專利名稱：一種制備重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種制備重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，具體涉及一種通過提高菌株胞內(nèi)NAD+的生物合成加快菌株生長速率進而提高厭氧條件下丁二酸生產(chǎn)能力的方法，具體涉及利用分子生物學(xué)手段在大腸桿菌中過量表達NAD+生物合成相關(guān)的一個或者多個基因，并且添加一定濃度的前體物質(zhì)，最終實現(xiàn)專一性厭氧條件下菌株丁二酸的生產(chǎn)能力。
背景技術(shù)：
丁二酸為大宗化學(xué)品，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品和塑料等行業(yè)，同時作為優(yōu)秀的C4平臺化合物，可用于合成1，4- 丁二醇、四氫呋喃、Y - 丁內(nèi)酯等有機化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國能源部認(rèn)為是未來12種最有價值的生物煉制產(chǎn)品之一。利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源(葡萄糖、木糖等)生產(chǎn)丁二酸，由于原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可吸收固定CO2,能有效緩解溫室效應(yīng)，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，近年來成為研究的熱點。丁二酸的生產(chǎn)菌 tti1 naerobiospirillum succiniciproducens> Actinobacillus succinogenes、 Mannheimia mccifliciZTroifoce/ ^重組谷氨酸棒桿菌和重組大腸桿菌。利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸，雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進程。大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點，近年來被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。大腸桿菌作為一種兼性好氧菌，在有氧及厭氧條件下均能生長，但在有氧條件下，菌株生長快速，采用合適的策略細胞最終密度可以提高至細胞干重幾百，且胞內(nèi)碳代謝走三羧酸循環(huán)；在厭氧條件下大腸桿菌生長緩慢， 且終細胞干重較低，其主要原因可能是厭氧條件下細胞進行混合酸發(fā)酵，有大量抑制物產(chǎn)生，另有原因可能是厭氧條件下胞內(nèi)的電子傳遞鏈不起作用，輔酶NAD+和ATP供給不足。利用大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵模式主要包括專一性厭氧發(fā)酵及兩階段發(fā)酵。國外Vemuri等人利用大腸桿菌AFPlll (PYC)兩階段發(fā)酵，其厭氧階段可完成1. 1 g · g—1的丁二酸收率和 1. 3 g .171 .IT1 的丁二酸生產(chǎn)強度(Applied Environmental Microbiology. 2002, 68，1715 1727)。但如果考慮有氧階段消耗的糖及花費的時間，收率和生產(chǎn)強度將下降。而專一性厭氧發(fā)酵時，由于菌株生長緩慢，且最終菌體密度低，丁二酸終濃度和收率均較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種提高大腸桿菌厭氧條件下生長能力的方法，進而提高專一性厭氧發(fā)酵過程丁二酸的生產(chǎn)能力。為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
3一種制備重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于包括以下步驟
(1)在產(chǎn)丁二酸大腸桿菌出發(fā)菌株中過量表達/7/Mi ，nadD,皿淑三種基因中的一個或者多個，得到重組大腸桿菌菌株；
(2)在發(fā)酵厭氧培養(yǎng)基中添加煙酸；
(3)利用步驟(1)得到的重組大腸桿菌專一性厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。其中，本發(fā)明所述的發(fā)酵厭氧培養(yǎng)基應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任意大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)丁二酸用的常規(guī)培養(yǎng)基，特殊地，步驟(2)中所述的添加煙酸的濃度為0. 1 mmol/L 1 mmol/ L0本發(fā)明的有益效果在于附圖1是NAD+的生物合成途徑相關(guān)的基因；本發(fā)明通過過量表達NAD+生物合成相關(guān)的基因，并且另一方面在發(fā)酵厭氧培養(yǎng)基中添加煙酸作為NAD+ 生物合成的前體物質(zhì)，這樣加快了菌株生長速率，將可大幅度提高專一性厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的能力。


