專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)與抗病毒感染性有關(guān)的基因oas1中的突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)人類(lèi)寡腺苷酸合成酶基因中的突變的方法及所編碼的蛋白質(zhì)及其抗體的用途，其中突變賦予對(duì)黃病毒感染(包括C型肝炎感染)的抗性，且突變與包括前列腺癌和糖尿病的其他病狀有關(guān)。
背景技術(shù)：
迄今為止已鑒別許多疾病，其中人類(lèi)群體中存在天然的感染抗性。Alter和 Moyer, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum Retrovirol. 18 ±曾干Ij 1 :S6_10(1998) 艮導(dǎo)在諸如注射藥物使用者的高危群組中的C型肝炎病毒感染(HCV)高達(dá)90%。然而，尚未有文獻(xiàn)確認(rèn)剩余的10%明顯對(duì)抗感染的機(jī)制為何。在HCV感染中起作用的蛋白質(zhì)包括2-端、 5-端寡腺苷酸合成酶。OAS是干擾素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，其特征為能催化2-端、5-端腺苷寡聚物 (2-5A)的合成。Hovanessian等人，EMBO 6:1273-1280(1987)發(fā)現(xiàn)經(jīng)干擾素治療的人類(lèi)細(xì)胞含有數(shù)種與40 (OASl)、46 (OASl)、69及IOOkD的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的OAS。Marie等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 160 :580-587(1989)產(chǎn)生高度特異性的抗 p69 (69_kD OAS)多克隆抗體。通過(guò)以抗P69抗體篩檢經(jīng)干擾素治療的人類(lèi)細(xì)胞表達(dá)文庫(kù)，Marie和Hovanessian， J. Biol. Chem. 267 :9933-9939 (1992)分離出部分0AS2 cDNA。他們以部分cDNA篩檢另外的文庫(kù)并回收編碼兩個(gè)0AS2同功異型物(isoform)的cDNA。較小的同功異型物由兩個(gè)3-端未轉(zhuǎn)譯區(qū)長(zhǎng)度不同的mRNA編碼。Northern印跡分析揭示0AS2表達(dá)為人類(lèi)細(xì)胞中四個(gè)由干擾素誘導(dǎo)的mRNA。所預(yù)測(cè)的0AS2蛋白質(zhì)具有共同的683-氨基酸序列及不同的3-端末端。根據(jù)活體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的SDS-PAGE，兩個(gè)同功異型物的分子質(zhì)量為69和71kD。兩個(gè)同功異型物在活體外均顯示出OAS活性。序列分析表明0AS2含有兩個(gè)由富含脯氨酸的假定連接子區(qū)所分隔的 OASl同源域。N末端及C末端域分別為41%和53%相同于OASl。通過(guò)熒光原位雜交和通過(guò)包含于定位克隆之內(nèi)，Hovanian等人，Genomics 52 267-277(1998)確定 0AS1、0AS2 和 0AS3 基因是由 12q24. 2 上的 130_kb 區(qū)叢集。2-5A 結(jié)合至降解病毒及細(xì)胞RNA的核糖核酸酶I并激活其，從而導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抑制和病毒復(fù)制的削弱。被稱(chēng)為OASL的第四種人類(lèi)OAS基因與0AS1、0AS2和0AS3的不同在于OASL缺乏酶活性。OASL基因編碼雙域蛋白質(zhì)，其是由融合至與泛素的串聯(lián)重復(fù)同源的164-氨基酸 C 末端域的 OAS 單元組成。(Eskildsen 等人，Nuc. Acids Res. 31 :3166-3173,2003 ；Kakuta 等人，J. Interferon & Cytokine Res. 22 :981-993,2002)由于其在抑制病毒復(fù)制和病毒感染中的作用，因此此項(xiàng)技術(shù)中需要抑制與OASl活性有關(guān)的病毒復(fù)制的方法和組合物，包括進(jìn)一步需要抑制HCV復(fù)制的基于抑制劑的療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及檢測(cè)與C型肝炎抗性有關(guān)的突變，所述突變的特征在于其為寡腺苷酸合成酶1基因中的點(diǎn)突變。在一實(shí)施例中，涵蓋一種人類(lèi)基因篩檢方法。所述方法包含對(duì)分離自人類(lèi)的核酸樣本分析寡腺苷酸合成酶ι基因點(diǎn)突變的存在，所述點(diǎn)突變的特征為在根據(jù)Genbank序列登記號(hào)第NT_009775. 13號(hào)(連續(xù)核苷酸2，130,000-2，157，999，其以SEQ ID NO: 19顯示于圖2 中)的寡腺苷酸合成酶 1 基因(OASl)的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、 2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523 或 2156638 核苷酸位置處的堿基取代或在2156595核苷酸位置處的堿基缺失。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述方法包含于擴(kuò)增條件下以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物對(duì)處理來(lái)自人類(lèi)的基因組DNA樣本，以擴(kuò)增含有寡腺苷酸合成酶1基因NT_009775. 13 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、 2139587、214似94、2144985、2156523、2156595 或 2156638 核苷酸位置的人類(lèi)基因組DNA 區(qū)。 PCR處理產(chǎn)生含有所述區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后分析其點(diǎn)突變的存在。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種由在NT_009775. 13的2135728、2135749、 2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、 2144985、2156523、2156595或2156638位置處具有至少一個(gè)突變的基因所編碼的蛋白質(zhì)， 和所述蛋白質(zhì)用以制備抗病毒感染、優(yōu)選為黃病毒感染、最優(yōu)選為C型肝炎感染用的診斷劑的用途。在特定實(shí)施例中，所述診斷劑為抗體。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或抑制病毒感染、優(yōu)選為黃病毒感染、最優(yōu)選為C型肝炎病毒感染的治療化合物，其中所述治療化合物為由在NT_009775. 13 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、 2139587、214似94、2144985、2156523、2156595 或 2156638 位置處具有至少一個(gè)突變的 OASl 基因所編碼的蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施例中，所述治療化合物為編碼蛋白質(zhì)的聚核苷酸，諸如 DNA 或 RNA。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或抑制病毒感染、優(yōu)選為黃病毒感染、 最優(yōu)選為C型肝炎病毒感染的治療化合物，其中所述治療化合物為具有以下序列的蛋白質(zhì)SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 25,SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQID NO 32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO 47 和 / 或 SEQ ID NO 48。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或抑制病毒感染、優(yōu)選為黃病毒感染、最優(yōu)選為C型肝炎病毒感染的治療化合物，其中所述治療化合物模擬在NT_009775. 13 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、 2139587、214似94、2144985、2156523、2156595或2156638位置處的至少一個(gè)突變的有利作用。所述治療化合物可為小分子、蛋白質(zhì)、肽、DNA或RNA分子或抗體。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療癌癥、優(yōu)選為前列腺癌的治療化合物，其中所述治療化合物為由在NT_009775. 13的2135728、2135749、2135978、 2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、 2156523、2156595或2156638位置處具有至少一個(gè)突變的OASl基因所編碼的蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施例中，所述治療化合物為編碼蛋白質(zhì)的聚核苷酸，諸如DNA或RNA。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療癌癥、優(yōu)選為前列腺癌的治療化合物，其中所述治療化合物為具有以下序列的蛋白質(zhì)SEQ ID NO :20,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22,SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQID NO :27、SEQ ID NO :28,SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ IDNO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :46, SEQ ID NO :47 和 / 或 SEQ ID NO :48。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療癌癥、優(yōu)選為前列腺癌的治療化合物，其中所述治療化合模擬在NT_009775. 13的21357沘、2135749、2135978、2144072、 2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、 2156595或2156638位置處的至少一個(gè)突變的有利作用。所述治療化合物可為小分子、蛋白質(zhì)、肽、DNA或RNA分子或抗體。在其他實(shí)施例中，所述治療化合物能夠抑制OASl或整個(gè)蛋白質(zhì)的至少一個(gè)子區(qū)或子功能的活性，且所述化合物的代表為能特異性結(jié)合至OASl聚核苷酸的反義分子、核酶和RNAi分子，以及能特異性結(jié)合至OASl蛋白質(zhì)和多肽的抗體及其片段。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供OASl的抑制劑。本發(fā)明的抑制劑包括(但不限于) 反義分子、核酶、RNAi、抗體或抗體片段、蛋白質(zhì)或多肽以及小分子。例示性反義分子包含 SEQ ID N0:19的至少10、15或20個(gè)連續(xù)核苷酸，或是在嚴(yán)格條件下雜交至SEQID NO 19 的聚核苷酸的反義分子。更優(yōu)選的是包含SEQ ID N0:19的至少25個(gè)連續(xù)核苷酸或在嚴(yán)格條件下雜交至SEQ ID NO 19的序列的反義分子。在另一實(shí)施例中，設(shè)想OASl的抑制劑特異性結(jié)合至由SEQ ID NO 30的多肽所界定的蛋白質(zhì)區(qū)。本發(fā)明的抑制劑包括(但不限于)抗體、抗體片段、小分子、蛋白質(zhì)或多肽。在另一實(shí)施例中，設(shè)想OASl的抑制劑包含特異性結(jié)合或雜交至SEQ ID NO 31的聚核苷酸的反義或RNAi分子。在另一實(shí)施例中，提供包含在醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中的一種或一種以上OASl 抑制劑的組合物。額外的實(shí)施例提供降低OASl基因表達(dá)或生物學(xué)活性的方法。額外的實(shí)施例提供特異性增加或降低在NT_009775. 13的2135728、2135749、 2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、 2144985、2156523、2156595或2156638位置處具有至少一個(gè)突變的OASl基因的某些形式的
