專(zhuān)利名稱(chēng)：麻瘋樹(shù)δ9脂肪酸脫氫酶突變體及其編碼基因、重組質(zhì)粒、宿主細(xì)胞與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域和遺傳工程領(lǐng)域,具體涉及麻瘋樹(shù)(Jatropha curcas)的A9脂肪酸脫氫酶突變體、其編碼基因、重組質(zhì)粒、宿主細(xì)胞與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
麻瘋樹(shù)(Jatropha curcas)又名小桐子，為大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹(shù)屬(Jatropha)，廣泛生長(zhǎng)在亞洲、非洲和拉丁美洲等國(guó)家和地區(qū)。麻瘋樹(shù)是一種多用途的含油灌木植物，除作綠籬栽植外，其有效成分可以用于土壤和水資源防護(hù)、抗艾滋、殺菌劑生產(chǎn)、、生物柴油、肥皂和蠟燭生產(chǎn)等。麻瘋樹(shù)的最大價(jià)值在于其種子油可以作為生物柴油。研究顯示麻瘋樹(shù)的種子含油量高達(dá)50飛0%，每公頃產(chǎn)油可達(dá)2700公斤左右。因此，麻瘋樹(shù)也成為當(dāng)前生產(chǎn)生物柴油的最具開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景的作物之一。印度、東南亞以及我國(guó)等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)已經(jīng)將麻瘋樹(shù)生產(chǎn)生物柴油列為生物能源開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)領(lǐng)域。研究麻瘋樹(shù)的脂肪酸合成和調(diào)控基因，可為進(jìn)一步進(jìn)行基因工程改造、獲得高產(chǎn)油的優(yōu)良品種奠定基礎(chǔ)，具有重要意義。油酸(C18:l)和亞油酸(C18:2)等不飽和脂肪酸是麻瘋樹(shù)種子油的主要組分，其含量分別占種子油總量的50%和30%左右。脂肪酸脫氫酶(脂肪酸去飽和酶)可以將脂肪酸鏈上的C-C單鍵轉(zhuǎn)化為C=C雙鍵，產(chǎn)生不飽和脂肪酸。脂肪酸去飽和酶分為三類(lèi)?；o酶A去飽和酶、?；??；d體蛋白(ACP)去飽和酶和?；救ワ柡兔?Murata N，WadaH，Biochem J，1995. 300: 1_8)。在植物和藍(lán)細(xì)菌中，大部分去飽和反應(yīng)由?；救ワ柡兔竿瓿?，其將雙鍵引入到以酯形式存在的脂肪酸中。在植物細(xì)胞的質(zhì)體中存在?；??；d體蛋白去飽和酶，可以將雙鍵引入到與?；d體蛋白結(jié)合的脂肪酸中。在動(dòng)物、酵母、霉菌中廣泛存在酰基輔酶A去飽和酶可將雙鍵引入到與輔酶A結(jié)合的脂肪酸中。目前只有植物的酰基-?；d體蛋白去飽和酶是唯一可知的可溶性去飽和酶家族，它包括A 9-硬脂酰ACP脫氫酶、A 4-軟脂酰ACP脫氫酶、A 6-軟脂酰ACP脫氫酶等。對(duì)脂肪酸ACP脫氫酶的晶體分析表明，此類(lèi)酶可形成一個(gè)雙鐵活性中心，兩個(gè)鐵原子的結(jié)合高度對(duì)稱(chēng)，其中I個(gè)鐵原子和E105和H146的側(cè)鏈作用；另一個(gè)與E105和H146的側(cè)鏈作用。在晶體結(jié)構(gòu)中，從酶表面到內(nèi)部有一個(gè)深的空穴，該空穴為脂肪酰的結(jié)合位(Caboon E B.，J Boil Chem,1994. 269:27519-526)。硬脂酸(C18:0)去飽和產(chǎn)生油酸，一般認(rèn)為該反應(yīng)由A 9-硬脂酰ACP脫氫酶在質(zhì)體的基質(zhì)中催化完成，然后以脂形式存在的油酸被轉(zhuǎn)運(yùn)到類(lèi)囊體膜或進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步去飽和。研究表明，硬脂酸△ 9脂肪酸脫氫酶廣泛存在于油籽植物中，其表達(dá)受到生長(zhǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物和其它環(huán)境因素的影響(V. M. McDonough, J. E. Stukey, et al. JBoil Chem, 1992. 267: 5931-5936)。由于A 9脂肪酸脫氫酶是第一個(gè)向脂肪酸引入雙鍵的酶，其決定了生物體中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量比，在不飽和脂肪酸的合成中起了關(guān)鍵作用。