專利名稱：α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬酶工程或生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高轉(zhuǎn)苷能力的a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的制備方法。
背景技術(shù)：
a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶可以水解麥芽糖和麥芽低聚糖分子結(jié)構(gòu)中a _1，4糖苷鍵，并將游離出來的一個葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個葡萄糖分子或麥芽糖分子中的a-l，6位上，是低聚異麥芽糖生產(chǎn)中最關(guān)鍵的酶制劑。a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶是廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)的一類酶。目前除少數(shù)來源于部分植物和哺乳動物外，主要來自于微生物中。細(xì)菌、霉菌及酵母等某些菌株能分泌此酶，產(chǎn)酶較高的是黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。據(jù)調(diào)研，日本天野制藥株式會社生產(chǎn)的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶來源于黑曲霉，美國康奈爾大學(xué)Hung選用臭曲霉(A. fotidus NRRL 337)、臺糖研究所選用碳黑曲霉(Acarbonarius CCRC 30414)、遷阪選用黑曲霉(ATCC 6257，ATCC 9642)等來生產(chǎn)a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶。調(diào)查表明，目前國內(nèi)對a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的研究主要集中在菌株的篩選以及反應(yīng)條件的優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)的研究方面，還未形成商品化的生產(chǎn)。從工業(yè)化來看，雖然我國異麥芽糖產(chǎn)量很高，但也存在兩方面的不足第一， 葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的用量很大，但因國內(nèi)沒有工業(yè)化，所以該酶完全依賴進(jìn)口 ；第二，a-葡
萄糖轉(zhuǎn)苷酶在低聚異麥芽糖生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)化率較低，一般在50%以下。就連國外第一家酶制劑生產(chǎn)企業(yè)-日本天野制藥株式會社，生產(chǎn)的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶(a-transglusidaseLAmano,簡稱TGLA)，據(jù)報道，用在低聚異麥芽糖生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)化率也僅有50 %，必須通過后提取加工純化的方法，才能得到高純度的低聚異麥芽糖。本發(fā)明的目的在于提供一種高轉(zhuǎn)苷能力的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的制備方法。用該方法制得的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶粗酶液，用于低聚異麥芽糖生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟一轉(zhuǎn)苷階段中，能明顯提高反應(yīng)速率，為整個生產(chǎn)過程縮短了反應(yīng)時間，同時為企業(yè)降低了生產(chǎn)成本，產(chǎn)物中低聚異麥芽糖含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已有的報道，也為后續(xù)的提純工序節(jié)約了成本，解決了低聚異麥芽糖生產(chǎn)中得率低的問題。利用本發(fā)明制得的a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶有如下特征I、pH穩(wěn)定性該酶在溫度55°C，pH范圍4. 5-7. 5時可穩(wěn)定30min，最適pH6. 5 ；2、熱穩(wěn)定性該酶在pH值6. 0條件下,分別以不同溫度處理30min所得結(jié)果55°C時該酶仍保留其初始活性的90%，而在70°C時則為70%。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決低聚異麥芽糖生產(chǎn)中得率低的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種高轉(zhuǎn)苷能力的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的制備方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為利用黑曲霉菌株(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏，保藏編號為2450)，經(jīng)斜面培養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)培、液體深層發(fā)酵、及高速離心階段，制得高轉(zhuǎn)苷能力的a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶制劑，具體操作步驟如下⑴斜面培養(yǎng)在裝有察氏固體培養(yǎng)基的試管中接入黑曲霉菌株，30°C靜置培養(yǎng)3-5d，制得孢子懸浮液；(2)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)在裝有PDY培養(yǎng)基的搖瓶中接入斜面孢子懸浮液，在28-32°C、80-150r/min條件下培養(yǎng)，得搖瓶孢子懸浮液； (3)液體深層發(fā)酵按5-10%搖瓶孢子懸浮液的量接種于經(jīng)高壓滅菌后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);其中菌種復(fù)壯中所述黑曲霉孢子懸浮液的制備是將培養(yǎng)基上的黑曲霉孢子用無菌水洗下制得；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方由蔗糖5-12%，蛋白胨2-8%，酵母提取物0. 