表達(dá)的方法。本發(fā)明提供包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷間鍵合的反義寡核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供具有硫代磷酸酯鍵合的反義寡核苷酸。本發(fā)明又進(jìn)一步提供包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的糖部分的反義寡核苷酸。本發(fā)明也提供包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的糖部分的反義寡核苷酸，其中所述糖部分為 2' -0-甲基糖部分。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸堿基的反義寡核苷酸。本發(fā)明又進(jìn)一步提供具有經(jīng)修飾的核苷酸堿基的反義寡核苷酸，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸堿基為5-甲基胞嘧啶。本發(fā)明也提供一種反義化合物，其中所述反義化合物為嵌合寡核苷酸。本發(fā)明提供一種抑制人類(lèi)細(xì)胞或組織中人類(lèi)OASl的表達(dá)的方法，其包含使活體內(nèi)細(xì)胞或組織與靶向于編碼人類(lèi)OASl的核酸分子的長(zhǎng)度為8至35個(gè)核苷酸的反義化合物或核酶接觸，從而抑制人類(lèi)OASl的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種使用反義或RNAi化合物或核酶降低或增加活體內(nèi)OASl 的特定形式的表達(dá)的方法，所述形式是由在NT_009775. 13的2135728、2135749、2135978、 2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、 2156523,2156595或2156638位置處具有至少一個(gè)突變來(lái)界定。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包含使活體內(nèi)癌細(xì)胞與靶向于編碼人類(lèi)OASl的核酸分子的長(zhǎng)度為8至35個(gè)核苷酸的反義化合物或核酶接觸，從而抑制人類(lèi)OASl的表達(dá)。本發(fā)明又進(jìn)一步提供鑒別OASl聚核苷酸的目標(biāo)區(qū)。本發(fā)明也提供用于通過(guò)原位雜交鑒別OASl聚核苷酸的經(jīng)標(biāo)記的探針。本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的OASl抑制劑用以制備預(yù)防或抑制HCV感染用的藥劑的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供使OASl抑制劑針對(duì)OASl蛋白質(zhì)的特定區(qū)或所述蛋白質(zhì)的特定功能。本發(fā)明也提供一種用于抑制OASl表達(dá)的醫(yī)藥組合物，其包含本發(fā)明的反義寡核苷酸與生理學(xué)上可接受的載劑或稀釋劑的混合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供能特異性裂解OASl RNA的核酶和包含所述核酶的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明也提供OASl的小分子抑制劑，其中所述抑制劑能降低OASl的活性或能降低或阻礙OASl mRNA的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步提供除修飾2' -5'寡腺苷酸的合成外還修飾蛋白質(zhì)的特定功能的OASl抑制劑，所述功能包括與諸如C型肝炎病毒NS5A蛋白的其他蛋白質(zhì)的相互作用。本發(fā)明進(jìn)一步提供改變包括(但不限于)糖基化和磷酸化作用的OASl轉(zhuǎn)譯后修飾的化合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于鑒別寡腺苷酸合成酶基因突變的人類(lèi)基因篩檢方法，其包含(a)于擴(kuò)增條件下以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物對(duì)處理來(lái)自人類(lèi)的基因組DNA 樣本，以擴(kuò)增含有寡腺苷酸合成酶基因的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、 2144116,2144321,2131025,2133961,2139587,2144294,2144985,2156523,2156595 或 2156638核苷酸位置的人類(lèi)基因組DNA區(qū)，所述處理產(chǎn)生含有所述區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物；及(b) 檢測(cè)步驟(a)的擴(kuò)增產(chǎn)物中在 21357沘、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、 2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595 或 2156638 核苷酸位置處的核苷酸點(diǎn)突變的存在，從而鑒別所述突變。在此方法的某些實(shí)施例中，所述區(qū)包含以選自由SEQ ID N0:l_7及SEQ IDNO 57-64組成的群組的序列所代表的核苷酸序列。在其他實(shí)施例中，所述區(qū)基本上由選自由 SEQ ID NO :1-7及SEQ ID NO :57-64組成的群組的核苷酸序列組成。本發(fā)明也提供一種檢測(cè)方法，其中所述檢測(cè)包含在雜交條件下以對(duì)點(diǎn)突變特異的寡核苷酸探針處理以上步驟 (a)的擴(kuò)增產(chǎn)物，并檢測(cè)雜交產(chǎn)物的形成。在所述方法的某些實(shí)施例中，寡核苷酸探針包含選自由SEQ ID NO :12-18組成的群組的核苷酸序列。本發(fā)明也涉及在人類(lèi)中檢測(cè)含有點(diǎn)突變的C型肝炎感染抗性疾病等位基因的方法，所述點(diǎn)突變包含在寡腺苷酸合成酶基因(OASl)的2135728、2135749、2135978、 2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、 2156523,2156595或2156638核苷酸位置處以非野生型核苷酸取代野生型核苷酸，所述方法包含(a)通過(guò)將來(lái)自所述人類(lèi)的基因組DNA樣本與選自由SEQ ID NO :8及9和SEQ ID NO :10及11組成的群組的寡腺苷酸合成酶基因特異性PCR引物對(duì)在PCR緩沖液中組合而形成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合物；(b)使PCR混合物經(jīng)受多個(gè)PCR熱循環(huán)以產(chǎn)生寡腺苷酸合成酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物；和(c)在雜交條件下以選自由SEQ ID NO :12-18組成的群組的探針處理步驟(b)中所產(chǎn)生的產(chǎn)物，從而檢測(cè)所述突變。本發(fā)明也提供一種經(jīng)分離的OASl抑制劑，其是選自由下列各物組成的群組反義寡核苷酸、核酶、抑制性小RNA(RNAi)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體和小分子。所述經(jīng)分離的抑制劑可為包含至少15個(gè)SEQ ID NO :19序列的連續(xù)核酸的反義分子或其互補(bǔ)序列。在其他實(shí)施例中，所述經(jīng)分離的OASl抑制劑(反義分子或其互補(bǔ)序列)在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 19的序列雜交。所述經(jīng)分離的OASl抑制劑可選自由抗體和抗體片段組成的群組。本發(fā)明也提供一種組合物，其包含在醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中的治療有效量的至少一種OASl抑制劑。本發(fā)明也涉及一種抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中OASl表達(dá)的方法，其包含向所述細(xì)胞投與選自由下列各物組成的群組的OASl抑制劑反義寡核苷酸、核酶、蛋白質(zhì)、RNAi、多肽、抗體和小分子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種抑制受檢者中OASl基因表達(dá)的方法，其包含向所述受檢者投與在醫(yī)藥學(xué)上有效的媒劑中的反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的量可有效地與衍生自所述OASl基因的經(jīng)選定目標(biāo)核酸序列的全部或部分特異性雜交。本發(fā)明又進(jìn)一步涉及一種預(yù)防易受感染的人類(lèi)受檢者中黃病毒感染的方法，其包含向所述人類(lèi)受檢者投與選自由下列各物組成的群組的OASl抑制劑反義寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白質(zhì)、多肽、抗體和小分子，其中所述OASl抑制劑預(yù)防所述黃病毒的感染。本發(fā)明又進(jìn)一步涉及一種預(yù)防或治愈易受感染的人類(lèi)受檢者中黃病毒或其他病毒感染的方法，其包含向所述人類(lèi)受檢者投與選自由下列各物組成的群組的OASl抑制劑 反義寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白質(zhì)、多肽、抗體和小分子，其中所述OASl抑制劑預(yù)防所述黃病毒或其他病毒感染且其中所述OASl抑制劑針對(duì)一種或一種以上由在NT_009775. 13 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、 2139587、214似94、2144985、2156523、2156595或2156638位置處的突變所界定的蛋白質(zhì)的特定形式。本發(fā)明也進(jìn)一步涉及一種通過(guò)投與具有下列序列的多肽中的一者來(lái)預(yù)防或治愈易受感染的人類(lèi)受檢者中黃病毒或任何其他病毒感染的方法SEQ ID NO :20, SEQ ID NO 21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ED NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO 27,SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQID NO 34、SEQ IDNO :35、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO 47 和 / 或 SEQ ID NO :48。本發(fā)明也涉及人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染的治療。本發(fā)明又進(jìn)一步涉及一種預(yù)防人類(lèi)受檢者中的胰島素依賴(lài)型糖尿病(IDDM)的方法，其包含向所述人類(lèi)受檢者投與選自由下列各物組成的群組的OASl抑制劑反義寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白質(zhì)、多肽、抗體和小分子，其中所述OASl抑制劑預(yù)防IDDM。本發(fā)明又進(jìn)一步涉及一種預(yù)防人類(lèi)受檢者中的IDDM的方法，其包含向所述人類(lèi)受檢者投與選自由下列各物組成的群組的OASl抑制劑反義寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白質(zhì)、多肽、抗體和小分子，其中所述OASl抑制劑預(yù)防IDDM且其中所述OASl抑制劑針對(duì)一種或一種以上由在 NT_009775. 13 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、 2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595 或 2156638 位置處的突變所界定的蛋白質(zhì)的特定形式。本發(fā)明又進(jìn)一步涉及一種通過(guò)增加OASl基因表達(dá)或通過(guò)治療性投與本文中所揭示的多肽來(lái)治療癌癥(諸如前列腺癌)的方法。本發(fā)明也提供一種抑制活體外細(xì)胞中OASl目標(biāo)基因表達(dá)的方法，其包含將足以抑制OASl目標(biāo)基因表達(dá)的量的核糖核酸(RNA)引入細(xì)胞中，其中所述RNA為雙股分子，第一股基本上由與OASl目標(biāo)基因的核苷酸序列對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列組成，且第二股基本上由與OASl目標(biāo)基因的核苷酸序列互補(bǔ)的核糖核苷酸序列組成，其中第一與第二核糖核苷酸股為互相雜交而形成所述雙股分子的獨(dú)立互補(bǔ)股，且所述雙股分子抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。在所述方法的某些實(shí)施例中，第一核糖核苷酸序列包含至少20個(gè)與OASl目標(biāo)基因?qū)?yīng)的堿基且第二核糖核苷酸序列包含至少20個(gè)與OASl目標(biāo)基因的核苷酸序列互補(bǔ)的堿基。在其他實(shí)施例中，目標(biāo)基因表達(dá)被抑制至少10%。在所述方法的其他實(shí)施例中，雙股核糖核酸結(jié)構(gòu)為長(zhǎng)度至少20個(gè)堿基且每一核
