專利名稱：桉樹wpgs5或wpgs6基因及其過量表達具有調控和增加植物生長量的功能的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域,具體涉及桉樹(及的兩個和增加生物量相關的WPGS5和WPGS6基因。
背景技術：
桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉樹屬(Eucalyptus)的總稱,是一種集觀賞、用材、紙漿原料、藥用于一體的優(yōu)良樹種。由于林木生長周期長，遺傳雜和性高，許多性狀屬于多基因控制的數量性狀，常規(guī)的育種手段難以滿足定向培育桉樹新品種的要求，因此人們將研究重點及成功希望寄托于基因工程技術來解決桉樹常規(guī)育種難以解決的問題，加速優(yōu)質、聞廣按樹新品種的選育進程。林木等木本植物基因資源豐富，但許多天然優(yōu)良基因尚未被分離利用，大部分基因的功能仍處于未知的狀態(tài)。因此，研究桉樹中能增加生物量的基因可為進一步進行基因工程改造、獲得高產量的優(yōu)良樹種奠定基礎，具有重要意義。目前對林木基因的分離及功能鑒定主要通過與模式植物擬南芥或煙草等的同源基因進行相似性比較，建立進化樹，運用反向遺傳學方法，通過調控基因表達如過表達或基因沉默等技術研究基因的功能。蘇曉華等(2009)從美洲黑楊中分離得到MADS-box基因PdPl,并在煙草中過表達，導致其提前開花。李海霞等(2009)將毛白楊的PtDRGOl基因導入煙草，轉基因植株的煙草花葉病毒量顯著少于對照，表明該基因具有抗病毒功能。Sonoda等將赤桉HD-Zip class II轉錄因子EcHBl基因轉入煙草，轉基因植株纖維長度和干重增力口，葉片、根和莖的生長量均高于對照。本專利涉及的兩個基因均為在擬南芥中證實有增加生物量功能的基因的桉樹同源基因。ABAPl全稱為犰狳BTB擬南芥蛋白1，在擬南芥葉片發(fā)育中通過和前復制復合物亞基互作參與了對有絲分裂的負反饋調控。ABAPl過表達會抑制有絲分裂中DNA的復制，從而減少細胞的擴增，相反，下調ABAPl的表達則會促進細胞分裂，從而使植物葉片增大。H0G1，全稱為同源依賴的基因沉默，擬南芥的HOGl蛋白顯示出與細胞分裂素的高親和力結合，過表達HOGl基因的擬南芥植株，生物量顯著降低，但在降低HOGl表達的轉基因植株中，葉產量增加。上述基因在擬南芥和煙草等植物中已有較為透徹的功能研究，但在林木中的分離鑒定工作還有待進行。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是從桉樹中克隆出兩個和增加植物生物量有關的WPGS5與WPGS6基因并在擬南芥中通過基因沉默方法驗證了其生物功能，從而為該基因在林木基因改造和分子育種中的應用奠定了基礎。本發(fā)明又一目的是提供一種提高植物生物量的方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案、對桉樹的RNA進行深度測序得到桉樹的cDNA序列文庫，然后從桉樹cDNA文庫中查找與NCBI Genbank中收集到的AtABAPl和AtHOGl編碼蛋白的氨基酸序列進行序列相似性比對(tBLASTn)，得到桉樹WPGS5 和WPGS6 基因的cDNA序列(SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4)，其中WPGS5編碼的蛋白和擬南芥中AtABAPl蛋白的氨基酸序列相似度為65%，而WPGS6和AtHOGl的氨基酸序列相似度為88%。本發(fā)明所提供的提高植物生物量的方法，是將所述的桉樹WPGS5或WPGS6基因轉入一個雙子葉植物，預期將具有90%以上同源性及編碼相同蛋白的內源ABAPl基因或HOGl基因從植物個體，組織或器官中敲除，使轉基因植物的生物量比野生植物在相同種植環(huán)境下得到提聞。