目前，已有多種動(dòng)物、植物、微生物等不同來(lái)源的脂肪酸脫氫酶基因的同源序列被分離獲得，有些推定的脂肪酸脫氫酶基因已證明具有相應(yīng)的酶功能。研究A9脂肪酸脫氫酶的表達(dá)、生理功能和應(yīng)用是當(dāng)前的熱點(diǎn)之一(Luo Tong et al. ,2006. BiotechnologyLetters 28，657-662)。同時(shí)，作為天然A 9脂肪酸脫氫酶蛋白，其穩(wěn)定性、底物親合性等酶學(xué)性質(zhì)均有待進(jìn)一步提高。更重要的是高油含量的植物中含有的△ 9脂肪酸脫氫酶，如麻瘋樹(shù)△ 9脂肪酸脫氫酶，能否在異源真核細(xì)胞如酵母中生產(chǎn)不飽和脂肪酸并用于酵母發(fā)酵生產(chǎn)油脂仍是一個(gè)有待解決的問(wèn)題。利用分子進(jìn)化的手段對(duì)天然的麻瘋樹(shù)A9脂肪酸脫氫酶。因此，利用分子進(jìn)化的手段對(duì)△ 9脂肪酸脫氫酶分子進(jìn)行改造，改善其酶學(xué)性質(zhì)，就顯得越發(fā)重要。定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計(jì)，不需事先了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)以及催化機(jī)制等，而是通過(guò)模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對(duì)酶基因進(jìn)行廣泛的突變，產(chǎn)生基因多樣性，再結(jié)合定向篩選，獲得具有某些預(yù)期特征的進(jìn)化酶。易錯(cuò)PCR以其操作簡(jiǎn)便、有效等優(yōu)點(diǎn)成為目前應(yīng)用最為廣泛的進(jìn)化手段之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，通過(guò)致錯(cuò)PCR技術(shù)獲得一種比麻瘋樹(shù)的野生型A 9脂肪酸脫氫酶進(jìn)一步提高不飽和脂肪酸產(chǎn)量的突變基因，并提供編碼這一突變基因的核苷酸或其核苷酸序列的片段、類(lèi)似物或者衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供該基因所編碼的A9脂肪酸脫氫酶突變體多肽、或其片段、類(lèi)似物或衍生物。本發(fā)明更進(jìn)一步所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供含有該基因核苷酸序列可進(jìn)行功能性表達(dá)的重組質(zhì)粒。本發(fā)明更進(jìn)一步所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供該基因核苷酸序列或包含該基因核苷酸序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核宿主細(xì)胞及其后代。本發(fā)明更進(jìn)一步所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用含有該基因核苷酸序列、或該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞，提高相應(yīng)不飽和脂肪酸產(chǎn)量的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
首先，本發(fā)明提供一種通過(guò)致錯(cuò)PCR技術(shù)獲得的編碼麻瘋樹(shù)A 9脂肪酸脫氫酶突變體的基因，該基因具有序列表中SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。其次，本發(fā)明還提供由上述核苷酸序列所編碼的麻瘋樹(shù)A9脂肪酸脫氫酶突變體，該突變體具有上述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，即序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。所述氨基酸序列是與野生型麻瘋樹(shù)A9脂肪酸脫氫酶相比含有缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸后的突變體氨基酸序列，而且該序列具有提高的△ 9脂肪酸脫氫酶的活性。第三方面，本發(fā)明也提供含有上述編碼A9脂肪酸脫氫酶突變體的核苷酸序列，可進(jìn)行功能性表達(dá)的重組質(zhì)粒。在本發(fā)明的實(shí)施例中，該重組表達(dá)載體是上述的核苷酸序列連接異源啟動(dòng)子而成的重組pYES2/CT/Jc A 9mut質(zhì)粒。第四方面，本發(fā)明還提供被上述核苷酸序列或包含上述核苷酸序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。它是細(xì)菌細(xì)胞、或真菌細(xì)胞、或植物細(xì)胞、或動(dòng)物細(xì)胞，或這些宿主細(xì)胞的后代。特別是釀酒酵母細(xì)胞。、