糖核酸鏈都能特異性地與超過(guò)所述至少20個(gè)堿基的OASl目標(biāo)基因的脫氧核糖核酸鏈雜 、-父。本發(fā)明提供能恢復(fù)可能由于基因突變而減弱或失去的OASl功能的多肽或蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，所述多肽或蛋白質(zhì)具有由包含SEQ ID NO :19的基因所編碼的野生型 OASl的氨基酸序列。在其他實(shí)施例中，其中OASl基因中的突變賦予OASl蛋白增加的活性、 穩(wěn)定性和/或半衰期或其他使OASl蛋白更適合于抗病毒活性的變化，由經(jīng)突變的OASl基因所編碼的蛋白質(zhì)或多肽是優(yōu)選的。任何上述蛋白質(zhì)和多肽均可作為治療組合物的組份來(lái)提供。本發(fā)明也提供由以下各序列組成的蛋白質(zhì)中的任一者作為治療組合物的組份的用途SEQ ID NO 20,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25, SEQ ID UNO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33,SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35,SEQ ID NO 46、SEQ IDNO :47 禾口 / 或 SEQ ID NO: 48。在另一實(shí)施例中，編碼OASl蛋白、OASl突變型蛋白或OASl多肽的核酸可以基因療法形式來(lái)投與。
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圖1是顯示OASl基因中本發(fā)明突變的位置、等位基因變異體(堿基取代)、基因組序列上突變的座標(biāo)和(若有的話(huà))NCBI dbSNP ID的表。圖 2 (SEQ ID NO 19)是由在 NCBI 登記號(hào) NT_009775. 13 的 2，130，000-2，157，999 位置處的連續(xù)核苷酸堿基組成的聚核苷酸序列OASl。圖 3 顯示 SEQ ID NO 20-64。圖4顯示高加索群體中OASl基因內(nèi)的大致單倍體分布。圖5A及B闡明本發(fā)明所揭示的轉(zhuǎn)錄物變異體的種類(lèi)及其與本發(fā)明所揭示的突變的關(guān)系。圖5A顯示轉(zhuǎn)錄物變異體(TV)形式1-6，且圖5B顯示TV形式7-10。圖5C進(jìn)一步闡明黑猩猩和大猩猩變異體相對(duì)于人類(lèi)的推測(cè)結(jié)構(gòu)。圖6是描述非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)相對(duì)于人類(lèi)的OASl基因的突變和在對(duì)應(yīng)人類(lèi)基因組序列上的突變座標(biāo)的表。圖7表明本發(fā)明的例示性多肽當(dāng)自大腸桿菌表達(dá)和回收時(shí)的酶活性。圖8表明由本發(fā)明的聚核苷酸產(chǎn)生的例示性多肽于HeLa細(xì)胞中表達(dá)時(shí)的酶活性。圖9表明本發(fā)明的例示性多肽的抗體的顯影。圖10是詳述例示性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽的表。
具體實(shí)施例方式引言和定義本發(fā)明涉及寡腺苷酸合成酶基因的新穎突變、所述突變用于診斷對(duì)病毒感染的易感性或抗性的用途、由具有根據(jù)本發(fā)明的突變的基因所編碼的蛋白質(zhì)和使用所述蛋白質(zhì)、 抗體及相關(guān)核酸預(yù)防或抑制病毒感染。所述突變與攜帶者對(duì)黃病毒感染、尤其是C型肝炎病毒感染的抗性有關(guān)。許多當(dāng)前的醫(yī)學(xué)研究集中于鑒別引起或有助于疾病的突變和缺陷。設(shè)計(jì)所述研究以導(dǎo)致針對(duì)病狀來(lái)治療的化合物和方法。對(duì)于盡管暴露于感染劑及其他危險(xiǎn)因素下但仍然使人們保持健康的基因影響的研究則較少關(guān)注。本發(fā)明表示由發(fā)明者所研制的方法的成功應(yīng)用，由此確定并分析人類(lèi)受檢者的特定群體以便揭示賦予對(duì)疾病的抗性的基因變異或突變。對(duì)具有對(duì)特定疾病或生物學(xué)病癥的天然抗性的亞群體部分的鑒別使得能進(jìn)一步鑒別對(duì)于藥物介入、診斷評(píng)估或預(yù)防(諸如預(yù)防性接種)為適合目標(biāo)的基因和蛋白質(zhì)。本文中所鑒別的亞群體部分包含盡管反復(fù)暴露于C型肝炎病毒(HCV)下但是仍保持血清陰性而同類(lèi)者已受感染(血清陽(yáng)性)的個(gè)體。所研究的群體包括經(jīng)受反復(fù)輸血的血友病患者，和通過(guò)共用的針及其他危險(xiǎn)因素而暴露的靜脈內(nèi)藥物使用者。HCV感染包括一組共同作用以達(dá)成一定感染水平的復(fù)雜蛋白質(zhì)和免疫系統(tǒng)組份， 當(dāng)所述感染水平引起疾病時(shí)，其可于受感染細(xì)胞內(nèi)發(fā)展成病毒的低穩(wěn)態(tài)，從而顯然允許 HCV逃離宿主免疫監(jiān)視系統(tǒng)，同時(shí)促成病毒持久感染(Dansako等人，Virus Research97 17-30,2003)。本發(fā)明集中于這個(gè)系統(tǒng)中的一種組份，即可由干擾素誘導(dǎo)的2' -5'-寡腺苷酸合成酶基因，尤其是OASl。OASl基因通過(guò)激活核糖核酸酶L (RNase L)以裂解病毒RNA 而于人類(lèi)宿主細(xì)胞的抗病毒活性方面起主要作用。HCV RNA激活2' -5' -OAS/RNaseL途徑。如Dansako等人所指出，HCV RNA激活導(dǎo)致病毒RNA裂解的途徑可看似矛盾。然而，所述活性可用來(lái)保持宿主免疫防御與可殺死宿主的感染水平之間的平衡。鑒于OASl基因的這種復(fù)雜作用，本發(fā)明已確定OASl基因中的突變與所述突變的攜帶者中抗HCV感染性之間的強(qiáng)相關(guān)性具有顯著重要性。現(xiàn)在所述個(gè)體的存在可允許闡明盡管反復(fù)暴露于感染水平的病毒下但是OASl仍如何有助于對(duì)HCV感染產(chǎn)生抗性。這個(gè)信息隨后將導(dǎo)致開(kāi)發(fā)用于在缺少天然抗性的個(gè)體中復(fù)制抗性機(jī)制的方法和組合物。因此，本發(fā)明提供本文中所鑒別的突變無(wú)論機(jī)制為何均適用于鑒別抗HCV感染的個(gè)體?？剐钥赏ㄟ^(guò)OASl蛋白的功能喪失來(lái)產(chǎn)生，在此情況下預(yù)測(cè)HCV病毒含量將足夠高以阻止病毒自宿主免疫監(jiān)視系統(tǒng)逃離，從而有利于病毒的破壞?？剐砸部赏ㄟ^(guò)功能的獲得而產(chǎn)生，因?yàn)镺ASl蛋白含量增加，蛋白質(zhì)半衰期增加和/或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)其激活核糖核酸酶L裂解病毒RNA的能力的方式受影響?？剐砸部赏ㄟ^(guò)對(duì)OASl蛋白的修飾而產(chǎn)生，所述修飾阻止HCV病毒蛋白或核苷酸對(duì)正常OASl蛋白功能的抑制?？剐砸部赏ㄟ^(guò)對(duì)OASl蛋白的修飾而產(chǎn)生，所述修飾阻止蛋白與正常HCV病毒壽命所必需的HCV病毒蛋白或核苷酸之間的相互作用。本發(fā)明不受限于一種機(jī)制。此外，盡管本文中揭示幾種不同的點(diǎn)突變，然而這并非想要表明每一突變對(duì)于OASl蛋白結(jié)構(gòu)或功能均具有相同的作用。OASl在由HCV為其中一員的黃病毒家族的其他病毒引起的感染方面起作用。黃病毒家族也包括引起黃熱病、登革熱、圣路易斯腦炎(St. Louis enc印halitis)、日本腦炎 (Japanese encephalitis)和本文中所揭示的其他病毒疾病的病毒。宿主對(duì)于這些病毒的防御包括可由病毒誘導(dǎo)的干擾素。所述干擾素誘導(dǎo)2' -5'-寡腺苷酸合成酶，如上所討論所述合成酶涉及于RNaseL的活化作用中。RNaseL接著裂解病毒RNA。其他病毒感染可通過(guò)本文中所揭示的方法得以預(yù)防和/或抑制，包括RSV。關(guān)于詳細(xì)描述和優(yōu)選實(shí)施例，使用下列定義A 腺嘌呤；C 胞嘧啶；G 鳥(niǎo)嘌呤；T 胸腺嘧啶(DNA中)；和U 尿嘧啶(RNA中)等位基因特定基因的DNA序列的變異體。二倍體細(xì)胞中最多將存在兩個(gè)等位基因，其各自位于染色體組的同源染色體的相同的相對(duì)位置或基因座上。當(dāng)位于任一基因座上的等位基因相同時(shí)，認(rèn)為就那個(gè)基因座而言個(gè)體是純合的，而當(dāng)其不同時(shí)，認(rèn)為就那個(gè)基因座而言個(gè)體是雜合的。因?yàn)槿我换虻牟煌任换蚩赡軆H有單個(gè)堿基改變，所以任一基因的等位基因的可能數(shù)目十分巨大。當(dāng)?shù)任换虿煌瑫r(shí)，一個(gè)相對(duì)于另一個(gè)是顯性而另一個(gè)則被認(rèn)為是隱性的。顯性是表現(xiàn)型的性質(zhì)且并不意味隱性等位基因由顯性基因?qū)е率Щ?。在許多實(shí)例中，正常發(fā)揮功能(野生型)的等位基因?qū)τ谒谢蚨嗷蛏偃毕莨δ艿耐蛔冃偷任换蚓曙@性。在所述情況下，一般的解釋是兩個(gè)功能等位基因中的一個(gè)足以產(chǎn)生足夠活性的基因產(chǎn)物以支持有機(jī)體的正常發(fā)育(即基因產(chǎn)物的數(shù)量通常存在2倍安全限度)。單倍體許多可能的多個(gè)等位基因中的一者，其通過(guò)染色體定位而連續(xù)排列，且呈現(xiàn)由染色體組的一個(gè)特定同源染色體所攜帶的等位基因組。核苷酸DNA或RNA的單體單元，由糖部分(戊糖)、磷酸酯和含氮雜環(huán)堿基組成。 堿基與糖部分經(jīng)由糖苷碳(戊糖的1'碳)連接，且堿基與糖的所述組合為核苷。當(dāng)核苷含有鍵結(jié)于戊糖的3'或5'位置的磷酸酯基團(tuán)時(shí)，稱(chēng)其為核苷酸?？山?jīng)由操作連接的核苷酸的序列于本文中通常稱(chēng)為“堿基序列”或“核苷酸序列”及其合乎文法的等效物，且本文中由自左至右方向?yàn)?'-末端至3'-末端的常規(guī)定向的式來(lái)表示。
堿基對(duì)(bp)雙股DNA分子中腺嘌呤㈧與胸腺嘧啶⑴的配對(duì)或胞嘧啶(C)與鳥(niǎo)嘌呤(G)的配對(duì)。在RNA中，以尿嘧啶⑶替代胸腺嘧啶。當(dāng)本文中提及RNA時(shí)，可互換使用符號(hào)T與U來(lái)表示處于RNA分子中的特定位置的尿嘧啶。核酸單股或雙股的核苷酸聚合物。聚核苷酸單股或雙股核苷酸的聚合物。本文中所用的“聚核苷酸”及其合乎文法的等效物包括全部范圍的核酸。聚核苷酸通常意指包含兩種或兩種以上脫氧核糖核苷酸和 /或核糖核苷酸的直鏈的核酸分子。如此項(xiàng)技術(shù)中所熟知的，精確尺寸將取決于許多因素， 而這些因素又取決于最終使用條件。本發(fā)明的聚核苷酸包括引物、探針、RNA/DNA節(jié)段、寡核苷酸(相對(duì)短的聚核苷酸)、基因、載體、質(zhì)粒等等。RNAi =RNA干擾(RNAi)是一種藉以將干擾性小RNA (siRNA)(通常約21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙螺旋)引入細(xì)胞內(nèi)，最終導(dǎo)致含有相同或互補(bǔ)序列的目標(biāo)基因的信使RNA降解并有效地使其沉默的方法?；蚱浜塑账嵝蛄芯幋aRNA或多肽的核酸?；蚩蔀镽NA或DNA。雙螺旋DNA 雙股核酸分子，其包含兩股由一個(gè)或一個(gè)以上存在于雙螺旋堿基對(duì)中的每一互補(bǔ)堿基之間的氫鍵保持在一起的實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的聚核苷酸。由于形成堿基對(duì)的核苷酸可為核糖核苷酸堿基或脫氧核糖核苷酸堿基，因此短語(yǔ)“雙螺旋DNA”意指包含兩股 DNA (ds DNA)的DNA-DNA雙螺旋，或包含一股DNA和一股RNA的RNA-DNA雙螺旋?；パa(bǔ)堿基當(dāng)DNA或RNA采用雙股構(gòu)型時(shí)正常配對(duì)的核苷酸?；パa(bǔ)核苷酸序列DNA或RNA的單股分子中的核苷酸序列，其與另一單股上的核苷酸序列充分互補(bǔ)，從而以所產(chǎn)生的氫鍵與其特異性地雜交。保守若核苷酸序列與預(yù)選(參考)序列的精確互補(bǔ)序列非隨機(jī)雜交，則所述核苷酸序列對(duì)所述預(yù)選序列保守。雜交通過(guò)互補(bǔ)堿基對(duì)之間建立氫鍵的使實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的核苷酸序列(核酸鏈)配對(duì)以形成雙螺旋或異源雙螺旋。其為兩條互補(bǔ)聚核苷酸之間可競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特異性(即非隨機(jī)的)相互作用。核苷酸類(lèi)似物結(jié)構(gòu)上與A、T、G、C或U不同但足夠類(lèi)似以取代核酸分子中的正常核苷酸的嘌呤或嘧啶核苷酸。DNA同源體具有預(yù)選保守核苷酸序列和編碼能結(jié)合預(yù)選配位體的受體的序列的核酸。上游在與DNA轉(zhuǎn)錄方向相反的方向上，且因此在非編碼鏈上為自5'至3'行進(jìn)， 或在mRNA上為自3'至5'行進(jìn)。下游進(jìn)一步在序列轉(zhuǎn)錄或讀取的方向上沿著DNA序列，其沿DNA非編碼鏈的3' 至5'方向行進(jìn)，或沿RNA轉(zhuǎn)錄物的5'至3'方向行進(jìn)。終止密碼子不編碼氨基酸而是導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成終止的三個(gè)密碼子中的任一者。 它們是UAG、UAA及UGA且也稱(chēng)為無(wú)義或終止密碼子。閱讀框轉(zhuǎn)譯中使用的鄰近核苷酸三聯(lián)體(密碼子)的特定序列。閱讀框取決于轉(zhuǎn)譯起始密碼子的位置。內(nèi)含子也稱(chēng)為插入序列，其為最初復(fù)制入RNA但由最終RNA轉(zhuǎn)錄物切除的DNA非編碼序列。
