專利名稱：一種厭氧發(fā)酵丙酮丁醇梭菌產(chǎn)丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種厭氧發(fā)酵丙酮丁醇梭菌產(chǎn)丁醇的方法，具體涉及一種通過PH脅迫調(diào)控發(fā)酵丙酮丁醇梭菌制備丁醇的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
受世界石油資源、價格、環(huán)保和全球氣候變化的影響，發(fā)展生物燃料已成為許多國家提高能源安全、減排溫室氣體、應對氣候變化的重要措施。生物燃料是指通過生物資源生產(chǎn)的適用于汽油或柴油發(fā)動機的燃料，包括燃料乙醇、生物柴油、生物丁醇、生物氣體、生物甲醇、生物二甲醚等，目前市場上以燃料乙醇和生物柴油最為常見。生物丁醇與乙醇相似，可以和汽油混合，但卻具有許多優(yōu)于乙醇之處，因此，生物丁醇的研究開發(fā)日益受到許多國家的重視。丁醇，又稱正丁醇，是重要的有機化工原料，可用作油漆和表面涂料，也用于生產(chǎn)鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)等增塑劑，還用來制造醋酸丁酯、 甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸丁酯、正丁胺、氨基樹脂、乙二醇醚，并可用于表面涂料、皮革處理、 香料、橡膠加工助劑和農(nóng)用化學品等方面。隨著我國化學工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的不斷發(fā)展，丁醇將有一定增長[柴國梁.國內(nèi)丁醇市場分析.上?；ぃ?006，31 O): 49 52]。從丁醇的消費市場看，丙烯酸丁酯和醋酸丁酯需求的強勁增長將是推動丁醇消費增長的主要動力。作為燃料，丁醇有能量密度大、對水的穩(wěn)定性高、可直接用于內(nèi)燃機、運輸方便等優(yōu)點，在能源危機日益嚴峻的今天，丁醇作為燃料有著廣闊的發(fā)展前景。丁醇與乙醇相似， 都是醇類燃料，但是丁醇和乙醇相比具有以下優(yōu)勢[沈佩芝，任誠.丁醇、辛醇生產(chǎn)技術(shù)與市場需求預測·化工進展，2005，24(2) :216 220]。(1) 丁醇具有較高的能量密度，和汽油相近，而乙醇的能量密度比汽油低35%。由于丁醇有較高的能量含量，可更方便地與汽油調(diào)和，同時可調(diào)入更高濃度，無需改造汽車。(2)因其類似烴類的結(jié)構(gòu)，丁醇對水的溶解性比乙醇小得多，并且可在煉油廠調(diào)和并用管道運送，不像乙醇，必須在分銷終端進行調(diào)和。(3)汽油中的主要組成是C6 C8，因此丁醇比乙醇更類似于“油”，它與燃料添加劑和潤滑油配伍性更好。(4)生物丁醇可利用煉油廠原有基礎(chǔ)設(shè)施，而乙醇不行。丁醇的化學結(jié)構(gòu)使其與乙醇相比有幾方面的優(yōu)點，包括低蒸汽壓和在汽油調(diào)和物中耐水污染，使其有利于在現(xiàn)有的分配管網(wǎng)中使用；而乙醇易吸引水分子，并有腐蝕管線的傾向，在它用于與汽油調(diào)和時，必須使用汽車槽車等運輸工具，以相對較小的數(shù)量運送[DUrre P. New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation. Appl Microbiol Biotechnol. 1998，49:639 648]。丙酮丁醇梭菌的代謝途徑開始是從葡萄糖經(jīng)丙酮酸到大量乙酸、丁酸積累，然后從乙酸和丁酸形成丙酮、丁醇和乙醇。此過程是一個厭氧、發(fā)酵的過程，且可分為三個時期， 即前發(fā)酵期、主發(fā)酵期和后發(fā)酵期。在前發(fā)酵期，PH值下降，丙丁菌細胞數(shù)目激烈增加，溶劑產(chǎn)生很少，主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙酸、丁酸、H2和C02等；在主發(fā)酵期，丁酸和乙酸被還原，pH值上升，其減酸速率與前發(fā)酵期的升酸速率相似，其中丁酸的減少比乙酸多，轉(zhuǎn)變成丙酮、丁醇等溶劑，在這個時期，發(fā)酵現(xiàn)象最旺盛，菌體活力最強，菌體數(shù)量最多；在后發(fā)酵期，由于減酸達到最低點，有時會繼續(xù)產(chǎn)酸，最終PH值維持在一定水平直至發(fā)酵結(jié)束[陳駒聲.發(fā)酵法丙酮和丁醇生產(chǎn)技術(shù).北京化學工業(yè)出版社，1991]。丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵時間多數(shù)維持在48 72小時之間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用PH脅迫調(diào)控厭氧發(fā)酵丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)丁醇的方法，以縮短發(fā)酵時間，提高產(chǎn)量和生產(chǎn)強度。為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種厭氧發(fā)酵丙酮丁醇梭菌產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇三步驟，其特征在厭氧發(fā)酵步驟中，監(jiān)測發(fā)酵體系的OD值，當OD值小于2時，控制發(fā)酵體系的PH值為5. 5 ；當OD值大于等于2時，控制發(fā)酵體系PH值為4. 7 4.9。本發(fā)明所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的步驟中，pH值的控制方法是在發(fā)酵體系中放入PH電極測定發(fā)酵體系的pH值，通過添加NaOH溶液或HCl溶液控制pH值。其中，所述的NaOH溶液或HCl溶液的濃度為2 mol/L。其中，本發(fā)明所述的丙酮丁醇梭菌是CZo1SiriiZi腫acetobutylicum XY16 (CCTCC NO :M 2010011)，丙酮丁醇梭菌 C/osirii/i腫 acetobutylicum ASl. 134 (CGMCC 1. 134)，或者丙酮丁醇梭菌 ^Zo1SiriiZi腫 acetobutylicum ASl. 135 (CGMCC 1. 135)。本發(fā)明所述的菌種活化步驟是常規(guī)的丙酮丁醇梭菌所采用的菌種活化方法。