圖1 NAD+的生物合成途徑。圖2加入不同濃度的煙酸進行誘導(dǎo)后對菌體生物量及丁二酸產(chǎn)量影響
其中，A 是 NZmil 添加 0. 5 mmol/L 煙酸，B 是 NZmil/pTrc99a 添加 0. 5 mmol/L 煙酸，C 至 E 是 NZmil/VTrc99a-/7/ c召添加 0. 1 mmol/L, 0. 3 mmol/L，0. 5mmol/L 和 lmmol/ L煙酸。
具體實施例方式下面的實施例對本發(fā)明作詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。本發(fā)明所述的大腸桿菌K12的來源是購自中國科學(xué)院北京微生物研究所。本發(fā)明所述的表達質(zhì)粒用pTrc99a的來源是購自htrovegen公司。本發(fā)明所述的E.coli NZm 11 的來源是Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。本發(fā)明所述的發(fā)酵用培養(yǎng)基為LB+葡萄糖(20 g/L)+堿式碳酸鎂0.48 g+Kan (卡那霉素 30 μ g/mL) +Amp (氨芐青霉素 50 μ g/mL) +Chl (氯霉素 25 μ g/mL) +0. 3 mM IPTG0實施例1
本實施例說明在大腸桿菌NZmil中過量表達卯“后，通過IPTG誘導(dǎo)，可有效提高胞內(nèi)NADH和NAD+的濃度。大腸桿菌NZmil(CGSC77^)當(dāng)導(dǎo)入質(zhì)粒pTrC99a-/7/ M，過量表達煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)了 Nzmii在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，且有高產(chǎn)量的琥珀酸積累。具體操作是
1、構(gòu)建過量表達煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的表達質(zhì)粒，其過程包括
(1)合成帶有AfcoI私Hind III酶切位點的引物，
上游引物5’ - CATGCCATGGATGACACAATTCGCTTCTCCTG-3， 下游引物5，-CCCAAGCTTCACTTGTCCACCCGTAAATGG-3，
(2)以大腸桿菌K12系列為模板，PCR擴增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5min ； (940C 45 s，55°C 45 s，72°C 1 min，;35個循環(huán))；72°C，10 min。純化擴增出的/mc召基因后，表達質(zhì)粒用pTrc99a分別用Afco I _ind III雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/7/ M。2、將質(zhì)粒pTrC99a-/7/7M導(dǎo)入五co7iNZNlll的感受態(tài)，得到重組大腸桿菌發(fā)酵菌株。為了考察過量表達煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶后對胞內(nèi)輔酶的影響，采用專一性厭氧發(fā)酵模式，按1% (ν/ν)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)厭氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 3左右時， 加入煙酸至終濃度為0. 5 mmol/L，30°C，170 rpm厭氧培養(yǎng)8 h。Ε. coli NZNl 11和構(gòu)建的重組菌株胞內(nèi)NADH和NAD+的測定，結(jié)果見表1。表1過量表達煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶對萬.cWi NZmil胞內(nèi)輔酶的影響
權(quán)利要求
1.一種制備重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于包括以下步驟(1)在產(chǎn)丁二酸大腸桿菌出發(fā)菌株中過量表達/7/Mi ，nadD,皿淑三種基因中的一個或者多個，得到重組大腸桿菌菌株；(2)在發(fā)酵厭氧培養(yǎng)基中添加煙酸；(3)利用步驟(1)得到的重組大腸桿菌專一性厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)中添加煙酸的濃度為0.1 mmol/L 1 mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明主要通過在大腸桿菌中過量表達NAD+生物合成相關(guān)的基因，并在厭氧培養(yǎng)基中添加一定濃度的煙酸作為NAD+生物合成的前體物質(zhì)，從而提高菌株在厭氧條件下的生長速率及丁二酸的合成速率。通過該方法，可以解決重組大腸桿菌專一性厭氧發(fā)酵過程中丁二酸生產(chǎn)速率慢的問題，同時為利用大腸桿菌厭氧生產(chǎn)酶制劑提高了一種手段。
文檔編號C12N1/21GK102174458SQ20111005504
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者姜岷, 歐陽平凱, 郭亭, 陳可泉, 韋萍, 馬江鋒 申請人:南京工業(yè)大學(xué)