在上述的提高植物生物量的方法中，是將桉樹的WPGS5基因和WPGS6基因用已知方法進行克隆，修飾和設計所得到的。從桉樹中克隆出WPGS5和WPGS6基因的保守序列反義片段(SEQ ID NO 6 , 8 )用于基因沉默的載體構建。WPGS5基因的保守片段是從WPGS5已知序列(SEQ ID NO 2)中截取的第262個堿基到第633個堿基這一段高度保守片段，其長度為371個堿基。WPGS6的保守片段是從已知序列(SEQ ID NO 4)中截取的第297個堿基到第603個堿基這一段長度為406bp的高度保守區(qū)域。植物基因沉默pSV載體具有一段來源于桉樹基因ELFl的內含子(EU ELFlintron), ELFl 全稱為 LEAFY/FLORICAULA 同源基因，GenBank 中的登記號位 AF034806. 1，其序列為序列表中的SEQ ID NO: LELFl intron也就是該基因所含有的一段內含子序列(SEQ ID NO: 10)，從873bp到967bp，其長度為94bp。本專利中，WPGS5或WPGS6的保守片段(SEQ ID NO 5, 7)的正義序列和反義序列(SEQ ID NO: 6，8)分別成對插入ELFl的內含子的兩端，形成發(fā)夾結構(如圖I，圖2 )。然后，將該載體通過根癌農桿菌轉入擬南芥中用于基因沉默，從而得到了 WPGS5基因或WPGS6基因功能缺失的轉基因突變株。(如圖3，圖4)。本發(fā)明的有益效果如下
本發(fā)明提供了一個來源于桉樹的WPGS5基因及其編碼蛋白。轉基因實驗證明，下調的WPGS5基因表達會促進細胞分裂，從而使植物葉片增大圖。因此，在同樣的生長環(huán)境及生長時間下，WPGS5基因的功能缺失突變株系能產生更高生物量。如圖5所示，和野生型植株相t匕，WPGS5基因敲除突變株的葉盤直徑顯著增大，從而證實該基因在增加生物量方面的功倉泛。本發(fā)明亦提供了一個來源于桉樹的WPGS6基因。它通過與植物激素細胞分裂素相、互作用于調控植物的生長發(fā)育。過表達WPGS6基因的擬南芥植株，生物量顯著降低，相反本發(fā)明中的實例證實WPGS6表達敲除的轉基因植株葉產量增加(如圖6)。本發(fā)明提高植物生物量的方法，通過克隆和鑒定桉樹中推定的，相似的ABAPl基因和HOGl基因，研究其生物學功能，然后利用生物學技術和遺傳學的方法，改良植物的生物量，對培育新品種的高產量作物有著重要的理論意義及經濟價值。


圖I是含有WPGS5基因發(fā)夾結構的pSV基因沉默載體說明圖。其中
WPGS5 sense 代表 DNA 片段序列 SEQ ID NO: 5ELFl intron 代表 DNA 片段序列SEQ ID NO: 10 WPGS5 antisense 代表 DNA 片段序列 SEQ ID NO: 6。圖2是含有WPGS6基因發(fā)夾結構的pSV基因沉默載體說明圖。其中
WPGS6 sense 代表 DNA 片段序列 SEQ ID NO: 7
ELFl intron 代表 DNA 片段序列SEQ ID NO: 10 WPGS6 antisense 代表 DNA 片段序列 SEQ ID NO: 8。圖3是WPGS5基因沉默突變株基因組DNA鑒定。圖4是WPGS6基因沉默突變株基因組DNA鑒定。圖5是WPGS5基因敲除導致擬南芥葉盤增大。其中(A)為T2代突變體和野生型的的葉盤直徑生長曲線。樣本量>10，在差異顯著性分析(T檢驗)中，P值均小于0.05，也就是說兩者沒有差異的概率小于5%，差異達到顯著水平。(B)為播種后35天的植株照片。圖左為野生型，右為ABAPl基因敲除突變體。圖6是WPGS6基因敲除導致擬南芥葉盤增大。其中(A)為T2代突變體和野生型的的葉盤直徑生長曲線。樣本量>10，在差異顯著性分析(T檢驗)中，P值均小于0.05，也就是說兩者沒有差異的概率小于5%，差異達到顯著水平。(B)為播種后35天的植株照片。圖左為野生型，右為WPGS6基因敲除突變體。