本發(fā)明的實(shí)施模式本發(fā)明提供一種用于篩檢人類(lèi)中與對(duì)黃病毒感染、尤其是C型肝炎感染的抗性有關(guān)的寡腺苷酸合成酶等位基因的新穎方法。本發(fā)明是基于所述抗性與寡腺苷酸合成酶基因DNA序列中在編碼人類(lèi)OASl基因的Genbank登記號(hào)NT_009775. 13 (SEQ ID NO :19) 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、 2139587、214似94、2144985、2156523、2156595或2156638核苷酸位置處的點(diǎn)突變(堿基取代)有關(guān)的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明揭示鑒別對(duì)C型肝炎病毒(HCV)感染具有抗性或部分抗性的受檢者群體和進(jìn)一步鑒別賦予這種有益作用的基因突變的研究結(jié)果。鑒別2' -5'-寡腺苷酸合成酶基因中的幾種基因突變，其與對(duì)HCV感染的抗性顯著相關(guān)。所使用的研究設(shè)計(jì)為病例-對(duì)照型等位基因關(guān)聯(lián)分析。指定為受檢者的病例已經(jīng)連續(xù)證實(shí)或推測(cè)暴露于HCV，但由于發(fā)展對(duì)病毒的抗體而經(jīng)證實(shí)并未發(fā)展感染(即HCV血清陰性)。對(duì)照受檢者為連續(xù)暴露且血清轉(zhuǎn)變?yōu)镠CV陽(yáng)性的受檢者。病例和對(duì)照受檢者募集自三種群體來(lái)自加拿大不列顛哥倫比亞省的范庫(kù)弗峰(Vancouver)的血友病患者；來(lái)自法國(guó)西北部的血友病患者；和來(lái)自西雅圖 (Seattle)大都會(huì)地區(qū)的注射藥物使用者。病例和對(duì)照的定義在血友病組與注射藥物使用者(IDU)組之間不同且是基于文獻(xiàn)中所發(fā)表的感染風(fēng)險(xiǎn)的流行病學(xué)模型和如本文中所述由發(fā)明者提出的其他模型。對(duì)于血友病群體，使用商業(yè)診斷實(shí)驗(yàn)室測(cè)試證實(shí)對(duì)照受檢者對(duì)于HCV抗體呈血清陽(yáng)性。證實(shí)病例受檢者為HCV血清陰性、具有低于5%的正常凝血因子且于1987年1月前已經(jīng)接收濃縮凝血因子。將對(duì)照注射藥物使用者定義為經(jīng)證實(shí)的HCV血清陽(yáng)性。將病例注射藥物使用者定義為經(jīng)證實(shí)的HCV血清陰性，其注射藥物超過(guò)10年以上，且據(jù)報(bào)導(dǎo)其參與一種或一種以上額外的危險(xiǎn)行為。額外的危險(xiǎn)行為包括與另一名IDU共用注射器、蒸煮鍋或棉球。在一特定高加索(Caucasian)群體中有20名病例和42名對(duì)照包括于本研究中。病例和對(duì)照受檢者的選擇基本上如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案09/707，576中所述使用受感染的有風(fēng)險(xiǎn)(“對(duì)照”)和未受感染的有風(fēng)險(xiǎn)(“病例”)群體群組進(jìn)行。鑒別與HCV感染抗性有關(guān)的基因突變的本發(fā)明方法包括選擇候選基因。調(diào)查約 50種在病毒結(jié)合至細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)病毒繁殖、干擾素反應(yīng)和先天免疫系統(tǒng)方面和抗病毒反應(yīng)中所涉及的候選基因。通過(guò)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以擴(kuò)增來(lái)自每一受檢者的基因組 DNA的目標(biāo)序列而在病例和對(duì)照中為候選基因測(cè)序。使用基于熒光的自動(dòng)化DNA測(cè)序法和 ABI3730自動(dòng)化測(cè)序儀來(lái)直接測(cè)序來(lái)自候選基因的PCR產(chǎn)物。鑒別寡腺苷酸合成酶基因(OASl)中的基因突變，其單獨(dú)或以聯(lián)合形式與HCV感染抗性顯著相關(guān)(P < 0. 05)。圖1中顯示構(gòu)成這些突變的堿基取代和缺失。OASl基因的變異形式(“0AS1R”)是因本發(fā)明突變中的一種或一種以上的存在而產(chǎn)生(確定為SEQID NO 1-7和SEQ ID NO :57-64)。據(jù)信OASl基因的這些變異OASlR形式賦予抗病毒感染性。自通過(guò)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的期望最大化(Expectation Maximation)方法建立的病例-對(duì)照基因型數(shù)據(jù)計(jì)算推測(cè)包含多個(gè)OASl突變(SEQ ID NO :1_7和SEQ IDNO 57-64)的群體和受檢者親本單倍體(Excoffier 和 Slatkin, Mol. Biol. Evol. 12 :921-927, 1995)。本發(fā)明涵蓋使用用于單倍體分析的全部范圍的OASl突變以及使用出于計(jì)算便利的 OASl突變的子集。對(duì)單倍體和單倍體子集的分離樣式與病例和對(duì)照組的比較分析鑒別關(guān)于病毒抗性或易感性的特定功效的突變。在一說(shuō)明性實(shí)例中，計(jì)算包含多個(gè)由SEQ ID NO :2至SEQ ID NO :6確定的OASl 突變的單倍體。通過(guò)此分析鑒別高加索人病例和對(duì)照群體中的數(shù)個(gè)單倍體。圖4中顯示這些單倍體的定義。確定兩種常見(jiàn)單倍體(確定為HAPl和HAP2)，其占所推測(cè)的單倍體約 85%且處于哈迪-韋伯格(Hardy-Weinberg)平衡中，所述平衡尤其是關(guān)于群體中單倍體純合子的出現(xiàn)。各種人類(lèi)群體和靈長(zhǎng)類(lèi)中的OASl的進(jìn)一步分析表明HAP2是遺傳的靈長(zhǎng)類(lèi)單倍體，其預(yù)先表明舊世紀(jì)猴與原始人類(lèi)的趨異。一種額外的單倍體(確定為HAP； )與這一特定群體中的持久HCV-抗性病例組有關(guān)。因此攜帶HAP3單倍體的受檢者處于對(duì)HCV感染的實(shí)質(zhì)上較低風(fēng)險(xiǎn)中。HAP3單倍體似乎是經(jīng)由一系列源自遺傳單倍體的復(fù)雜重組和突變而出現(xiàn)。與單倍體HAP3高發(fā)生率相結(jié)合的所述事件的結(jié)合少見(jiàn)性表明作出在群體中發(fā)展和保持單倍體HAP3的積極選擇，其可能隨時(shí)間推移作為對(duì)復(fù)發(fā)病毒攻毒的反應(yīng)。在這個(gè)實(shí)例中，單倍體HAP3是以可評(píng)估的群體頻率發(fā)生的僅有單倍體，其將單一前體RNA中的突變 SEQ ID NO 2的G核苷酸的作用與突變SEQ ID NO 4的A核苷酸的作用相結(jié)合。本發(fā)明不受限于上述說(shuō)明性實(shí)例。本發(fā)明也不受限于提供對(duì)特定OASl突變的相關(guān)性和效用的了解的其他說(shuō)明性實(shí)例。在另一說(shuō)明性實(shí)例中，SEQ ID NO :2中G核苷酸取代A核苷酸引起所預(yù)測(cè)的絲氨酸對(duì)甘氨酸的氨基酸取代。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算預(yù)測(cè)高度表明絲氨酸是磷酸化作用位點(diǎn)而甘氨酸不會(huì)經(jīng)磷酸化。在另一說(shuō)明性實(shí)例中，突變SEQ ID NO :4中的A核苷酸取代G核苷酸發(fā)生于OASl 中的野生型第六外顯子的一致剪接受體位點(diǎn)。此取代替代剪接受體辨別信號(hào)中所必需的G， 但在這個(gè)過(guò)程中創(chuàng)造新的剪接識(shí)別位點(diǎn)，即一個(gè)下游堿基對(duì)。因此經(jīng)突變形式于轉(zhuǎn)譯蛋白中創(chuàng)造移碼。經(jīng)突變位點(diǎn)也為較少有效的剪接信號(hào)，且因而促進(jìn)除移碼外顯子6剪接之外的前體RNA的額外替代性剪接。圖5A和5B中提供這些替代性剪接形式的優(yōu)選實(shí)施例。以下提供基因分析的其他說(shuō)明性實(shí)例。OASl轉(zhuǎn)錄物變異體的混亂剪接通過(guò)來(lái)源于自新鮮人血清分離而得的淋巴細(xì)胞系和周邊血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)的RNA的逆轉(zhuǎn)錄而獨(dú)立地確定。對(duì)來(lái)自攜帶各種單倍體的細(xì)胞系和PBMC的逆轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物的PCR分析表明攜帶突變SEQ ID NO :4的A核苷酸的RNA 形式導(dǎo)致眾多轉(zhuǎn)錄物變異體OASlR形式。這些OASlR轉(zhuǎn)錄物變異體于圖5A及5B中圖示描述且包含如圖3中所提供的SEQ ID NO 36至SEQ ID NO :47。據(jù)信OASl基因的這些變異OASlR形式和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物變異體編碼由SEQ IDNO 20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 32、SEQ IDNO 35、SEQ ID N0:46和/或SEQ ID NO :47組成的多肽中的一種或一種以上。單個(gè)或多個(gè)上述多肽于本文中可互換地稱(chēng)作OASlR多肽或OASlR蛋白。許多上述多肽的共同特征在于其主要在其羧基末端不同而保留氨基末端部分。除其自身替代性轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生之外，基因的OASlR形式也可含有或除去特定序列背景(諸如外顯子剪接增強(qiáng)子)，其改變對(duì)于特定轉(zhuǎn)錄物變異體的選擇性?xún)?yōu)選。此舉又引起大量所得蛋白質(zhì)的相對(duì)含量不同。OASl基因的這些變異OASlR形式也可改變所得蛋白質(zhì)的定位或轉(zhuǎn)譯后修飾。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解特定OASl蛋白形式的豐度增加或其他改良其活性、穩(wěn)定性或可用性的修飾可改良2' -5' -OAS/RNase L途徑的總體抗病毒性能。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員同樣可了解在特定OASl形式與其他特定OASl形式相比并不有利或甚至不利的情況下，抑制所述特定蛋白的活性或可用性也可改良2' -5' -OAS/RNaseL途徑的總體抗病毒性能。不利的OASl蛋白的一實(shí)施例為(非局限于)以消除所述特定OASl蛋白的酶活性的方式由病毒蛋白特異性靶向的蛋白。非有利的OASl蛋白的另一實(shí)施例為具有與其他活性形式聚合的較低酶活性因此降低或消除聚合蛋白的總酶活性(且因而降低總體抗病毒效果)的蛋白。上述機(jī)制中的一種或一種以上可有助于對(duì)病毒感染產(chǎn)生抗性。然而，本發(fā)明不受限于所揭示的變異聚核苷酸或多肽的特定作用機(jī)制。因此，本發(fā)明提供人類(lèi)2' -5'-寡腺苷酸合成酶基因的新穎形式、新穎mRNA轉(zhuǎn)錄物和相關(guān)蛋白質(zhì)。本發(fā)明也揭示新穎mRNA轉(zhuǎn)錄物和新穎蛋白質(zhì)的效用。這些新穎形式的特征在于基因中存在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中未揭示的數(shù)種罕見(jiàn)基因突變或單倍體中的一種或一種以上。OASl的這些新穎形式OASlR賦予攜帶者對(duì)C型肝炎病毒和相關(guān)黃病毒一定程度的抗性，所述相關(guān)黃病毒包括(但不限于)西尼羅河病毒(West Nile virus)、登革熱病毒、 黃熱病病毒、蜱傳腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus)、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、墨累谷病毒(Murray Valley virus)、玻瓦桑病毒(Powassan virus)、羅西奧病毒(Rocio virus)、跳躍病病毒(louping-ill virus)、班奇病毒(Banzi virus)、伊列烏斯病毒(Ilheus virus)、禾斗禾斗貝拉病毒(Kokobera virus)、昆金病毒(Kunjin virus)、沃父病毒(Alfuy virus)、牛痢疾病毒禾口卡薩諾爾森林病病毒(Kyasanur forest diseasevirus)。 OAS蛋白也已顯示其在實(shí)驗(yàn)性呼吸融合病毒和小核糖核酸病毒細(xì)胞培養(yǎng)物感染系統(tǒng)的感染減弱中是重要的。已將受人類(lèi)免疫缺陷病毒-I(HIV-I)感染的細(xì)胞無(wú)法釋放病毒與高濃度的OAS和/或2-5A聯(lián)系起來(lái)。此外，HIV-I反式激活蛋白(tat)已顯示阻斷OAS的活化 (Muller 等人，J Biol Chem. 1990Mar 5 ；265 (7) :3803-8)，因而表明 OAS 的新穎形式可避開(kāi) HIV-I防御機(jī)制且提供有效的治療。因此本文中所揭示的這些OASl的0AS1R形式也可賦予對(duì)這些非黃病毒感染劑的抗性。本發(fā)明也提供對(duì)OASl的黑猩猩(Pan troglodytes)和大猩猩(Gorilla gorilla) 形式的新穎描述，每一形式均導(dǎo)致具有效用的新穎mRNA和多肽。雖然基因在關(guān)系密切的靈長(zhǎng)類(lèi)(諸如人類(lèi)、黑猩猩和大猩猩)中通常高度保守，但是觀察到三種物種之間OASl的重要差異。