在本發(fā)明中，是將菌種由凍存的甘油管中接入50 mL血清瓶的pH為6. O 7. O的含有淀粉的能提供碳源、氮源以及無機鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基中，通入隊或CO2,在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為30 40°C，活化培養(yǎng)12 M h，用于種子培養(yǎng)基接種和菌種保存。本發(fā)明所述的種子培養(yǎng)步驟是常規(guī)的丙酮丁醇梭菌所采用的種子培養(yǎng)方法。在本發(fā)明中，種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為PH 6. O 7. O的含有糖類的能提供碳源、氮源以及無機鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時將500 mL血清瓶中加入種子培養(yǎng)基100 400 mL,通入N2或CO2, 115 121°C滅菌15 30 min，冷卻后接入活化的種子液，培養(yǎng)溫度為30 40°C，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為8 16 h，用于發(fā)酵罐接種。本發(fā)明所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. 0 7. 0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基，5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為2 4 L ；且厭氧發(fā)酵的操作和發(fā)酵條件也是常規(guī)的利用丙酮丁醇梭菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法，在本發(fā)明中，接種量為體積比5% 10%，溫度為35 40°C，發(fā)酵罐通入隊或C02， 以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速在100 200 rpm，發(fā)酵時間為48 72 h。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明通過PH電極檢測發(fā)酵過程的pH值變化，加入濃NaOH和濃HC1，將體系的pH控制在最適值，達到丙酮丁醇的高效率生產(chǎn)，提高了丁醇以及總?cè)軇┑纳a(chǎn)強度，縮短了發(fā)酵時間；本發(fā)明采用PH電極測定丁醇發(fā)酵體系的pH值，并利用濃NaOH和濃HCl控制發(fā)酵體系的PH值，對于縮短發(fā)酵時間，提高分批和連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)強度都具有重要的理論意義和應用價值。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1
菌種丙酮丁醇梭菌 CZo1SiriiZi腫 acetobutylicum XY16 (CCTCC NO :M 2010011)。種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，乙酸銨 2 g/L, NaCl 2 g/L, MgSO4 3 g/L, KH2PO4 1 g/L, K2HPO4 1 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 1 g/L, pH 6. 0。發(fā)酵培養(yǎng)基(P2)碳源(葡萄糖60 g/L 分消)，K2HPO4 0. 5 g/L, KH2PO4 0. 5 g/L, CH3COONH4 2.2 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.2 g/L, MnSO4 ·Η20 0. 01 g/L, NaCl 0. 01 g/L，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 0.01 g/L;玉米漿 1 g/L。5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為3 L。將凍存的甘油管中的菌種接入50 mL血清瓶中30 mL的種子培養(yǎng)基中，通入N2，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37°C，活化培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，用無菌的移液槍將活化的菌種按5%的比例接入含有300 mL種子培養(yǎng)基的500 mL血清瓶中，擴大培養(yǎng)，12 h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(5 L發(fā)酵罐)，接種量為10% (ν/ v)，攪拌轉(zhuǎn)速在120 rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)。接種后通入N2，通氣量為0. 25 vvm, 10 min后停止通氣，關(guān)閉通氣口，保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境。將NaOH和HCl都配成2 mol/L的溶液，通過校準的PH電極測定發(fā)酵體系的pH值，控制發(fā)酵體系的pH值分別為4. 3,4. 5,4. 7,4. 9,5. 2、 5. 5、6. 0，當pH低于設(shè)定值時，采用2 mol/L的NaOH升高pH值，當pH高于設(shè)定值時，采用 2 mol/L的HCl降低pH值，并與不控制pH值的發(fā)酵結(jié)果對比，發(fā)酵至總?cè)軇┊a(chǎn)量不再變化。 結(jié)果如表1。 表1不同pH下發(fā)酵結(jié)果對比
菌體生長速率(h—1)丁醇(g/L)總?cè)軇?g/L)發(fā)酵結(jié)束時間(h)丁醇生產(chǎn)速率(g · L"1 · h"1)對照組0. 23111. 418. 1480. 284pH6. 00. 3492. 63. 1280. 093pH5. 50. 57. 311. 7440. 162pH5. 20. 35910. 415. 1400. 237pH4. 90. 27811. 519. 2360. 320pH4. 70. 27511. 519. 6440. 295pH4. 50. 2511. 418. 8400. 283pH4. 30. 16110. 415. 1400. 149
