專利名稱：一種檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhbFGF)的免疫膠乳微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(riibFGF)的免疫膠乳微球，及其該微球的制備方法。
背景技術(shù)：
堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)廣泛存在于神經(jīng)組織、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中，作為人體一種廣譜有絲分裂原，具有極強(qiáng)的生物活性①對(duì)來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層的各種細(xì)胞均有促增殖作用、趨化作用和促細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)作用；②能促進(jìn)剖面毛細(xì)血管新生，改善了微循環(huán)和組織的營(yíng)養(yǎng)狀況，同時(shí)促進(jìn)成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞的增殖，使肉芽迅速生長(zhǎng)；③增強(qiáng)源于中胚層的免疫細(xì)胞的活性，提高剖面的抗感染能力。研究表明，bFGF在體內(nèi)參與多種組織的創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程，是體內(nèi)重要的創(chuàng)傷愈合因子之一。創(chuàng)傷后bFGF的含量高低能直接反映創(chuàng)面修復(fù)中的血管生成水平，為檢測(cè)和監(jiān)測(cè)創(chuàng)傷修復(fù)和組織愈合情況等提供依據(jù)。在臨床上，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)可用于治療顱腦、脊髓、周圍神經(jīng)損傷，中毒，感染，腦出血，腦梗塞，腦萎縮，腦發(fā)育不良，角膜潰瘍，神經(jīng)性耳聾，面癱，粘膜、皮膚損傷，燒傷，慢性潰瘍，軟組織損傷，內(nèi)臟損害，骨折，一些內(nèi)分泌疾病，斷肢再植和各種手術(shù)后的傷口愈合等。bFGF可以促進(jìn)損傷愈合，大大縮短病程，改善預(yù)后，但迄今對(duì)于損傷創(chuàng)面中原發(fā)bFGF含量的檢測(cè)方法不多，且檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)限和抗干擾能力等亟待提高。目前，有關(guān)bFGF免疫檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)告和相關(guān)專利技術(shù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道很少，迫切需要開(kāi)發(fā)高效、準(zhǔn)確、快速的新型免疫檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于進(jìn)一步填補(bǔ)bFGF免疫檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)空白，從而提供一種檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(riibFGF)的免疫膠乳微球及其制備方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的一種用于檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(riibFGF)的免疫膠乳微球，其特征在于，該免疫微球由抗IibFGF蛋白多克隆抗體包被， 微球顆粒大小50nm，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)最低檢測(cè)限為重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子50pg/ml，相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 83，如

圖1所示。本發(fā)明的一種檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(riibFGF)的免疫膠乳微球的制備方法，其特征在于，該方法包含如下步驟(1)根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并構(gòu)建全長(zhǎng)人bFGF QibFGF)基因表達(dá)序列；(2)將人bFGF基因片段通過(guò)限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合表達(dá)載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體；(3)對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)后，利用親合層析柱純化獲得GST-hbFGF融合蛋白；