最親的人類(lèi)親屬黑猩猩在OASl外顯子5中具有單個(gè)堿基取代(位于相當(dāng)于人類(lèi) NT_009775. 13中的2，142，351的位點(diǎn)且由SEQ ID NO :53所界定)，其導(dǎo)致生成截短型蛋白質(zhì)產(chǎn)物。黑猩猩OASl多肽和mRNA序列分別由SEQ ID NO 51和SEQ IDNO 55提供。大猩猩也在靠近受體剪接位點(diǎn)的外顯子6中具有兩堿基對(duì)缺失(位于相當(dāng)于人類(lèi)NT_009775. 13 中的2，144，089-2，144，090的位點(diǎn)且由SEQ ID NO 54所界定)，其導(dǎo)致轉(zhuǎn)譯提前終止。大猩猩部分多肽和部分mRNA序列分別由SEQ ID N0:52和SEQ IDNO :56提供。圖5C中提供相對(duì)于人類(lèi)的黑猩猩和大猩猩轉(zhuǎn)錄物的推測(cè)結(jié)構(gòu)。這些情況中的每一種(類(lèi)似于人類(lèi)0AS1R 多肽)均具有高度保守的多肽序列，其在羧基末端尾部的結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物方面最顯著不同。 這些多肽的共有氨基末端部分含有先前證實(shí)為OASl酶活性所必需的所有元件。由于黑猩猩和大猩猩已經(jīng)受與非洲人的病毒攻毒類(lèi)似的病毒攻毒，因此這些不同但功能上類(lèi)似的靈長(zhǎng)類(lèi)變異體的流行提供進(jìn)一步證據(jù)表明較長(zhǎng)OASl形式的羧基末端部分對(duì)于病毒攻毒后的繼續(xù)存活為非必要或甚至不利的。黑猩猩具有OASl多肽的完全截短(其與人類(lèi)轉(zhuǎn)錄物變異體的異質(zhì)性相對(duì))的事實(shí)與以下觀察相一致盡管黑猩猩為已知的易受HCV感染的僅有其他靈長(zhǎng)類(lèi)，但黑猩猩確實(shí)具有相對(duì)于人類(lèi)的非典型性感染，其特征為病毒清除頻率增加和不導(dǎo)致纖維化或肝細(xì)胞癌。每一新穎OASlR cDNA都是克隆自攜帶這些突變的人類(lèi)受檢者?？寺∈峭ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn) cDNA克隆方法進(jìn)行，這些方法包括自細(xì)胞或組織分離RNAjf RNA轉(zhuǎn)化為cDNA和將cDNA轉(zhuǎn)化為適于克隆的雙股DNA。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，所有這些步驟都是常規(guī)分子生物學(xué)分析。其他方法包括使用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、5' RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)或傳統(tǒng)的 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和Southern雜交篩檢。本文中所述的所有OASlR等位基因都是自患者攜帶者回收。對(duì)每一新近克隆的OASlR cDNA測(cè)序以確定其身份且鑒別相對(duì)于野生型的任何額外序列差異。新穎OASlR基因突變可通過(guò)改變所得OASl mRNA的性質(zhì)而影響對(duì)病毒感染的抗性。因此，評(píng)估OASlR等位基因攜帶者與純合野生型受檢者之間的mRNA穩(wěn)定性差異。使用包括Taqman 和簡(jiǎn)單Northern雜交法的已知分析來(lái)評(píng)估并比較RNA穩(wěn)定性。這些構(gòu)成分子生物學(xué)中的常規(guī)方法。OASlR突變可通過(guò)改變OASl基因的調(diào)控來(lái)影響感染抗性。已知OAS基因的表達(dá)是由干擾素治療誘導(dǎo)且于病毒感染期間誘導(dǎo)。OASlR等位基因可經(jīng)由組成性表達(dá)、過(guò)度表達(dá)或其他不受調(diào)控型表達(dá)來(lái)賦予對(duì)病毒感染的抗性。使用數(shù)種方法評(píng)估具有或不具有干擾素或病毒刺激的基因表達(dá)。這些方法包括表達(dá)微陣列分析、Northern雜交法、Taqman 及其他方法。自已知表達(dá)OAS基因的組織(諸如周邊血液?jiǎn)魏思?xì)胞)采集樣本。比較來(lái)自 0AS1R攜帶者和非攜帶者的組織之間的基因表達(dá)。在一實(shí)施例中，自攜帶者和非攜帶者采集周邊血液?jiǎn)魏思?xì)胞，在培養(yǎng)物中繁殖且由干擾素刺激。將干擾素誘導(dǎo)期間0AS1R等位基因的表達(dá)水平與野生型等位基因進(jìn)行比較。在另一實(shí)施例中，以干擾素治療人類(lèi)受檢者并評(píng)估0AS1R突變的攜帶者中相對(duì)于非攜帶者中的OASl基因的誘導(dǎo)程度。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可了解，將組織、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法的許多組合用于評(píng)估0AS1R基因調(diào)控。一旦對(duì)每一 0AS1R的新穎cDNA進(jìn)行克隆，即可使用眾多不同的已知表達(dá)克隆系統(tǒng)中的任一種將其用于制備重組0AS1R蛋白。在此方法的一實(shí)施例中，0AS1R cDNA是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法克隆至大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)載體中鄰近于含有編碼聚組氨酸多肽的DNA序列的附加表位。隨后使用固定化金屬親和色譜法或類(lèi)似方法自大腸桿菌溶解產(chǎn)物純化重組蛋白。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到有許多可用于純化重組蛋白的不同表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，包括(但不限于)酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞等等。使用計(jì)算方法鑒別來(lái)自0AS1R蛋白的短肽序列，其獨(dú)特地將這些蛋白與野生型 OASl蛋白區(qū)別開(kāi)來(lái)。各種計(jì)算方法和市售軟件包可用于肽選擇?？墒褂肍MOC肽合成化學(xué)或類(lèi)似方法制備這些經(jīng)計(jì)算選擇的肽序列。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到有大量用于根據(jù)所供應(yīng)序列合成短多肽的化學(xué)方法?？墒褂脕?lái)自0AS1R基因的肽片段和重組蛋白開(kāi)發(fā)對(duì)此基因產(chǎn)物呈特異性的抗體。 正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，存在大量用于抗體開(kāi)發(fā)的方法，包括使用多個(gè)不同的宿主有機(jī)體、佐劑等等。在一經(jīng)典實(shí)施例中，將少量(150微克)純化重組蛋白皮下注射入新西蘭白兔(New Zealand White Rabbit)背部，隨后每幾個(gè)月注射類(lèi)似數(shù)量作為輔助劑。 隨后通過(guò)靜脈穿刺收集兔血清并可收集血清、純化IgG或?qū)γ庖叩鞍壮侍禺愋缘挠H和純化抗體。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，可使用類(lèi)似方法開(kāi)發(fā)大鼠、小鼠、山羊及其他有機(jī)體中的抗體。也可使用如上所述的肽片段開(kāi)發(fā)對(duì)OASlR蛋白呈特異性的抗體。單克隆抗體和多克隆抗體的開(kāi)發(fā)都適于實(shí)施本發(fā)明?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù)產(chǎn)生分泌OASlR蛋白的特異性單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞系。可使用如上所述制備的抗體開(kāi)發(fā)用于評(píng)估細(xì)胞、組織和有機(jī)體中OASlR蛋白的存在或不存在的診斷方法。在此方法的一實(shí)施例中，可使用經(jīng)純化的重組OASlR蛋白和特異性抗體開(kāi)發(fā)酶聯(lián)免疫吸附分析以檢測(cè)人類(lèi)血清中的這些蛋白?？墒褂眠@些診斷方法驗(yàn)證上述基因突變的攜帶者和非攜帶者的組織中OASlR蛋白的存在或不存在。也可使用如上所述制備的抗體自那些攜帶這些突變的患者純化天然OASlR蛋白。 對(duì)于使用抗體自人類(lèi)細(xì)胞和組織純化天然蛋白有大量方法可利用。在一實(shí)施例中，抗體可用于包括均質(zhì)化人類(lèi)組織和使用蛋白A捕捉抗體的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中。這個(gè)方法能夠濃縮且進(jìn)一步評(píng)估突變型OASlR蛋白?？衫迷S多其他用于分離OASlR的天然形式的方法，包括柱色譜法、親和色譜法、高壓液相色譜法、鹽析法、透析法、電泳法、等電聚焦法、差速離心法寸寸。使用蛋白質(zhì)體方法評(píng)估OASlR突變對(duì)二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。也使用蛋白質(zhì)體方法評(píng)估OASlR突變對(duì)OAS蛋白的轉(zhuǎn)譯后修飾的影響。存在許多已知可能的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后修飾，包括蛋白酶裂解、糖基化、磷酸化、硫酸化、加入化學(xué)基團(tuán)或復(fù)合分子等等。評(píng)估二級(jí)和三級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一般方法為核磁共振(NMR)光譜法。使用NMR探測(cè)野生型OASl蛋白與OASlR蛋白之間二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的差異。傳統(tǒng)NMR的修改方案也是適合的，包括評(píng)估功能位點(diǎn)活性的方法，包括核轉(zhuǎn)移歐佛豪瑟光譜法(TrNOESY)等等。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，可采用此方法和用于結(jié)果的數(shù)據(jù)解釋的方法的許多微小修改方案。所有這些方法都意欲包括于本發(fā)明的實(shí)施之中。使用通過(guò)結(jié)晶和X光衍射來(lái)確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的其他方法。也可使用質(zhì)譜法評(píng)估突變型與野生型OAS蛋白之間的差異?？墒褂么朔椒ㄔu(píng)估結(jié)構(gòu)差異以及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后修飾的差異。在此方法的一典型實(shí)施例中，使用上述方法中的一種自人類(lèi)周邊血液?jiǎn)魏思?xì)胞純化野生型OASl蛋白和突變型OASlR蛋白。這些細(xì)胞可如上所述經(jīng)干擾素刺激以增加OAS蛋白的表達(dá)。以特異性蛋白酶(諸如胰蛋白酶)消化經(jīng)純化蛋白并使用質(zhì)譜法評(píng)估。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，也可使用許多替代方法。本發(fā)明涵蓋這些額外的替代方法。例如，可使用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離法(MALDI)或電噴霧電離(ESI)質(zhì)譜法。此外，質(zhì)譜法可與細(xì)胞蛋白的二維凝膠電泳分離法聯(lián)用以作為對(duì)綜合預(yù)純化法的替代。質(zhì)譜法也可與肽指紋數(shù)據(jù)庫(kù)和各種檢索算法聯(lián)用。也可通過(guò)質(zhì)譜法與各種預(yù)處理(諸如以糖基化酶及磷酸酶預(yù)處理)聯(lián)用來(lái)探測(cè)轉(zhuǎn)譯后修飾(諸如磷酸化或糖基化作用)的差異。將所有這些方法都視為本申請(qǐng)案的一部分。OASl為四聚物形式時(shí)有活性，且干擾自身締合的突變影響酶活性。使用已知方法評(píng)估OASlR突變對(duì)四聚物形成的影響。例如，以O(shè)ASl和OASlR特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀以自患者細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或過(guò)度表達(dá)OASl或OASlR的經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞分離0AS1/0AS1R復(fù)合物。 隨后可通過(guò)凝膠電泳法或所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他色譜方法來(lái)評(píng)估這些復(fù)合物。OASl可通過(guò)與其他蛋白相互作用而賦予抗病毒性。酶含有與bcl-2家族的BH3域在結(jié)構(gòu)上同源的區(qū)。此域可能對(duì)OASl的功能是關(guān)鍵性的。根據(jù)本發(fā)明，可使用OASl特異性抗體分離蛋白復(fù)合物，包括來(lái)自如上討論的各種來(lái)源的OASl蛋白。隨后可通過(guò)凝膠電泳法評(píng)估這些復(fù)合物以分離相互作用的復(fù)合物的成員?？墒褂冒╓estern印跡法的許多方法探測(cè)凝膠，且可使用肽測(cè)序法分離并鑒別新穎的相互作用的蛋白質(zhì)。