具體實施例方式下面通過具體實施例并參照附圖對本發(fā)明進行更詳細的說明。應該理解的是，以下所述的實施例僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。實施例一桉樹WPGS5和WPGS6基因的克降 I.桉樹cDNA的制備
選取新鮮的桉樹(Eucalyptus DH32-29)葉片，放入液氮中冰凍，然后放入_80V冰箱中
保存?zhèn)溆?。參考Murray和Thompson (1980)的方法，使用十六燒基三甲基溴化胺(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide, CTAB)法提取組織總 RNA,具體實施I) 65°C水域中預熱15 ml CTAB提取液；2)液氮中研磨2_3克桉樹冷凍組織；3)轉移樣品至有CTAB提取液的離心管中，立即激烈渦旋30s，然后65°C水浴4-5分鐘；4)加入等體積的氯仿/異戊醇，渦旋混合，10000轉/分鐘常溫離心15分鐘；5)將上清轉移至一新的離心管中，重復抽提一次；6)將上清轉移至一新的離心管中，加入1/3體積的氯化鋰，至終濃度為2 M，4°C沉淀過夜；7) 4°C全速離心I小時，棄上清，用500 u I 70%乙醇洗沉淀，然后用500 u I 100%乙醇洗沉淀；8)用500 u I無RNA酶的水溶解沉淀，轉移至1.5 ml離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提一次；9)加入2倍體積的無水乙醇，在-70°C沉淀30分鐘或_20°C沉淀2小時；10) 4°C全速離心20分鐘，沉淀RNA ；11)先用400 70%乙醇洗沉淀，然后用400U I 100%乙醇洗沉淀，吹干后用100 u I的二乙基焦碳酸酯處理的水溶解RNA ；12)用DNA酶處理提取的RNA，_20°C保存?zhèn)溆?。將約5 ii g桉樹葉片組織的總RNA,采用Invitrogen公司的反轉錄試劑盒(Superscript III First Strand)合成 cDNA。2.桉樹WPGS5和WPGS6基因保守區(qū)序列及其反向互補序列的克隆、將桉樹(品名DH32-29)cDNA送至公司(天津生物芯片技術有限公司)進行深度測序(deep sequencing)以獲得cDNA全長序列。通過NCBI Genbank查找得到擬南芥ABAPl和HOGl基因編碼的蛋白氨基酸序列，與桉樹全長cDNA序列進行相似性比對，得到桉樹中相似蛋白的cDNA序列(SEQ ID No: 2，4)，命名為WPGS5和WPGS6，其中WPGS5和擬南芥中ABAPl蛋白的氨基酸序列相似度為65%，WPGS6和AtHOGl的氨基酸序列相似度為88%。從中截取保守片段，WPGS5基因的保守片段是從WPGS5已知序列(SEQ ID N0:2)中截取的第262個堿基到第633個堿基這一段片段，其長度為371個堿基。WPGS6的保守片段是從已知序列(SEQ ID N0:4)中截取的第297個堿基到第603個堿基這一段長度為406bp的片段。根據桉樹WPGS5和WPGS6基因保守序列以及pSV雙元載體上的多酶切位點設計引物(下劃線處為酶切位點)
正義序列引物
上游WPGS5-BamHI-F ACGCGGATCCAACGGGACTCTCTTGTTC 下游WPGS5- NcoI-R CATGCCATGGGATGTCAGCCTCAGAGAC 上游WPGS6-BamHI-F ACGCGGATCCGTGCAAAGAGCTGCTGCTG 下游WPGS6-NcoI-R ACGCGGATCCGTGCAAAGAGCTGCTGCTG 反義序列引物
