)增程序95℃預(yù)變性3min，93℃變性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
4)PCR產(chǎn)物的鑒定取10μl PCR產(chǎn)物用0.1％(重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。
有益效果本發(fā)明用于檢測(cè)梨火疫病菌的一步雙重PCR方法，可用于檢測(cè)從病斑組織分離的梨火疫菌體，也可用于檢測(cè)無(wú)發(fā)病癥狀的植物材料是否帶有梨火疫病菌。與國(guó)外現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)1)檢測(cè)準(zhǔn)確性高。本方法從梨火疫病菌的基因組和pEA29質(zhì)粒兩個(gè)方面同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于不含有pEA29質(zhì)粒梨火疫病菌菌株也能檢測(cè)到。
2)操作簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明采用多重PCR技術(shù)，兩對(duì)引物在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增，擴(kuò)增模板可以為菌膿或新鮮培養(yǎng)的菌液，省去了細(xì)菌DNA制備的繁瑣過(guò)程。整個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、高效。一般整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在4個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。
3)特異性強(qiáng)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物可特異性檢測(cè)梨火疫病菌，在其近緣種、屬細(xì)菌中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。
因此本方法實(shí)用性強(qiáng)，可滿足植物檢疫及病害監(jiān)測(cè)的需要。


圖1引物primer A/B及primer E/F二對(duì)引物對(duì)梨火疫病菌及其近緣種、屬細(xì)菌的雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果M分子量標(biāo)準(zhǔn)DGL2000；1，5梨火疫病菌(Eal)；2，6梨火疫病菌(Ea3)；3，7梨火疫病菌(Ea65)；4，8梨火疫病菌(Ea67)；9根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens；10蘿卜軟腐菌Erwinia carotovora var.carotovora；11玉米細(xì)菌性莖腐病菌Erwinia chrysanthemi；12玉米細(xì)菌性枯萎病菌Erwiniastewartii；13草生歐文氏菌Erwinia herbicola(非致病菌)；14丁香假單胞菌Pseudonomas syringae；15梨梢枯病菌Pseudonomas syringae；16水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzae。
*1，2，3，4以梨火疫病菌的菌膿為模板；5，6，7，8以梨火疫病菌新鮮培養(yǎng)的菌液為模板。
圖2引物primer A/B和引物primer E/F檢測(cè)梨火疫病菌靈敏度及最小檢出菌量的測(cè)定Maker分子量標(biāo)準(zhǔn)DGL2000；1梨火疫病菌Eal原菌液；2稀釋10-1；3稀釋10-2；4稀釋10-3；5稀釋10-4；6稀釋10-5；CK陰性對(duì)照(模板為水)
具體實(shí)施方式
實(shí)施實(shí)例1引物primer A/B和引物primer E/F以梨火疫病菌菌膿做為模板。
1)梨火疫病菌菌膿模板的制備將-80℃保存的梨火疫病菌活化，首先挑取菌液在NA培養(yǎng)基(牛肉浸膏3克，酵母浸粉0.5克，蛋白胨5克，葡萄糖10克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0-7.2)上，28℃，培養(yǎng)1-2天，挑取菌膿，直接加到PCR反應(yīng)體系中。
2)檢測(cè)梨火疫病菌的特異性引物的合成Primer A5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’；Primer B5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’及Primer E5’-AATAAGGTGCCTGGTAATG-3’Primer F5’-GGTGGAATGAGACTGGGTA-3’由上海生工公司合成。
3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)primer A/B引物對(duì)和primer E/F引物對(duì)在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，其中10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl210μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primer A/B和primer E/F各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，模板為梨火疫病菌的菌膿，以無(wú)菌水補(bǔ)足，終體積為50μl。
4)PCR擴(kuò)增程序95℃預(yù)變性3min，93℃變性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
5)PCR產(chǎn)物的鑒定取10μl PCR產(chǎn)物用0.1％(重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。
實(shí)施結(jié)果利用引物primer A/B和引物primer E/F以梨火疫病菌的菌膿為模板，以梨火疫病菌近緣種、屬為對(duì)照進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。在1-4泳道的梨火疫病菌中擴(kuò)增出了1.5kb和1.0kb兩條目的條帶(見(jiàn)附圖1的1-4泳道)。在其他8個(gè)近緣種、屬細(xì)菌中均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。說(shuō)明我們所篩選的來(lái)自梨火疫病菌質(zhì)粒及染色體DNA的二對(duì)特異性PCR擴(kuò)增引物的特異性強(qiáng)。
實(shí)施實(shí)例2引物primer A/B和引物primer E/F以梨火疫病菌新鮮培養(yǎng)的菌液做為模板。
1)以新鮮培養(yǎng)的菌液做為模板從NA培養(yǎng)基上挑取菌膿，加到NA液體培養(yǎng)基中，28℃，振蕩培養(yǎng)1天，取1μl菌液做為PCR擴(kuò)增的模板，直接加到PCR反應(yīng)體系中。
2)檢測(cè)梨火疫病菌的特異性引物的合成Primer A5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’；Primer B5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’及Primer E5’-AATAAGGTGCCTGGTAATG-3’Primer F5’-GGTGGAATGAGACTGGGTA-3’由上海生工公司合成。
3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)primer A/B引物對(duì)和primer E/F引物對(duì)在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，其中10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl210μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primerA/B和primer E/F各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，模板為新鮮培養(yǎng)的梨火疫病菌菌液1μl，以無(wú)菌水補(bǔ)足，終體積為50μl。