也將評(píng)估野生型與 OASlR提取物中OAS復(fù)合物含量的差異。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，所述方法僅為許多可用于純化、鑒別和評(píng)估OAS復(fù)合物中相互作用的蛋白質(zhì)的不同方法中的一些。額外方法包括(但不限于)噬菌體展示技術(shù)和使用酵母雙雜交體方法。已知OASl與C型肝炎病毒NS5A蛋白相互作用(Taguchi，T.等人，J. Gen. Virol. 85 :959-969, 2004)。不受機(jī)制的約束，本發(fā)明因此涉及不與NS5A蛋白相互作用的 OASl蛋白，其中所述蛋白為本發(fā)明的多肽，其由本發(fā)明的聚核苷酸表達(dá)、由OASl的剪接變異體所編碼的mRNA表達(dá)、由含有至少一個(gè)本發(fā)明的突變的OASl聚核苷酸表達(dá)、由編碼區(qū)內(nèi)具有至少一個(gè)突變的OASl聚核苷酸表達(dá)和/或由具有至少一個(gè)堿基取代、缺失或添加的 OASl聚核苷酸表達(dá)，其中與NS5A蛋白的結(jié)合被改變或阻礙。NS5A蛋白可通過(guò)抑制干擾素的抗病毒活性而發(fā)揮生物學(xué)活性。當(dāng)干擾素在諸如雙股RNA的輔因子的存在下刺激OASl活性時(shí)，此抗病毒活性處于一正常實(shí)施的模型中。OASl 使ATP聚合成2' -5'-連接的寡腺苷酸，其激活RNase L以裂解包括mRNA的單股RNA。 NS5A與OASl的結(jié)合可抑制其活性，因此抑制或阻礙將另外導(dǎo)致病毒RNA破壞的活性級(jí)聯(lián)。盡管本發(fā)明并非取決于此模型，但是NS5A與OASl的結(jié)合與其中OASl的突變形式避免NS5A結(jié)合和抑制且因而能夠?qū)崿F(xiàn)聚合ATP的正常功能的模型相一致。在與本文中所述的臨床結(jié)果相一致的這些情況下，攜帶這一突變的人對(duì)C型肝炎病毒感染存在抗性。類(lèi)似地，如上所揭示黑猩猩所具有的OASl的截短形式可避開(kāi)與NS5A或其他病毒蛋白結(jié)合且因此可觀察到更高的黑猩猩病毒清除頻率。在某些情況下突變可直接影響OASl用于NS5A 的結(jié)合位點(diǎn)。在其他情況下，突變可位于與實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)分開(kāi)的位點(diǎn)，但引起構(gòu)象改變使得 OASl與NS5A的結(jié)合受到抑制、減慢或阻止。因此OASl與NS5A以生理學(xué)和病理學(xué)上相關(guān)方式的結(jié)合提供用于分析OASl聚核苷酸中堿基突變、缺失或添加對(duì)所編碼的OASl蛋白的生物學(xué)功能的影響的客觀測(cè)試。 以此項(xiàng)技術(shù)中已知的方式分析所述結(jié)合。在一諸如Taguchi，T.等人(J. Gen. Virol. 85 959-969，2004)所述之例示性而非限制性方法中，HeLa細(xì)胞經(jīng)編碼GST標(biāo)記的NS5A和HA 標(biāo)記的OASl的表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。此實(shí)例中的OASl意指根據(jù)本發(fā)明的0AS1，包括由OASl 的剪接變異體、由在編碼區(qū)內(nèi)具有至少一個(gè)突變的OASl聚核苷酸和/或由具有至少一個(gè)堿基取代、缺失或添加的OASl聚核苷酸所編碼的0AS1。在諸如12-16小時(shí)的適當(dāng)培育時(shí)間之后，將細(xì)胞洗滌、溶解并離心，并將所得上清液與結(jié)合谷胱甘肽的瓊脂糖(kpharose)珠?；旌?，此舉有助于分離經(jīng)GST標(biāo)記的蛋白。通過(guò)使用并成像抗NS5A的抗體和抗HA抗體來(lái)鑒別經(jīng)GST標(biāo)記的NS5A與經(jīng)HA標(biāo)記的OASl蛋白的復(fù)合物。此方法的變型包括對(duì)個(gè)別蛋白使用其他標(biāo)記，諸如FLAG-標(biāo)記。在本發(fā)明上下文中，主要變數(shù)為OASl蛋白或多肽。使用這些分析法客觀地測(cè)試OASl蛋白或多肽進(jìn)行一個(gè)生物學(xué)相關(guān)活動(dòng)(即結(jié)合至已知對(duì)于病毒在宿主中復(fù)制的能力具有保護(hù)性的C型肝炎蛋白)的能力。未與NS5A結(jié)合的OASl蛋白和多肽是作為治療性蛋白的合適候選者。OASl蛋白是催化ATP轉(zhuǎn)化為寡腺苷酸分子的酶。可利用數(shù)種方法來(lái)評(píng)估OASl酶的活性。使用這些方法來(lái)確定0AS1R突變對(duì)突變型蛋白相對(duì)于野生型酶的活性的影響。例如，可通過(guò)量化并入聚腺苷酸中的經(jīng)32P放射性同位素標(biāo)記的ATP來(lái)測(cè)量寡腺苷酸合成活性?？赏ㄟ^(guò)包括電泳法或離子交換色譜法的許多色譜方法對(duì)經(jīng)放射性同位素標(biāo)記的聚腺苷酸的長(zhǎng)度進(jìn)行量化及表征。這些分析也能夠表征底物(ATP)結(jié)合和酶動(dòng)力學(xué)。OASl是由 dsRNA激活。使用本文中所述的活性分析和此項(xiàng)技術(shù)中所述的合成dsRNA來(lái)分析OASl中此活化作用的動(dòng)力學(xué)并與OASlR作比較。通過(guò)這些和此項(xiàng)技術(shù)中已知的其他方法證實(shí)本發(fā)明的多肽具有寡腺苷酸合成活性。圖7和圖8證實(shí)本發(fā)明的數(shù)種例示性多肽的活性。不管其活性的量化水平為何，這種產(chǎn)生2' -5'-寡腺苷酸的能力經(jīng)由RNaseL的活化而產(chǎn)生抗病毒效果都為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所十分了解。同樣，本發(fā)明的多肽具有寡腺苷酸合成活性的純粹事實(shí)表明所述多肽尤其是因?yàn)槠溆谝韵陆沂镜闹委熡猛径哂行в?。?zhí)行生物學(xué)研究以評(píng)估OASlR突變基因使得免受病毒感染的程度。這些生物學(xué)研究一般采用以下形式將突變型OASlR基因或蛋白引入細(xì)胞或整個(gè)有機(jī)體中，并相對(duì)于野生型對(duì)照物評(píng)估其生物學(xué)及抗病毒活性。在此方法的一典型實(shí)施例中，通過(guò)將如本文中所述經(jīng)分離的cDNA克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(所述載體驅(qū)動(dòng)所克隆的cDNA自SV40啟動(dòng)子序列表達(dá))中，從而將OASlR基因引入培養(yǎng)物中的非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞中。此載體也含有 SV40和細(xì)胞巨化病毒增強(qiáng)子元件，其允許OASlR基因和用于在培養(yǎng)物中選擇的新霉素抗性基因的有效表達(dá)。隨后可評(píng)估在感染登革熱病毒的Vero細(xì)胞中OASlR表達(dá)的生物學(xué)作用。 在OASlR賦予對(duì)多種黃病毒的廣泛抗性的情況下，將預(yù)期到表達(dá)這些OASl突變形式的細(xì)胞系中的病毒繁殖相對(duì)于野生型有所減少。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，有多種不同實(shí)驗(yàn)方法可用于評(píng)估細(xì)胞和有機(jī)體中對(duì)不同感染劑有反應(yīng)的OASlR基因及蛋白的生物學(xué)效應(yīng)。例如，在以上實(shí)例中，不同的表達(dá)載體、細(xì)胞類(lèi)型和病毒物種可用于評(píng)估OASlR抗性效應(yīng)。相對(duì)于細(xì)胞系評(píng)估培養(yǎng)物中的初級(jí)人類(lèi)細(xì)胞。在病毒引入前，細(xì)胞可由雙股RNA或干擾素刺激?？稍u(píng)估含有替代啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的表達(dá)載體。評(píng)估除黃病毒之外的病毒 (例如呼吸融合病毒和小核糖核酸病毒)。開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型以評(píng)定OASl的突變形式在保護(hù)整個(gè)有機(jī)體不受病毒感染方面的適用性。在一實(shí)施例中，將OASlR基因引入易受黃病毒感染的小鼠的基因組中(例如 C3H/He近交系實(shí)驗(yàn)室菌株)。評(píng)估這些OASlR基因于易受感染的小鼠中調(diào)節(jié)感染或賦予感染抗性的能力。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的，可使用許多標(biāo)準(zhǔn)方法將轉(zhuǎn)基因人類(lèi)OASlR 基因引入小鼠中。這些方法可與影響組織特異性表達(dá)樣式或允許經(jīng)由引入內(nèi)源性化學(xué)品、 使用可誘導(dǎo)性或組織特異性啟動(dòng)子等來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)基因的其他方法聯(lián)合。作為C型肝炎感染的模型，評(píng)估表達(dá)OASlR基因的細(xì)胞系對(duì)牛痢疾病毒(BVDV) 感染的易感性、抗性或調(diào)節(jié)。BVDV是用于測(cè)試潛在抗HCV抗病毒藥物的功效的常用模型 (Buckwold等人，Antiviral Research 60 :1-15,2003) 在一實(shí)施例中，可使用基本上如上所述的表達(dá)載體將OASlR基因引入KL(小牛肺)細(xì)胞中并測(cè)試其于此細(xì)胞系中調(diào)節(jié)BVDV感染的能力。此外，也可對(duì)HCV感染的小鼠模型(例如，人肝臟移植入小鼠中、人肝細(xì)胞注入小鼠肝臟中等等)評(píng)估OASlR基因的轉(zhuǎn)基因組中HCV感染的改變?？蛇M(jìn)行實(shí)驗(yàn)由此在HCV 病毒培養(yǎng)系統(tǒng)中評(píng)定OASlR基因的表達(dá)效果。也可使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)評(píng)定突變型OASlR基因在不同條件下在促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面的影響。在一實(shí)施例中，可相對(duì)于野生型OASl序列評(píng)定OASlR的細(xì)胞培養(yǎng)突變形式在受包括BVDV、HCV及其他黃病毒的許多病毒所感染的細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，可利用許多方法測(cè)量細(xì)胞凋亡。最常用的方法包括聯(lián)合使用熒光結(jié)合方法與瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)凋亡細(xì)胞中的特征性基因組“DNA階梯(DNA laddering)，，效應(yīng)?？稍诩?xì)胞培養(yǎng)物和小動(dòng)物模型中測(cè)試缺陷型干擾病毒增強(qiáng)OASlR突變形式的效應(yīng)的能力。也可檢測(cè)OASlR基因型的存在或不存在影響其他人類(lèi)表現(xiàn)型的程度。例如，評(píng)估 OASlR突變?cè)诟腥綡CV的受檢者中與病毒滴度和自發(fā)病毒清除的相關(guān)性。也可采取將宿主 OASl基因型與其他黃病毒感染的過(guò)程相聯(lián)系的類(lèi)似方法。也檢測(cè)在感染HCV的患者中干擾素治療或干擾素與病毒唑(rikwirin)治療期間OASlR突變?cè)诖龠M(jìn)成功結(jié)果方面的影響。 這些突變不僅可賦予一定程度的感染抗性，而且也促進(jìn)經(jīng)或未經(jīng)干擾素-病毒唑治療的受感染受檢者中的自發(fā)病毒清除。此外，已報(bào)導(dǎo)精神分裂癥在黃病毒感染具地域性的地理區(qū)域發(fā)生頻率較高，表明黃病毒抗性等位基因與易患精神分裂癥的體質(zhì)之間存在聯(lián)系。通過(guò)進(jìn)行額外的涉及精神分裂癥表現(xiàn)型和OASlR突變的基因關(guān)聯(lián)性研究來(lái)評(píng)估此聯(lián)系。也將評(píng)估OASlR突變對(duì)IDDM、前列腺癌及其他癌癥及精神分裂癥的易感性的影響。本發(fā)明揭示新穎且具有效用的OASlR變異型mRNA(確定為SEQ ID N0:36至SEQID N0:43)。本發(fā)明不受限于所揭示的變異型mRNA的使用模式。在一優(yōu)選實(shí)施例中，這些變異型mRNA是用于差別篩檢人類(lèi)受檢者增加或降低的病毒(包括HCV)易感性。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，這些變異型mRNA適用于篩檢對(duì)IDDM、前列腺癌及其他癌癥和/或精神分裂癥的易感性。通過(guò)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的表達(dá)分析執(zhí)行所述差別篩檢以測(cè)定一種或一種以上存在于來(lái)源于給定人類(lèi)受檢者的樣本中的變異型OASlR mRNA的相對(duì)量。相對(duì)于對(duì)照樣本而言，人類(lèi)受檢者樣本中一種或一種以上OASlR mRNA變異體的量增加或降低表明受檢者易感染病毒、IDDM、前列腺癌及其他癌癥和/或精神分裂癥的程度，此適于所考慮的測(cè)試。如本文中所討論，2' ,5'-寡腺苷酸合成酶(OAS)為IFN- α誘導(dǎo)性、RNA依賴(lài)性效應(yīng)分子酶家族，其自ATP合成短的2'至5'連接的寡腺苷酸0-5Α)分子。OAS酶構(gòu)成對(duì)病毒感染的非特異性免疫防御的重要部分且已用作病毒感染的細(xì)胞標(biāo)記物。除在本文中所討論的C型肝炎感染中的作用外，在其他病狀、尤其是那些其中病毒感染起作用的病狀中也涉及OAS活性。雖然當(dāng)前分析的主題為特異性致病機(jī)制，但是據(jù)信病毒感染在諸如糖尿病的疾病的發(fā)展中起作用。1型糖尿病患者中淋巴細(xì)胞OAS活性顯著提高，表明OAS可能為病毒感染與疾病發(fā)展之間的重要聯(lián)系。在涉及來(lái)自單卵雙生對(duì)的糖尿病雙胞胎的研究中， Bonnevie-Nielsen 等人(Clin Immunol. 2000Jul ；96(1) :11-8)顯示 OAS 在新近發(fā)作和長(zhǎng)期存在的1型糖尿病中均得以持久激活。1型糖尿病中連續(xù)升高的OAS活性與正?？共《痉磻?yīng)明顯不同且可能表示酶的慢性刺激、下調(diào)機(jī)制的失效或?qū)?nèi)源性或外源性病毒或其產(chǎn)物的異常反應(yīng)。病毒感染與糖尿病發(fā)展之間更直接的聯(lián)系由許多研究加以例證，這些研究顯示介于13%與33%之間的慢性C型肝炎患者患有糖尿病O型糖尿病)，此水平與匹配的健康對(duì)照或慢性B型肝炎患者相比顯著增加(Knobler等人，Am J Gastroenterol. 2003Dec ； 98(12) :2751-6)。雖然迄今為止尚未報(bào)導(dǎo)OAS對(duì)在C型肝炎感染之后發(fā)展成糖尿病起作