1-0. 5%, K2HPO4 0. 1-1 %，N-甲基-D-葡萄糖胺 0. 01-0. 05 %，NaCl 0. 1~1%, MgSO40. 01-0. 05%，其余水分，經(jīng)混合均勻制得；所述搖瓶發(fā)酵溫度在28-35°C，100_160r/min。(4)發(fā)酵液經(jīng)高速離心，取上清液得a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶粗酶液。


說明書附圖為低聚異麥芽糖生產(chǎn)的工藝流程圖。
具體實施例方式 實施例I按上述的生產(chǎn)方法，黑曲霉經(jīng)斜面培養(yǎng)4d后，制成孢子懸浮液，接入裝有PDY培養(yǎng)基搖瓶中，在30°C，130r/min條件下培養(yǎng)48h，按7%的比例在裝有IOOml的液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中接入孢子懸浮液。其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方由蔗糖7%，蛋白胨3%，酵母提取物0. 2%, K2HPO4 0. 3%, NaCl 0. 2%, MgSO4 0.01%,其余水分，經(jīng)混合均勻制得，初始pH6. 0，在32°C，150r/min條件下培養(yǎng)42h。制得的粗酶液經(jīng)實測活力為1000u/ml。實施例2與實施例I不同之處在于液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方由蔗糖7%，蛋白胨3%，酵母提取物 0.2%，K2HPO4 0. 3%, N-甲基-D-葡萄糖胺 0.02%，NaCl 0. 2%, MgSO4 0.01%，其余水分，經(jīng)混合均勻制得。按上述生產(chǎn)方法，制得的粗酶液經(jīng)實測活力為12000u/ml。實施例3以玉米淀粉為原料，經(jīng)液化、糖化、轉(zhuǎn)苷等步驟，生產(chǎn)低聚異麥芽糖，具體工藝流程如附圖所示成品分析取少量制得的IMO成品，另取市售同類產(chǎn)品作對照，根據(jù)GB/T20881-2007中低聚異麥芽糖含量測定方法，就低聚異麥芽糖的含量進(jìn)行檢測，得出成品中低聚異麥芽糖的含量為65% ;而市售產(chǎn)品中低聚異麥芽糖的含量僅為50%。
權(quán)利要求
1.一種高轉(zhuǎn)苷能力的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的制備方法，經(jīng)斜面培養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵、高速離心階段，制得高效的a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的制備方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基配方由蔗糖5-12%，蛋白胨2-8%，酵母提取物0. 1-0. 5%, K2HPO4 0. 1_1%，誘導(dǎo)物，NaCl0.1-1%, MgSO4 0. 01-0. 05%，其余水分，經(jīng)混合均勻制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的制備方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的誘導(dǎo)物為N-甲基-D-葡萄糖胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的制備方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基配方中誘導(dǎo)物的優(yōu)選添加量為0. 01-0. 05%。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶工程或生物工程的技術(shù)領(lǐng)域。α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶是低聚異麥芽糖生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，但目前國內(nèi)尚未出現(xiàn)商品化生產(chǎn)，且已有的市售產(chǎn)品轉(zhuǎn)苷率較低。我們以黑曲霉菌株為原始菌株，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物N-甲基-D-葡萄糖胺，誘導(dǎo)黑曲霉分泌大量的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶，制得高密度的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶發(fā)酵液。發(fā)酵液酶活力達(dá)12000u/ml，用于低聚異麥芽糖生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)苷率達(dá)65％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于市售產(chǎn)品。
文檔編號C12N9/10GK102634495SQ201110036020
公開日2012年8月15日 申請日期2011年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月11日
發(fā)明者劉連碧, 吳彬彬, 宗葛麗, 董瑞建, 謝永強(qiáng) 申請人:上海青瑞食品科技有限公司