4)PCR擴(kuò)增程序95℃預(yù)變性3min，93℃變性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
5)PCR產(chǎn)物的鑒定取10μl PCR產(chǎn)物用0.1％(重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。
實(shí)施結(jié)果利用引物primer A/B和引物primer E/F以梨火疫病菌的菌膿為模板，以梨火疫病菌近緣種、屬為對(duì)照進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。在5-8泳道的梨火疫病菌中擴(kuò)增出了1.5kb和1.0kb兩條目的條帶(見(jiàn)附圖1的5-8泳道)。在其他8個(gè)近緣種、屬細(xì)菌中均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。說(shuō)明我們所篩選的來(lái)自梨火疫病菌質(zhì)粒及染色體DNA的二對(duì)特異性PCR擴(kuò)增引物的特異性強(qiáng)。
實(shí)施實(shí)例3引物primer A/B和引物primer E/F檢測(cè)梨火疫病菌靈敏度及最小檢出菌量的測(cè)定1)以新鮮培養(yǎng)的菌液做為模板從NA培養(yǎng)基上挑取菌膿，加到NA液體培養(yǎng)基中，28℃，振蕩培養(yǎng)1天，分別取原菌液及稀釋101-105倍的菌液1μl為PCR擴(kuò)增的模板，直接加到PCR反應(yīng)體系中。
2)檢測(cè)梨火疫病菌的特異性引物的合成Primer A5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’；Primer B5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’及Primer E5’-AATAAGGTGCCTGGTAATG-3’Primer F5’-GGTGGAATGAGACTGGGTA-3’由上海生工公司合成。
3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)primer A/B引物對(duì)和primer E/F引物對(duì)在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，其中10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl210μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primerA/B和primer E/F各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，模板為新鮮培養(yǎng)的梨火疫病菌菌液1μl，以無(wú)菌水補(bǔ)足，終體積為50μl。
4)PCR擴(kuò)增程序95℃預(yù)變性3min，93℃變性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
5)PCR產(chǎn)物的鑒定取10μl PCR產(chǎn)物用0.1％(重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。
6)鋪平板計(jì)算最小檢出菌量分別取原菌液及稀釋101-105倍的菌液在NA培養(yǎng)基上涂平板，計(jì)算各平板上細(xì)菌的菌落數(shù)。再根據(jù)稀釋倍數(shù)得出PCR擴(kuò)增所檢出的最小菌量。
實(shí)施結(jié)果分別以引物PrimerE+F和引物PrimerA+B做最小檢出菌量的測(cè)定，能檢測(cè)到的最小菌量為原菌液稀釋105倍(見(jiàn)圖2)，涂平板計(jì)數(shù)結(jié)果為Eal原菌液稀釋10-1板上有許多菌落長(zhǎng)出，稀釋10-3有27個(gè)菌落，稀釋10-4有3個(gè)菌落長(zhǎng)出，稀釋10-5沒(méi)有菌落長(zhǎng)出，計(jì)算得出最小檢出菌量能達(dá)到3個(gè)細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.包括梨火疫病菌特異性檢測(cè)引物兩對(duì)，primerA/B和primier E/F，其引物序列為Primer A5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’Primer B5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’Primer E5’-AATAAGGTGCCTGGTAATG-3’Primer F5’-GGTGGAATGAGACTGGGTA-3’其中primer A/B引物對(duì)在梨火疫病菌中特異性擴(kuò)增出1.0kb的產(chǎn)物，primer E/F引物對(duì)在梨火疫病菌中特異性擴(kuò)增出1.5kb的產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1所述梨火疫病菌特異性檢測(cè)的用法，包括PCR擴(kuò)增采用50μl反應(yīng)體系，primerA/B引物對(duì)和primer E/F引物對(duì)在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，其中10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl210μl，10mM dNTPs2μl，10mM primerA/B和primerE/F各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，模板為新鮮培養(yǎng)的梨火疫病菌1μl或菌膿，以無(wú)菌水補(bǔ)足，終體積為50μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min，93℃變性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
全文摘要
本發(fā)明用于檢測(cè)梨火疫病菌的一步雙重PCR方法，適用于檢測(cè)梨火疫病菌。屬于農(nóng)作物病害防治和植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域。該方法根據(jù)梨火疫病菌的pEA29質(zhì)粒和基因組ams基因序列，設(shè)計(jì)二對(duì)特異性引物，在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)梨火疫病菌，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1.0kb和1.5kb，這兩對(duì)引物的檢測(cè)靈敏度達(dá)到了3個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。是對(duì)梨火疫病菌pEA29質(zhì)粒特異性引物檢測(cè)方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。對(duì)于不含有pEA29質(zhì)粒的梨火疫病菌菌株也可以進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，本方法采用雙重PCR技術(shù)，二對(duì)引物在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間，可以試劑盒的形式在我國(guó)口岸大規(guī)模推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1702176SQ200510064520
公開(kāi)日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2005年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月13日
發(fā)明者馮潔, 許景升, 徐進(jìn), 何禮遠(yuǎn), 張爭(zhēng), 張楊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所