19用，但是其可為用于抗病毒反應(yīng)系統(tǒng)的有用標(biāo)記物。此外，根據(jù)本發(fā)明所報(bào)導(dǎo)的結(jié)果說(shuō)明， 若C型肝炎感染與糖尿病有因果關(guān)系，則使用本文中所揭示的組合物和方法抑制或消除C 型肝炎感染可有利于預(yù)防或減輕糖尿病的發(fā)展。另一公開(kāi)研究已顯示OAS在傷口痊愈及其病理學(xué)病癥方面、尤其是在靜脈潰瘍和與糖尿病相關(guān)的不易痊愈傷口的情況下起本質(zhì)作用(W0 02/090552)。在不易痊愈傷口的情況下，受感染組織中OAS mRNA含量減少，而不是象在來(lái)源于1型糖尿病患者的淋巴細(xì)胞中那樣升高。這些發(fā)現(xiàn)針對(duì)OAS作為糖尿病和與糖尿病相關(guān)的傷口痊愈中的免疫反應(yīng)的病因?qū)W上的重要標(biāo)記物。OAS也可在前列腺癌中所涉及的細(xì)胞過(guò)程中起中間物作用。OAS的主要生物學(xué)功能為促進(jìn)RNaseL的活性，RNase L是一種由2_5A分子進(jìn)行酶刺激的受獨(dú)特調(diào)控的核糖核酸內(nèi)切酶。RNaseL在調(diào)節(jié)IFN的抗病毒效應(yīng)上具有非常確實(shí)的作用，且為遺傳性前列腺癌 1等位基因(HPCl)的強(qiáng)力候選物。已顯示RNaseL中的突變傾向于增加男性中的前列腺癌發(fā)病率，在某些情況中其表現(xiàn)為與非RNaseL相關(guān)病例相比更具侵襲性的疾病和/或發(fā)作年齡降低。Xiang 等人(Cancer Res. 20030ct 15 ；63 (20) :6795-801)證實(shí) 2-5A 的生物穩(wěn)定性硫代磷酸酯類(lèi)似物誘導(dǎo)RNaseL活性并引起晚期轉(zhuǎn)移性人類(lèi)前列腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)物中的細(xì)胞凋亡。他們的發(fā)現(xiàn)表明同時(shí)伴隨2-5A含量增加的OAS活性提高可經(jīng)由有效的細(xì)胞凋亡途徑而有利于癌細(xì)胞的毀滅。因此，本文中所揭示的組合物和方法的使用可在前列腺癌的檢測(cè)、治療和/或預(yù)防中具有效用。另外OAS可通過(guò)其對(duì)RNaseL的調(diào)控或經(jīng)由另一尚未發(fā)現(xiàn)的途徑而在正常細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中起作用。有大量證據(jù)支持OAS在負(fù)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)中的重要性。Rysiecki等人 (J. Interferon Res. 1989Dec ；9(6) :649-57)證實(shí)人類(lèi)OAS至神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少。在幾項(xiàng)將靜止細(xì)胞系與增殖細(xì)胞系相比的研究中OAS含量也已顯示為可測(cè)量的(例如 Hassel 和 Ts' 0,Mol Carcinog. 1992 ；5(1) :41-51 及 Kimchi 等人，Eur J Biochem. 1981 ；114(1) :5_10)且在每一情況下OAS含量均為在靜止細(xì)胞中最高。其他研究已顯示OAS含量與細(xì)胞周期階段之間的相關(guān)性，其中OAS含量在后S階段急劇上升而接著在 G2 階段突然下降(Wells 和 Mallucci，Exp Cell Res. 1985Jul ； 159(1) 27-36)。幾項(xiàng)研究已顯示在經(jīng)各種形式的干擾素刺激后OAS誘導(dǎo)作用與抗增殖效應(yīng)發(fā)作之間的相關(guān)性(參見(jiàn) Player 和 iTorrence, Pharmacol Ther. 1998May ；78 (2) :55-113)。細(xì)胞分化期間也顯示出OAS的誘導(dǎo)作用(例如Mlzberg等人，J Cell Sci. 1996Jun ； 109(Pt6) 1517-26和 Nil son，Mol Cell Biol. 1989Sep ；9 (9) :3897-903)。關(guān)于 OAS 由血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF) (Zullo等人，Cell. 1985Dec ；43(3Pt 2) :793-800)在熱休克誘導(dǎo)生長(zhǎng)條件下(Chousterman 等人，J Biol Chem. 1987Apr 5 ；262(10) :4806-11)誘導(dǎo)的其他報(bào)導(dǎo)導(dǎo)致以下假設(shè)0AS的誘導(dǎo)作用為正常細(xì)胞生長(zhǎng)控制機(jī)制。因此，本文中所揭示的組合物和方法的使用可在癌癥的檢測(cè)、治療和/或預(yù)防中具有廣泛效用。聚核苷酸分析寡腺苷酸合成酶基因是一種核酸，其核苷酸序列編碼寡腺苷酸合成酶、突變型寡腺苷酸合成酶或寡腺苷酸合成酶假基因。其可呈基因組DNA、mRNA或cDNA形式，且呈單股或雙股形式。優(yōu)選使用基因組DNA，因?yàn)槠湎鄬?duì)于mRNA而言在生物學(xué)樣本中具有相對(duì)穩(wěn)定性。 在序列表中以SEQ ID NO :19提供由參考寡腺苷酸合成酶基因的完整基因組序列的連續(xù)核苷酸2，130, 000-2, 157，999組成的聚核苷酸序列，且對(duì)應(yīng)于Genbank登記號(hào)NT_009775. 13。自細(xì)胞(通常為周邊血液白細(xì)胞)獲得核酸樣本。在使用mRNA時(shí)，于RNase抑制條件下溶解細(xì)胞。在一實(shí)施例中，第一步為分離總細(xì)胞mRNA。隨后可通過(guò)與寡聚dT纖維素柱雜交來(lái)選擇Poly A+mRNA。在一優(yōu)選實(shí)施例中，富集核酸樣本以獲得寡腺苷酸合成酶等位基因物質(zhì)。通常通過(guò)使用如本文中所述的聚核苷酸合成引物使基因組DNA或mRNA經(jīng)受引物延伸反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)富集。用于產(chǎn)生待分析樣本的尤其優(yōu)選方法為在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中使用預(yù)選的聚核苷酸作為引物以形成擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)物。聚核苷酸引物的制備將本文中關(guān)于欲通過(guò)引物延伸而合成的引物、探針和核酸片段或節(jié)段所使用的術(shù)語(yǔ)“聚核苷酸”定義為包含兩種或兩種以上、優(yōu)選為三種以上脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。其精確大小將取決于許多因素，這些因素又取決于最終使用條件。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“引物”意指自核酸限制性消化純化或由合成產(chǎn)生的聚核苷酸， 當(dāng)置于誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下(即在核苷酸和諸如DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等等的聚合劑存在下且在合適溫度和PH下)時(shí)，其能夠充當(dāng)核酸合成的起始點(diǎn)。引物優(yōu)選為單股以達(dá)成最大效率，但或者可呈雙股形式。若引物為雙股，則在用于制備延伸產(chǎn)物之前首先對(duì)其加以處理以與其互補(bǔ)股分離。引物優(yōu)選為聚脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長(zhǎng)以在聚合劑的存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的精確長(zhǎng)度將取決于許多因素，包括溫度和引物的來(lái)源。例如，視目標(biāo)序列的復(fù)雜性而定，聚核苷酸引物通常含有15至 25個(gè)或更多核苷酸，雖然其也可含有較少的核苷酸。短引物分子一般需要較低溫度以與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交體復(fù)合物。選擇本文中所用的引物以與待合成或擴(kuò)增的每一特定序列的不同鏈“實(shí)質(zhì)上”互補(bǔ)。此意謂引物必須充分互補(bǔ)以與其各自的模板鏈非隨機(jī)雜交。因此，引物序列可能反映或可能不反映模板的精確序列。例如，非互補(bǔ)核苷酸片段可連接于引物的5'末端，而引物序列的剩余部分與所述鏈實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)。這些非互補(bǔ)片段通常編碼核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)。 或者，非互補(bǔ)堿基或更長(zhǎng)序列可引入引物中，條件是引物序列具有與待合成或擴(kuò)增的鏈序列的足夠互補(bǔ)性以與其非隨機(jī)雜交且因而在聚核苷酸合成條件下形成延伸產(chǎn)物。本發(fā)明的引物也可含有DNA依賴(lài)性RNA聚合酶啟動(dòng)子序列或其互補(bǔ)序列。例如參見(jiàn) Krieg 等人，Nucl. Acids Res.，12 :7057-70 (1984) ；Studier 等人，J. Mol. Biol.，189 113-130(1986)；和 Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Maniatis 等人編， Cold SpringHarbor, N.Y. (1989)。當(dāng)使用含DNA依賴(lài)性RNA聚合酶啟動(dòng)子的引物時(shí)，所述引物與待擴(kuò)增的聚核苷酸鏈雜交且使用諸如大腸桿菌DNA聚合酶I或大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段的誘導(dǎo)劑完成DNA依賴(lài)性RNA聚合酶啟動(dòng)子的第二聚核苷酸鏈。起始聚核苷酸通過(guò)RNA聚核苷酸產(chǎn)生與DNA聚核苷酸產(chǎn)生之間交替來(lái)擴(kuò)增。引物也可含有用于RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶的模板序列或復(fù)制起始位點(diǎn)。典型的 RNA 指導(dǎo)的 RNA 聚合酶包括由 Lizardi 等人，Biotechnology, 6 :1197-1202(1988)描述的 QB復(fù)制酶。RNA指導(dǎo)的聚合酶自少量含有模板序列或復(fù)制起始位點(diǎn)的模板RNA鏈生成大量 RNA鏈。如Kramer等人，J. Mol. Biol.，89 :719-736 (1974)已描述，這些聚合酶通常使模板鏈擴(kuò)增一百萬(wàn)倍?？墒褂萌魏魏线m方法制備聚核苷酸引物，諸如磷酸三酯法或磷酸二酯法，參見(jiàn) Narang 等人，Meth. Enzymol. ,68 :90，(1979)；美國(guó)專(zhuān)利第 4，356，270 號(hào)、第 4，458，066 號(hào)、 第 4，416，988 號(hào)、第 4，293，652 號(hào)；和 Brown 等人，Meth. Enzymol. ,68 :109(1979)。引物的核苷酸序列的選擇取決于下列因素諸如自雜交點(diǎn)至編碼待檢測(cè)突變的區(qū)的核酸距離、核酸上相對(duì)于任何待使用的第二引物的雜交位點(diǎn)等等。若通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)富集核酸樣本以獲得寡腺苷酸合成酶基因物質(zhì)，則必須使用兩個(gè)引物(即PCR引物對(duì))以用于待擴(kuò)增核酸的每一編碼鏈。第一引物成為非編碼(反義或負(fù)或互補(bǔ))鏈的一部分且與正鏈或編碼鏈上的核苷酸序列雜交。第二引物成為編碼(有義或正)鏈的一部分且與負(fù)鏈或非編碼鏈上的核苷酸序列雜交。第一和第二引物中的一者或兩者可含有界定核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸序列。