上游WPGS5- SacI-F ACGCGAGCTCAACGGGACTCTCTTGTTC 下游ffPGS5-PvuII~R ACGCCAGCTGGATGTCAGCCTCAGAGAC 上游 WPGS6-SacI-F ACGCGAGCTCGTGCAAAGAGCTGCTGCTG 下游ffPGS6-PvuII~R ACGCCAGCTGGTCGTCGGACTGAAGCATG
根據Invitrogen公司提供的Platinum Pfx DNA Polymerase說明書，PCR擴增體系如下10 Xpfx PCR 緩沖液 5 iil，硫酸鎂(50 mM) 2u I, dNTPs (10 mM) liU，5’ 端引物(IOii M) I iil，3’端引物(IOiiM) I iil，桉樹 cDNA 2u l,pfx 高保真 DNA 聚合酶 0. 4 yl (購自Invitrogen公司)，水38 U 1，總體積50 yl。PCR擴增程序為先94 °C預變性5分鐘；然后94 °C 40秒，53 °C 40秒，68 ° C 40秒，共40個循環(huán)，最后68 °C延伸5分鐘。3. pSV基因沉默載體簡介
實驗所用植物基因沉默載體為PSV，長度14. 3kp (見圖1，2)。PSV帶有花椰菜花葉病毒35S啟動子，它為兩個35S啟動子并排重現(xiàn)型啟動子，可在植物的各個發(fā)育階段持續(xù)表達；具有NOS轉錄終止信號；具有卡納霉素(Kanamycin, Kan)選擇抗性,用于篩選大腸桿菌和農桿菌轉化子；具有潮霉素選擇抗性(Hygromysin, Hyg),用于篩選植物轉化子。pSV載體最大特色在于其使用一段來源于桉樹基因ELFl的內含子(Eucalyptus ELFl intron),ELFl全稱為LEAFY/FLORICAULA同源基因，GenBank中的登記號位AF034806. 1，其序列為序列表中的SEQ ID NO: 9。ELFl intron也就是該基因所含有的一段內含子序列(SEQ IDNO: 10)，從該基因的873bp到967bp，其長度為94bp。將目的基因的正義保守片段和反義保守片段分別插入ELFl的內含子的兩端形成基因沉默所需的發(fā)夾結構，如圖1-2所示pSV載體。4.含有目的基因片段的pSV載體構建
先將pSV載體用限制性內切酶SacI和PvuII-R(購自NEB生物公司)進行酶切，再和上、述的含有SacI和PvuII-R酶切位點的PCR擴增產物通過T4連接酶的作用進行連接。然后把酶連產物用BamHI-F和NcoI-R (購自NEB生物公司)進行酶切，再用T4連接酶相對應的和上述PCR擴增產物進行酶連，從而將目的片段也就是WPGS5(SEQ ID NO: 5)或WPGS6(SEQID NO: 7)的保守序列以及它們的互補序列(反義序列，SEQ ID NO: 6，8)分別地插入pSV載體(如圖1，2)。酶切和酶連反應體系及條件參考NEB公司限制性內切酶使用說明書及T4連接酶使用說明書。實施例二 HOGl和ABAPl基因敲除擬南芥突變株的獲得及其性狀的觀察
參考Hiei( 1994)的方法，將含有目的基因保守片段構成的發(fā)夾結構的pSV表達載體利用凍融法轉化根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101,用擴增基因的引物進行菌落PCR鑒定，圖3所示為WPGS5基因沉默突變株基因組DNA鑒定，圖4所示為WPGS6基因沉默突變株基因組DNA鑒定結果。對陽性克隆進行大量培養(yǎng)。通過蘸花浸染法(參考SJ Clough等1998年發(fā)表在Plant Journal上的方法)轉化擬南芥，當代收獲為TO代轉基因種子。將TO代轉基因種子在含有50mg/L潮霉素(hygromycin)的MS培養(yǎng)基上進行篩選，只有載體成功轉入并表達的植株才能獲得潮霉素抗性從而存活，由此得到轉基因陽性植株Tl代。Tl代植株成熟后得到T2代種子。