第五方面，本發(fā)明還涉及一種上述突變體、突變基因、宿主細(xì)胞在生產(chǎn)不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。提供一種用含有上述核苷酸序列、或上述核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞，提高相應(yīng)不飽和脂肪酸產(chǎn)量的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述含有重組質(zhì)粒的釀酒酵母細(xì)胞的A9不飽和脂肪酸產(chǎn)量得到顯著提升。
、、
本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明通過(guò)易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)麻瘋樹(shù)A9脂肪酸脫氫酶進(jìn)行體外定向進(jìn)化，獲得的突變酶可以大幅提高不飽和脂肪酸含量。


圖IA為本發(fā)明實(shí)施例中所用的酵母表達(dá)載體PYES2/CT的模式圖。圖IB為本發(fā)明麻瘋樹(shù)A 9脂肪酸脫氫酶突變基因重組表達(dá)質(zhì)粒(或載體)pYES2/CT/Jc A 9mut的模式圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例中的麻瘋樹(shù)△ 9脂肪酸脫氫酶突變體在釀酒酵母中表達(dá)的免疫印記圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例中在釀酒酵母中表達(dá)的麻瘋樹(shù)△ 9脂肪酸脫氫酶突變體蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定的多肽片段(陰影部分)。圖4A及圖4B為本發(fā)明實(shí)施例中在釀酒酵母中表達(dá)的麻瘋樹(shù)A 9脂肪酸脫氫酶突變體蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定的多肽片段的二級(jí)質(zhì)譜圖。圖5A為本發(fā)明實(shí)施例中表達(dá)麻瘋樹(shù)A 9脂肪酸脫氫酶突變體蛋白的宿主細(xì)胞的不飽和脂肪酸組分的氣相色譜對(duì)比圖。圖5B為表達(dá)野生型A 9脂肪酸脫氫酶的宿主細(xì)胞的不飽和脂肪酸組分的氣相色譜對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例并參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)該理解的是，以下所述的實(shí)施例僅是用于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例一麻瘋樹(shù)A 9脂肪酸脫氫酶突變文庫(kù)的構(gòu)建 一、麻瘋樹(shù)cDNA的制備
選取新鮮的麻瘋樹(shù)葉片，放入液氮中冰凍，然后放入_80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂檬鶡谆寤?Cetyltrimethyl Ammonium Bromide, CTAB)法提取組織總RNA，具體實(shí)施1) 65°C水浴中預(yù)熱15 ml CTAB提取液；2)液氮中研磨2_3克麻瘋樹(shù)冷凍組織；3)轉(zhuǎn)移樣品至有CTAB提取液的離心管中，立即在室溫下以10(T300轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速進(jìn)行激烈渦旋30s，然后65°C水浴4-5分鐘；4)加入等體積的氯仿/異戊醇，渦旋混合，10000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心15分鐘；5)將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，重復(fù)抽提一次；6)將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，加入1/3體積的氯化鋰，至終濃度為2 M，4°C沉淀過(guò)夜；7)4°C下以全速離心(轉(zhuǎn)速為10000 15000轉(zhuǎn)/分鐘，下同)1小時(shí)，棄上清液，用500 U I70%乙醇(體積百分比，下同)洗沉淀，然后用500 u I 100%乙醇洗沉淀；8)用500 u I SSTE溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至I. 5 ml離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提一次；9)加入2倍體積的無(wú)水乙醇，在_70°C沉淀30分鐘或_20°C沉淀2小時(shí)；10) 4°C下全速離心20分鐘，沉淀RNA ; 11)先用400 ill 70%乙醇洗沉淀，然后用400 U I 100%乙醇洗沉淀，吹干后用100U I的二乙基焦碳酸酯處理的水溶解RNA ；12)用DNA酶處理提取的RNA，_20°C保存?zhèn)溆?。