所述位點(diǎn)可與正在擴(kuò)增的寡腺苷酸合成酶基因異源。在一實(shí)施例中，本發(fā)明使用一組形成具有位于引物3'-末端的引發(fā)區(qū)的引物的聚核苷酸。引發(fā)區(qū)通常為3'-端(3'-末端)15至30個(gè)核苷酸堿基。每一引物的3'-末端引發(fā)部分均能作為引物以催化核酸合成，即引發(fā)自其3'末端起始的引物延伸反應(yīng)。引物中的一者或兩者可另外含有5'-末端(5'-端)非引發(fā)部分，即不參與與優(yōu)選模板雜交的區(qū)。在PCR中，每一引物與第二引物一起發(fā)揮作用以擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列。用于PCR中的PCR引物對(duì)的選擇是由如本文中對(duì)于生成寡腺苷酸合成酶基因區(qū)所討論的考慮因素來(lái)決定。當(dāng)選擇引物序列以與寡腺苷酸合成酶基因等位基因內(nèi)含子內(nèi)的目標(biāo)序列雜交(退火)時(shí)，目標(biāo)序列在等位基因中應(yīng)為保守的以確保產(chǎn)生待分析的目標(biāo)序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)寡腺苷酸合成酶基因包含聚核苷酸編碼鏈，諸如mRNA和/或基因組DNA的有義鏈。若待分析的遺傳物質(zhì)呈雙股基因組DNA的形式，則通常通過(guò)熔融首先將其變性成為單股。通過(guò)以PCR引物對(duì)處理(接觸)樣本而使核酸經(jīng)受PCR反應(yīng)，引物對(duì)中的每一成員具有經(jīng)預(yù)選的核苷酸序列。PCR引物對(duì)能夠通過(guò)與長(zhǎng)度優(yōu)選為至少約10個(gè)核苷酸、更優(yōu)選為至少約20個(gè)核苷酸且在寡腺苷酸合成酶等位基因內(nèi)為保守的核苷酸序列雜交來(lái)引發(fā)引物延伸反應(yīng)。PCR引物對(duì)的第一引物在本文中有時(shí)稱(chēng)為“反義引物”，因?yàn)槠渑c核酸的非編碼鏈或反義鏈(即編碼鏈的互補(bǔ)鏈)雜交。PCR引物對(duì)的第二引物在本文中有時(shí)稱(chēng)為“有義引物”，因?yàn)槠渑c核酸的編碼鏈或有義鏈雜交。通過(guò)將PCR引物對(duì)(優(yōu)選為其預(yù)定量)與樣本核酸(優(yōu)選為其預(yù)定量)在PCR緩沖液中混合以形成PCR反應(yīng)混合物來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)。將所述混合物熱循環(huán)足以形成PCR反應(yīng)產(chǎn)物的若干周期(通常為預(yù)定的)，從而富集待分析樣本以獲得寡腺苷酸合成酶遺傳物質(zhì)。PCR通常通過(guò)熱循環(huán)進(jìn)行，即在下限為約30攝氏度(30°C )至約55°C和上限為約 90°C至約100°C的溫度范圍內(nèi)重復(fù)增加及降低PCR反應(yīng)混合物的溫度。所述增加及降低可是連續(xù)的，但優(yōu)選為在每一有利于聚核苷酸合成、變性和雜交的溫度下具有相對(duì)溫度穩(wěn)定性時(shí)期的時(shí)相。在每一擴(kuò)增中均可使用多個(gè)第一引物和/或多個(gè)第二引物，例如，一類(lèi)第一引物可與許多不同的第二引物配對(duì)以形成幾種不同的引物對(duì)。或者，可使用第一與第二引物的個(gè)別對(duì)。在任何情況下，均可將使用第一引物與第二引物的相同或不同組合所擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物組合用于分析突變。使用任何合適方法進(jìn)行PCR反應(yīng)。其一般于pH值優(yōu)選為7-9、最優(yōu)選為約8的緩沖水溶液(即PCR緩沖液)中發(fā)生。優(yōu)選地，將摩爾過(guò)量(對(duì)于基因組核酸而言，通常引物模板約為IO6 1)的引物與含有模板鏈的緩沖液混合。優(yōu)選為大量摩爾過(guò)量以提高過(guò)程的效率。PCR緩沖液也含有三磷酸脫氧核糖核苷酸(聚核苷酸合成底物)dATP、dCTP、dGTP 和dTTP和通常熱穩(wěn)定的聚合酶，所有物質(zhì)均為用于引物延伸(聚核苷酸合成)反應(yīng)的足夠量。將所得溶液(PCR混合物)加熱至約90°C -100°C歷時(shí)約1至10分鐘，優(yōu)選為1至4分鐘。在此加熱時(shí)期之后，將溶液冷卻至M°C，此溫度對(duì)于引物雜交是優(yōu)選的。合成反應(yīng)可在室溫至超過(guò)聚合酶(誘導(dǎo)劑)不再有效發(fā)揮作用的溫度下發(fā)生。重復(fù)進(jìn)行熱循環(huán)直至生成所要量的PCR產(chǎn)物。例示性PCR緩沖液包含下列物質(zhì)每100微升緩沖液中有50mM KCl ； IOmM pH 值為 8. 3 的 Tris-HCl ;1. 5mM MgCl2 ；0. 001% (重量 / 體積)明膠；200 μ M dATP ； 200 μ M dTTP ；200 μ M dCTP ；2002 μ M dGTP ；和 2. 5 單位水生棲熱菌(Thermus aquaticus) (Taq)DNA聚合酶I (美國(guó)專(zhuān)利第4，889，818號(hào))。誘導(dǎo)劑可為將發(fā)揮作用以實(shí)現(xiàn)引物延伸產(chǎn)物的合成的任何化合物或系統(tǒng)，包括酶。為達(dá)成此目的的合適酶例如包括大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段、T4 DNA聚合酶、其他可利用的DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及其他酶(包括熱穩(wěn)定性酶)，其將有利于核苷酸以適當(dāng)方式組合以形成與每一核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。一般來(lái)說(shuō)，合成將于每一引物的3'末端引發(fā)且沿模板鏈以5'方向行進(jìn)直至合成終止，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的分子。然而，可存在使用如上所述的相同過(guò)程而于5'末端引發(fā)合成且以上述方向行進(jìn)的誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)劑也可為將發(fā)揮作用以實(shí)現(xiàn)RNA引物延伸產(chǎn)物的合成的化合物或系統(tǒng)，包括酶。在優(yōu)選實(shí)施例中，誘導(dǎo)劑可為DNA依賴(lài)性RNA聚合酶，諸如T7 RNA聚合酶、T3RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶。這些聚合酶生成互補(bǔ)RNA聚核苷酸。如Chamberlin等人，The Enzymes，P. Boyer 編，第 87-108 頁(yè)，Academic Press, New York(1982)已描述，RNA 聚合酶的高轉(zhuǎn)換率(turn-over rate)擴(kuò)增起始聚核苷酸?；谵D(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)已由Gingeras等人在 PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications，第 245-252 頁(yè)，Innis 等人編，Academic Press, Inc. , San Diego, Calif. (1990)中描述。若誘導(dǎo)劑為DNA依賴(lài)性RNA聚合酶且因而合并三磷酸核糖核苷酸，則將足夠量的 ATP、CTP、GTP和UTP與引物延伸反應(yīng)混合物混合并如上所述處理所得溶液。新合成鏈及其互補(bǔ)核酸鏈形成可用于所述過(guò)程的隨后步驟中的雙股分子。PCR反應(yīng)可有利地用于將適用于檢測(cè)寡腺苷酸合成酶基因中的突變的預(yù)選限制性位點(diǎn)并入所述產(chǎn)物中。PCR擴(kuò)增方法在美國(guó)專(zhuān)利第4，683，192號(hào)、第4，683，202號(hào)、第4，800，159號(hào)和第 4，965，188 號(hào)中和至少在包括 PCR Technology principles and Applications for DNAAmplification, H. Erlich 編，Stockton Press, New York(1989)禾口 PCR Protocols :A Guide toMethods and Applications, Innis 等人編，Academic Press, San Diego, Calif. (1990)的若干教科書(shū)中詳細(xì)描述。
在某些實(shí)施例中，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)使用兩對(duì)第一和第二引物。自多個(gè)不同擴(kuò)增反應(yīng) (每個(gè)反應(yīng)使用多個(gè)不同引物對(duì))獲得的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物可一起或單獨(dú)進(jìn)行分析。然而，本發(fā)明涵蓋使用僅一對(duì)第一和第二引物的擴(kuò)增反應(yīng)。以下表1中顯示用于擴(kuò)增含有本文中所揭示的突變的DNA部分的例示性引物。擴(kuò)增子A對(duì)應(yīng)于含有SEQ IDNO 1-3中所指的突變的聚核苷酸序列。擴(kuò)增子B對(duì)應(yīng)于含有SEQ ID NO :4-7和SEQ IDNO 60 中所指的突變的聚核苷酸序列。擴(kuò)增子C對(duì)應(yīng)于含有SEQ ID NO :57中所指的突變的聚核苷酸序列。擴(kuò)增子D對(duì)應(yīng)于含有SEQ ID NO :58中所指的突變的聚核苷酸序列。擴(kuò)增子E對(duì)應(yīng)于含有SEQ ID NO :59中所指的突變的聚核苷酸序列。擴(kuò)增子F對(duì)應(yīng)于含有SEQ ID NO 61中所指的突變的聚核苷酸序列。擴(kuò)增子G對(duì)應(yīng)于含有SEQ ID NO :62-64中所指的突變的聚核苷酸序列?？斜景l(fā)明的突變的擴(kuò)增子
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)分離的聚核苷酸，其包含編碼SEQ ID NO :48多肽序列的核苷酸序列。
2.一種經(jīng)分離的聚核苷酸，其包含編碼SEQ ID NO :20-30, SEQ ID NO :32-35、SEQ IDNO :46-52或SEQ ID NO :75_84，且與選自由下列各序列組成的群組的多肽具有至少80% 序列相似性的多肽序列的核苷酸序列(a)SEQ ID NO :22 和 SEQ ID NO 25 中任一者的氨基酸 219 至 238 ；(b)SEQID NO 23 的氨基酸 231 至 250 ；(c)SEQID NO :26-29, SEQ ID NO :33-34 和 SEQ ID NO 50 中任一者的氨基酸 347 至366 ；(d)SEQ ID NO 32 的氨基酸 295 至 314 ；(e)SEQID NO :46 的氨基酸 189 至 208 ；(f)SEQ ID NO 47的氨基酸61至80 ；或前述任一序列與SEQ ID NO :85-94的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域的組合。
3.一種經(jīng)分離的聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO 31, SEQ ID NO :36-45和SEQ IDNO 55-56組成的群組的核苷酸序列。
4.一種重組載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的經(jīng)分離的聚核苷酸。
5.一種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的經(jīng)分離的聚核苷酸，所述聚核苷酸可操作地連接至表達(dá)控制序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其中所述載體為病毒載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其中所述載體為選自由下列各載體組成的群組的病毒載體腺病毒載體、與腺病毒有關(guān)的病毒載體、桿狀病毒載體、塞姆利基森林病毒 (semliki forest virus)載體、辛德畢斯病毒(sindbis virus)載體、痘病毒載體、牛痘病毒載體、鳥(niǎo)痘病毒載體、禽痘病毒載體、雞痘病毒載體、金絲雀痘病毒載體、α病毒載體、雞痘病毒載體或慢病毒載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)與編碼OAS1的基因有關(guān)的突變的方法。這一突變和其他所揭示的突變與人類(lèi)對(duì)包括C型肝炎的病毒感染的抗性有關(guān)。本發(fā)明也提供一種由所述突變基因編碼的蛋白質(zhì)、多肽、編碼所述蛋白質(zhì)或多肽的聚核苷酸組成的治療劑。本發(fā)明也提供對(duì)人類(lèi)OASI呈特異性的包括反義寡核苷酸的人類(lèi)OAS1抑制劑、方法和組合物。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102174538SQ20111003635
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月23日
發(fā)明者克莉斯汀娜·A·席爾, 查爾斯·L·麥格尼斯, 蓋瑞·羅森堡, 肖恩·P·艾度納托, 蒂埃里·吉爾洛德約克斯 申請(qǐng)人:伊洛默格生物科學(xué)公司