(4)利用凝血酶在柱切割GST-hbFGF融合蛋白，洗脫物經(jīng)親合層析柱去除凝血酶后，獲得人breF;(5)將佐劑溶合抗原(GST-hbFGF融合蛋白)后免疫小鼠，經(jīng)分離純化得到鼠抗 IibFGF多克隆抗體；(6)將鼠抗IibFGF多克隆抗體，通過(guò)羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微球，得到檢測(cè)重組IibFGF蛋白的免疫膠乳微球。所述步驟2中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合表達(dá)載體是PGEX-4T-3，構(gòu)建完成后的融合表達(dá)載體是pGEX-4T-3-hbFGF。所述步驟3中的親合層析柱為Glutathione Sepharose 4B。所述步驟 4 中的親合層析柱為 Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow。所述步驟6中的微球是單分散羧基化聚苯乙烯微球，大小50nm，表面載基團(tuán)為羧基。該微球的活化是首先用活化劑EDC (碳化二亞胺)活化微球，然后加入保護(hù)劑Sulfo-NHS 使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體，以備連接抗體分子之用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的一種檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (rhbFGF)的免疫膠乳微球及其制備方法，采用單分散羧基化聚苯乙烯微球?yàn)榛|(zhì)材料，用化學(xué)偶聯(lián)方法偶聯(lián)抗WdFGF多克隆抗體獲得，取材簡(jiǎn)單、操作方便；制備方法細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)，重復(fù)性高；所制備的免疫膠乳微球顆粒小，粒徑均勻，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)最低檢測(cè)限為重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子50pg/ml，相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 83。本發(fā)明的目的、特征及優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施例結(jié)合附圖加以說(shuō)明。圖面說(shuō)明圖1是羧基化聚苯乙烯微球掃描電鏡照片
圖2是hbFGF基因原序列圖3是以E. coli為表達(dá)宿主優(yōu)化后的IibFGF基因序列圖4是菌落PCR驗(yàn)證IibFGF基因插入片段電泳圖5是質(zhì)粒)(ba I酶切電泳圖6是IibFGF表達(dá)載體測(cè)序圖 7 是 hbFGF 蛋白 SDS-PAGE (A)和 Western Blotting(B)檢測(cè)圖8是抗血清效價(jià)測(cè)定9是Bio-Rad iMark 酶標(biāo)儀實(shí)物10是ELISA法檢測(cè)IibFGF實(shí)物11是ELISA法檢測(cè)IibFGF蛋白結(jié)果
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1用本發(fā)明所述的制備方法構(gòu)建全長(zhǎng)IibFGF基因表達(dá)序列，制備的具體步驟如下1、設(shè)計(jì)全長(zhǎng)WdFGF基因序列，結(jié)果如圖2所示；2、根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾，采用全基因合成技術(shù)構(gòu)建全長(zhǎng) hbFGF基因，共339對(duì)堿基，克隆至載體pGEM_T Easy,結(jié)果如圖3所示；3、通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證WdFGF基因片斷插入的正確性，結(jié)果如圖4所示；
4、將克隆IibFGF基因菌實(shí)施擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切和瓊脂糖電泳分析， 結(jié)果如圖5所示；5、DNA測(cè)序，保證基因的全部序列100%準(zhǔn)確，結(jié)果如圖6所示；實(shí)施例2用本發(fā)明所述的制備方法表達(dá)和純化提取IibFGF蛋白，具體的操作步驟如下1、將WdFGF基因片段通過(guò)限制酶切割插入pGEX_4T_3載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體 pGEX-4T-3-hbFGF ；2、將融合表達(dá)載體pGEX-4T-3-hbFGF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)條件為200轉(zhuǎn)/分，溫度37°C ；3、當(dāng)菌體生長(zhǎng)OD595值為0. 5-0. 8時(shí)，加入1. OmM的誘導(dǎo)劑IPTG，在25°C誘導(dǎo)2-3 小時(shí)。在4°C時(shí)，以5，OOOXg離心5分鐘，收集菌體；4、菌體經(jīng)PBS緩沖液清洗3次后，超聲破碎。破碎細(xì)胞在4°C時(shí)，以15，OOOXg離心1小時(shí)，收集上清；5、將上清循環(huán)通過(guò)Glutathione Sepharose 4B親合層析柱，4°C過(guò)夜。未結(jié)合蛋白用10倍床體積的1 XPBS沖洗；6、將結(jié)合的GST-hbFGF融合蛋白用凝血酶在柱切割并用洗脫液洗脫，收集洗脫物；7、將上述洗脫物通過(guò)Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow親合層析柱吸附凝血酶，經(jīng)洗脫后獲得WdFGF。對(duì)表達(dá)和純化提取的hbFGF蛋白做SDS-PAGE和^festern Blotting分析，結(jié)果如圖7所示。實(shí)施例3用本發(fā)明所述的制備方法制備抗IibFGF多克隆抗體，具體的制備步驟如下1、將WdFGF融合蛋白抗原與弗氏佐劑混合后，充分乳化。采用背部多點(diǎn)注射法免疫BALB/c小鼠。每次免疫的抗原量約10 μ g，免疫三次。每次免疫兩周后經(jīng)尾動(dòng)脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。