將約5 V- g麻瘋樹(shù)葉片組織的總RNA,采用Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Superscript III First Strand)合成 cDNA。二、致錯(cuò) PCR
根據(jù)已知的麻瘋樹(shù)A 9脂肪酸脫氫酶基因設(shè)計(jì)引物JcDES_F (5’- CCC AAG CTT ACCATG Get ctc aag ctc aat cct -3，，HindIII)和 JcDES_R (5，-CCG GAA TTC CAG CTTCAC TTC TCT ATC AAA-3’，EcoRI)。以麻瘋樹(shù)葉片組織的cDNA作為模板，進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增。每50 U I反應(yīng)體系包含lXTaq DNA聚合酶緩沖液(50 mM氯化鉀，10 mM三羥甲基氨基甲烷，pH9. 0,0. 1%聚乙二醇辛基苯基醚(w/v，g/1)) ；0. 2 mM dNTP 混合物；引物 JcDES_F 和 JcDES_R 各 15 pmol ；0. 15 mM氯化錳；1. 5 mM氯化鎂；cDNA模板4 u I ；Taq DNA聚合酶5 U。PCR程序?yàn)?4°C5分鐘；94°C 50秒，550C 45秒，72°C I分20秒，40個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘。三、表達(dá)載體簡(jiǎn)介
實(shí)驗(yàn)所用釀酒酵母表達(dá)載體為PYES2/CT (來(lái)自Invitrogen公司),長(zhǎng)度5，963 bp (見(jiàn)圖1A)。PYES2/CT帶有GALl啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型，在葡萄糖存在時(shí)轉(zhuǎn)錄受到抑制，除去葡萄糖加入半乳糖可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄；該載體具有8-9個(gè)單克隆位點(diǎn)和2個(gè)BstX克隆位點(diǎn)；具有CYCl轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；具有pUC復(fù)制起始子，能夠在大腸桿菌中保持和復(fù)制；具有氨芐選擇抗性(Ampicillin, Amp),用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子；具有URA3基因,用于在缺乏尿喃啶的最小培養(yǎng)基(SC/-U)中篩選酵母轉(zhuǎn)化子。與以往的pYES表達(dá)載體相比，pYES2/CT最大特色在于其具有羧基末端標(biāo)簽，可表達(dá)多肽-V5抗原決定簇和6XHis氨基酸短肽，用于重組蛋白的檢測(cè)和純化。四、突變文庫(kù)的構(gòu)建
將致錯(cuò)PCR所得的PCR產(chǎn)物純化后，與pYES2/CT質(zhì)粒同時(shí)以Hindi 11和EcoRI雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)膠純化后，在T4 DNA連接酶的作用下連接，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DHlOB細(xì)胞，涂布LB (含100 u g/ml Amp)平板，挑選具有插入片段的克隆，組成突變體庫(kù)。實(shí)施例二突變文庫(kù)的篩選 一、酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