由表1中的實驗結(jié)果可看出，在不同的PH下，丁醇發(fā)酵的結(jié)果不一致，主要特點為， 在較高的pH (5. 2 6. 0)下，菌體生長快，發(fā)酵時間短，但丁醇產(chǎn)量不高；而在較低的pH (4. 3 4. 9)下，菌體生長慢，發(fā)酵時間延長，但丁醇產(chǎn)量高。這為pH脅迫調(diào)控提供了理論依據(jù)。實施例2
菌種丙酮丁醇梭菌 CZo1SiriiZi腫 acetobutylicum XY16 (CCTCC NO :M 2010011)。種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，乙酸銨 2 g/L, NaCl 2 g/L, MgSO4 3 g/L, KH2PO4 1 g/L, K2HPO4 1 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 1 g/L, pH6. 0。發(fā)酵培養(yǎng)基(P2)碳源(葡萄糖60g/L 分消)，K2HPO4 0. 5 g/L，KH2PO4 0. 5 g/L， CH3COONH4 2.2 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.2 g/L, MnSO4 ·Η20 0. 01 g/L, NaCl 0. 01 g/L，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 0.01 g/L;玉米漿 1 g/L。5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為3 L。將凍存的甘油管中的菌種接入50 mL血清瓶中30 mL的種子培養(yǎng)基中，通入N2，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37°C，活化培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，用無菌的移液槍將活化的菌種按5%的比例接入含有300 mL種子培養(yǎng)基的500 mL血清瓶中，擴大培養(yǎng)，12 h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(5L發(fā)酵罐)，接種量為10%(v/v)， 攪拌轉(zhuǎn)速在120 rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)。接種后通入N2，通氣量為0. 25 vvm, 10 min后停止通氣，關(guān)閉通氣口，保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境。將NaOH和HCl都配成2 mol/L的溶液，通過校準的 PH電極測定發(fā)酵體系的pH值，前8 h控制發(fā)酵體系的pH值為5. 5，當pH低于設(shè)定值時，采用2 mol/L的NaOH升高pH值，當pH高于設(shè)定值時，采用2 mol/L的HCl降低pH值；當OD 大約長到2后，迅速將發(fā)酵體系的pH值調(diào)到4. 9，并維持到發(fā)酵結(jié)束。結(jié)果如表2。表2 pH脅迫調(diào)控(5. 5-4. 9)與對照組的發(fā)酵結(jié)果對比從表2中的實驗結(jié)果看出，米用pH脅迫調(diào)控策略后，菌體的生長速率提高了 112%，發(fā)酵周期縮短了 33. 3%，丁醇生產(chǎn)速率提高了 28. 9%。. 實施例3
菌種丙酮丁醇梭菌 CZo1SiriiZi腫 acetobutylicum ASl. 135 (CGMCC 1. 135)。
權(quán)利要求
1.一種厭氧發(fā)酵丙酮丁醇梭菌產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇三步驟，其特征在厭氧發(fā)酵步驟中，監(jiān)測發(fā)酵體系的OD值，當OD值小于2時，控制發(fā)酵體系的PH值為5. 5 ；當OD值大于等于2時，控制發(fā)酵體系pH值為4. 7 4. 9。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的控制發(fā)酵體系pH值的方法是在發(fā)酵體系中放入PH電極測定發(fā)酵體系的pH值，通過添加NaOH溶液或HCl溶液控制pH值。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的NaOH溶液或HCl溶液的濃度為2 mol/L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的丙酮丁醇梭菌是C/^irii/i acetobutylicum XY16, MSTIIIt^ Clostridium acetobutylicum ASl. 134，或者丙麗丁 1Clostridium acetobutylicum ASl. 135。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種厭氧發(fā)酵丙酮丁醇梭菌產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇三步驟。本發(fā)明根據(jù)丙酮-丁醇梭菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇時pH變化的特性，在發(fā)酵體系中引入了pH脅迫調(diào)控，對丙酮-丁醇梭菌產(chǎn)酸期和產(chǎn)醇期的pH進行脅迫調(diào)控，當產(chǎn)酸期pH5.5，產(chǎn)醇期pH調(diào)節(jié)到4.7-4.9，相對于不調(diào)控pH的丁醇發(fā)酵，丁醇產(chǎn)量提高了20%，發(fā)酵周期縮短了33%，生產(chǎn)速率提高了28.9%，；此方法縮短了發(fā)酵周期、提高了產(chǎn)量、降低了成本，操作簡便，易應用于丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P7/16GK102162001SQ20111004742
公開日2011年8月24日 申請日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者吳昊, 奚永蘭, 姜岷, 孫佰軍, 李志鋼, 歐陽平凱, 郭亭, 陳可泉 申請人:南京工業(yè)大學