最后將T2代種子播種在含有25mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上進行篩選，成活的植株即為轉基因陽性植株T2代，轉至土壤中培養(yǎng)，從播種后第三周至第8周每三天對轉基因植株的生長狀況進行一次各項生長指標的測量(株高，葉盤直徑，葉盤葉片數等)，并與在相同條件下生長的野生型擬南芥的生長指標進行比較(圖5，6 )。如圖5、6，我們統(tǒng)計了播種后第26天，29天，32天以及35天的轉基因及野生型的擬南芥葉盤大小，結果發(fā)現(xiàn)WPGS5和WPGS6基因敲除植株和野生型植株相比，葉盤直徑明顯增大，差異水平顯著。權利要求
1.來源于桉樹的WPGS5基因，其cDNA是下述核苷酸序為序列表中SEQID N0:2的cDNA序列。
2.來源于桉樹的WPGS6基因，其cDNA是下述核苷酸序列為序列表中SEQID NO 4的DNA序列。
3.根據權利要求I或2所述的編碼基因序列，其特征是該基因具有SEQID NO: 2或SEQID NO:4所示的核苷酸序列。
4.來源于權利要求I所述的WPGS5基因的保守序列，其特征是該保守序列是SEQIDN0:5所示的核苷酸序列。
5.來源于權利要求2所述的WPGS6基因的保守序列，其特征是該保守序列是SEQIDN0:7所示的核苷酸序列。
6.一種敲除ABAPl基因或HOGl基因的桉樹基因重組cDNA表達載體，該重組基因表達載體至少包括權利要求4或5所述的核苷酸保守序列片段，也包括權利要求4或5所述的核苷酸保守序列所對應的反義片段，所述反義片段分別是SEQ ID NO:6和SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。
7.根據權利要求6所述的基因重組cDNA表達載體，其特征是由WPGS5基因的正義和反義片段SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6成對，或者WPGS6基因的正義和反義片段SEQ ID NO: 7和SEQ ID N0:8成對，夾著ー個ELFl基因的內含子序列，構建ー個發(fā)夾形基因沉默重組表達載體，命名為PSV ;其中桉樹ELFl基因的全長cDNA核苷酸序列為SEQ ID N0:9，其內含子序列為 SEQ ID NO: 10。
8.一種提高植物生物量的方法，是將權利要求I或2所述的兩組基因從植物組織，細胞或器官中敲除，從而使植物生物量獲得提尚。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征是將權利要求7所述的重組表達載體轉入植物中實現(xiàn)對ABAPl或HOGl基因的敲除。
10.根據權利要求8或9中任一項所述的方法，其特征是所述植物包括雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩個和增加植物生物量相關的桉樹基因WPGS5和WPGS6的序列與功能，屬于生物技術領域。為此，提取到的桉樹RNA被反轉錄成cDNA，再進行深度測序，得到桉樹cDNA序列文庫。進一步將桉樹的cDNA文庫中的序列與NCBIGenbank公布的擬南芥AtABAP1和AtHOG1蛋白氨基酸序列進行相似性比較，得到桉樹中WPGS5和WPGS6cDNA序列，再選取它們的保守區(qū)域的正義和反義片段用以構建基因沉默重組載體，獲得擬南芥由基因沉默導致的功能缺失的突變株。WPGS5和WPGS6基因沉默轉基因植株顯著地提高了生物量。從而證明了桉樹WPGS5和WPGS6基因在雙子葉植物生長中的調控功能。
文檔編號C12N15/63GK102676539SQ20111006374
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權日2011年3月16日
發(fā)明者張俊, 潘昇 申請人:嘉漢林業(yè)(廣州)有限公司