實(shí)驗(yàn)所用宿主細(xì)胞為INVScl釀酒酵母(來(lái)自Invitrogen公司)，其基因型為his3Al/his3 A I, Ieu2/leu2, trpl-289/trpl-289, ura3-52/ura3-52 ；表型為His-，Leu-,Trp-, Ura-0此外，INVScl宿主細(xì)胞可以在棉子糖作為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，棉子糖既不誘導(dǎo)也不抑制克隆基因的轉(zhuǎn)錄，在其存在的情況下向培養(yǎng)基中加入半乳糖同樣可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。I)取INVScl酵母細(xì)胞于30°C在YPD平板上劃線培養(yǎng)；2)挑選直徑2 mm的單菌落于50 ml液體YPD培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)過(guò)夜；3)將過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至300 ml新鮮的YPD培養(yǎng)基在27°C下繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時(shí)，至0D600約為0. 5 ;4)室溫下1，OOOXg離心5分鐘收集菌體，以25 ml TE溶液(10 mM三羥甲基氨基甲烷，pH 7.5,1 mM乙二胺四乙酸)洗一次，菌體重懸于I ml醋酸鋰/TE溶液(0. I M醋酸鋰，10 mM三羥甲基氨基甲烷，pH 7. 5，I mM乙、二胺四乙酸)中；5)加入2 mg變性鮭魚(yú)精DNA (使用前于100°C加熱5分鐘，立即置于冰上)和10-50 Ug突變文庫(kù)DNA，混勻；6)加入6 ml聚乙二醇/醋酸鋰/TE溶液(含40%聚乙二醇4000的醋酸鋰/TE溶液(w/v，g/l))，輕柔混勻，30°C搖床培養(yǎng)30分鐘；7)加入700U I 二甲基亞砜，于42°C水浴熱激15分鐘，然后冷卻細(xì)胞1-2分鐘；8)室溫下1，OOOXg離心5分鐘；9)將細(xì)胞重懸于I ml TE溶液中，涂布于SC/-U (2%葡萄糖(w/v，g/1，下同))選擇性平板，30°C培養(yǎng)72小時(shí)。二、酵母工程菌的誘導(dǎo)和表達(dá)
將含有突變文庫(kù)質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆及含有野生型A9脂肪酸脫氫酶質(zhì)粒的對(duì)照菌在SC/-U (2%葡萄糖)平板上劃線培養(yǎng)，溫度30°C，至長(zhǎng)出菌落；挑單克隆接入40 ml SC/-U(2%葡萄糖)液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至0D600為0. 4 ;將菌液離心，去掉上清，然后以等體積的、去離子水洗兩次；將菌體重懸于40 ml SC/-U (2%半乳糖和1%棉子糖(均為w/v, g/1))液體培養(yǎng)基中，于30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)12-36小時(shí)，至0D600為2. 0 ;離心收集菌體，放_(tái)20°C備用。三、脂肪酸提取及甲酯化
將收集的酵母菌體于真空冷凍干燥機(jī)中干燥過(guò)夜，然后稱(chēng)重；加入7. 6 ml氯仿/甲醇/水(I :2:0. 8，v/v)，再加入3 十七烷酸(C17:0) (10 mg/ml)做內(nèi)標(biāo)；室溫劇烈震蕩至少2 h ;加入氯仿和水各2 ml，然后于4，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘；將下層有機(jī)相于快速真空器中揮發(fā)干凈；加入4 ml甲苯/石油醚/0.4 M KOH甲醇溶液(1:1:2，v/v)，劇烈震蕩使其充分溶解，于室溫放置I小時(shí)；加入5 ml水，混勻后于4，000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘；取
0.5 ml上層有機(jī)相做GC-MS分析。四、脂肪酸GC-MS分析
所用 GC-MS 儀為 7890A/5975C (Agilent 公司)。毛細(xì)管HP_5MS，30mX 0. 25 mm X
0.25 Um0進(jìn)樣條件為用氦氣做載氣相，氣流速度為0.7 ml/分鐘，進(jìn)樣量為2 yl，分離比例為10:1，氣化室溫度為250°C ;柱溫程序?yàn)?00°C保溫2分鐘，然后以10°C /分鐘升溫至180°C，再以4°C /分鐘升溫至260°C，最后冷卻儀器結(jié)束測(cè)量。氣相色譜分離峰經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)并采用Agilent MSD ChemStation分析軟件比對(duì)NIST 08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)可得知對(duì)應(yīng)的脂肪酸組分。實(shí)施例三一種提高不飽和脂肪酸產(chǎn)量的△ 9脂肪酸脫氫酶突變體的構(gòu)建及檢測(cè)
一、A9脂肪酸脫氫酶突變體表達(dá)載體的構(gòu)建
在對(duì)隨機(jī)挑取的含有△ 9脂肪酸脫氫酶突變體質(zhì)粒的酵母菌的脂肪酸含量分析后發(fā)現(xiàn)，其中一個(gè)菌株比野生型的脂肪酸含量提高了將近一倍。我們將突變后的基因測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，有20個(gè)氨基酸發(fā)生了突變，而且由于A1102T顛換導(dǎo)致第368位密碼子的無(wú)義突變。由此，我們以此突變基因?yàn)槟０澹瑯?gòu)建從第368位氨基酸缺失的突變體。為此，我們以JcDES_F 為上游引物，以 JcDES_deletion_R (5，-CCGGAATTCAATTCTTGGAGGTAACCGAC-3’，EcoRI)為下游引物，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。將所得PCR產(chǎn)物純化后，與pYES2/CT質(zhì)粒同時(shí)以HindIII和EcoRI雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)膠純化后，在T4 DNA連接酶的作用下連接，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DHlOB細(xì)胞，涂布LB(含100 u g/ml Amp)平板。挑選單克隆，提取質(zhì)粒。采用雙酶切方法鑒定重組質(zhì)粒，將含有插入片段的重組質(zhì)粒(見(jiàn)圖1B)命名為pYES2/CT/JcA9mut。然后將其轉(zhuǎn)入INVScl酵母細(xì)胞。二、A 9脂肪酸脫氫酶突變體的檢測(cè)
將上述少量經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的酵母菌體重懸于5 ml緩沖液A (8M尿素，300mM氯化鈉，
0.5%壬基酚聚氧乙烯醚，50mM磷酸氫二鈉，50mM三羥甲基氨基甲烷，pH 8.0，ImM苯甲基磺酰氟)；利用高壓細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞；于15，000 X g，10°C，離心20分鐘；將離心后的上清液加入緩沖液A平衡過(guò)的250 u I Ni-NTA瓊脂糖中，于4°C孵育I小時(shí)；于2，000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C，離心I分鐘，去上清液，用緩沖液A洗兩次；加入500 洗脫液(含250 mM咪唑的緩沖液A)于室溫孵育10分鐘；于2，000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C，離心I分鐘，收獲上清液。取一定量的洗脫組分進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳一塊凝膠用以將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(poly (vinylidene fluoride), PVDF)膜做免疫印記,另一塊凝膠做考馬斯亮藍(lán)染色。電泳后的蛋白經(jīng)濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，經(jīng)過(guò)脫脂牛奶封閉后，以抗6XHis的鼠源抗體作為一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，作用于目的蛋白；最后采用辣根過(guò)氧化物酶-電化學(xué)發(fā)光法對(duì)目的蛋白進(jìn)行分析鑒定(見(jiàn)圖2)。對(duì)應(yīng)于免疫印記的結(jié)果，將考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠上相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性條帶切下并切成小膠粒，使用含50%乙腈和50 mM的碳酸氫銨溶液將其脫色徹底。然后使用10 mM的二硫蘇糖醇和55 mM的碘乙酰胺對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行還原烷基化，隨后使用100%的乙腈將膠粒完全脫水后使用約為目標(biāo)蛋白1/30質(zhì)量的胰酶(25mmol/l的碳酸氫銨溶液配制)于37°C酶切過(guò)夜。酶切完成后，經(jīng)過(guò)抽提和脫鹽的步驟，樣品即可進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析使用的是Waters UPLC-Q-TOF質(zhì)譜儀。流動(dòng)相為溶液A (0.1%甲酸)和溶液B (99%乙腈/0. 1%甲酸)。分析時(shí)間為90分鐘。梯度為1%-40%溶液匕40分鐘；40%-80%溶液B，5分鐘；80%溶液B，15分鐘；1%溶液B，30分鐘。質(zhì)譜結(jié)果分析使用Waters公司的ProteinLynx軟件的AutoMode模式，以A 9脂肪酸脫氫酶突變體的基因序列的理論蛋白序列進(jìn)行分析。質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖3所示，△ 9脂肪酸脫氫酶突變體蛋白共有7段胰酶酶切多肽片段得到鑒定(二級(jí)質(zhì)譜圖如圖4A及圖4B所示)，其覆蓋率為21. 7%。重要的是，兩段包含點(diǎn)突變的多肽片段 VTHSMPPQKIEV(I — V)FK 和 DN(D — N)D(N — D)LFDHFSAVAQR也得到質(zhì)譜鑒定。三、含有△ 9脂肪酸脫氫酶突變體的酵母工程菌的脂肪酸含量分析
麻瘋樹(shù)A 9脂肪酸脫氫酶突變體蛋白與野生型蛋白的GS-MS的結(jié)果分別如圖5A、圖5B所示，麻瘋樹(shù)△ 9脂肪酸脫氫酶突變體蛋白與野生型相比，可明顯提高釀酒酵母的不飽和脂肪酸的產(chǎn)量。經(jīng)所加內(nèi)標(biāo)C17:0的濃度校正后得知，酵母工程菌的主要脂肪酸含量如表I所示。表達(dá)突變蛋白與表達(dá)野生型蛋白的宿主細(xì)胞相比，其C16:1 A 9不飽和脂肪酸的含量提高了 I倍，C18:1 A9不飽和脂肪酸的含量提高了 I. 5倍。表I酵母工程菌的主要脂肪酸組分與含量權(quán)利要求
1.一種編碼麻瘋樹(shù)Λ9脂肪酸脫氫酶突變體的基因，其特征在于，該基因具有序列表中SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。
2.ー種麻瘋樹(shù)△ 9脂肪酸脫氫酶突變體，其特征在干，該突變體具有權(quán)利要求I所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，即序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的麻瘋樹(shù)△9脂肪酸脫氫酶突變體，其特征在于，所述氨基酸序列是與野生型麻瘋樹(shù)△ 9脂肪酸脫氫酶相比含有缺失、替換或插入ー個(gè)或多個(gè)氨基酸后的突變體氨基酸序列，而且該序列具有提高的△ 9脂肪酸脫氫酶的活性。
4.一種表達(dá)麻瘋樹(shù)△ 9脂肪酸脫氫酶突變體基因的重組質(zhì)粒，其特征在于，該重組表達(dá)載體是權(quán)利要求I所述的核苷酸序列連接異源啟動(dòng)子而成的重組PYES2/CT/Jc Δ 9mut質(zhì)粒。
5.一種產(chǎn)生麻瘋樹(shù)△ 9脂肪酸脫氫酶突變體的轉(zhuǎn)基因真核宿主細(xì)胞，其特征在干，該宿主細(xì)胞選自 a)用權(quán)利要求I所述的核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞； b)用權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任ー項(xiàng)在通過(guò)酵母發(fā)酵生產(chǎn)不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。
全文摘要
一種麻瘋樹(shù)Δ9脂肪酸脫氫酶突變體及其編碼基因、重組質(zhì)粒、宿主細(xì)胞與應(yīng)用，該酶屬于酰基-?；d體蛋白脫氫酶，具有良好水溶性，與野生型Δ9脂肪酸脫氫酶相比，使酵母細(xì)胞的總脂肪酸、不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸的產(chǎn)量均提高1倍。該編碼基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或該核苷酸序列的片段、類(lèi)似物和衍生物。Δ9脂肪酸脫氫酶突變基因共有25個(gè)核苷酸發(fā)生突變，導(dǎo)致20個(gè)氨基酸發(fā)生突變，氨基酸序列見(jiàn)SEQIDNO:2所示。本發(fā)明還提供含有該基因核苷酸序列的可進(jìn)行功能性表達(dá)的重組質(zhì)粒、含有該重組質(zhì)粒的細(xì)胞生物體及其子代、用上述重組質(zhì)粒或含有該重組質(zhì)粒的細(xì)胞生物體及其子代提高不飽和脂肪酸產(chǎn)量的方法及其在酵母發(fā)酵生產(chǎn)油脂方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/865GK102676548SQ20111006375
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者郭欣 申請(qǐng)人:嘉漢林業(yè)(廣州)有限公司