2、以適宜濃度的抗原包被酶標(biāo)板，100 μ 1/孔，4°C過(guò)夜；3、洗滌后，加入待檢的血清樣品，100 μ 1/孔，37°C 1小時(shí)；設(shè)陰性對(duì)照孔；4、洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG的抗體試劑，100 μ 1/孔，37°C避光顯色20 分鐘；用2. 5M H2SO4終止反應(yīng)后，閱讀各孔的A490值。對(duì)制備的WdFGF抗體，經(jīng)ELISA法檢測(cè)，抗體能與IibFGF特異性結(jié)合，其相關(guān)系數(shù)達(dá)到顯著水平，效價(jià)>1 6000，結(jié)果如圖8所示。實(shí)施例4IibFGF抗體制備完成后，通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)單分散羧基化聚苯乙烯微球，制備用于檢測(cè) hbFGF蛋白的免疫膠乳微球，具體的制備和檢測(cè)步驟如下1、將單分散羧基化聚苯乙烯微球用活化劑EDC (碳化二亞胺)活化，然后加入保護(hù)劑Sulfo-NHS使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體；2、加入抗IibFGF多克隆抗體，溫育1-2小時(shí)；3、洗滌后，收集免疫微球；
4、通過(guò)Bio-Rad iMark 酶標(biāo)儀(如圖9所示)，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) 法，檢測(cè)hbFGF樣品(如圖10所示)。經(jīng)ELISA方法驗(yàn)證，用于檢測(cè)IibFGF的免疫膠乳微球最低檢測(cè)限為重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子50pg/ml，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.83，結(jié)果如圖11所示。由此可見(jiàn)，本發(fā)明所制備的用于檢測(cè)WdFGF的免疫膠乳微球檢測(cè)靈敏度較高，且操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)，顯示了良好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(riibFGF)的免疫膠乳微球，其特征在于，該免疫微球由抗WdFGF蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小50nm，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)最低檢測(cè)限為重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子50pg/ml，相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 83。
2.—種權(quán)利要求1所述的檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(riibFGF)的免疫膠乳微球的制備方法，其特征在于，該方法包含如下步驟(1)根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并構(gòu)建全長(zhǎng)人bFGFQibFGF)基因表達(dá)序列；(2)將人bFGF基因片段通過(guò)限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合表達(dá)載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體；(3)對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)后，利用親合層析柱純化獲得GST-hbFGF融合蛋白；(4)利用凝血酶切割GST-hbFGF融合蛋白，洗脫物經(jīng)親合層析柱去除凝血酶后，獲得人 bFGF ；(5)將佐劑溶合抗原(GST-hbFGF融合蛋白)后免疫小鼠，經(jīng)分離純化得到鼠抗IibFGF 多克隆抗體；(6)將鼠抗IibFGF多克隆抗體，通過(guò)羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微球，得到檢測(cè)重組IibFGF蛋白的免疫膠乳微球。
3.按權(quán)利要求2所述的檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(riibFGF)的免疫膠乳微球的制備方法，其特征還在于，所述步驟2中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合表達(dá)載體是pGEX-4T-3，構(gòu)建完成后的融合表達(dá)載體是pGEX-4T-3-hbFGF。
4.按權(quán)利要求2所述的檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(riibFGF)的免疫膠乳微球的制備方法，其特征還在于，所述步驟3中的親合層析柱為Glutathione Sepharose 4B。
5.按權(quán)利要求2所述的檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(riibFGF)的免疫膠乳微球的制備方法，其特征還在于，所述步驟4中的親合層析柱為Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow。
6.按權(quán)利要求2所述的檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(riibFGF)的免疫膠乳微球的制備方法，其特征還在于，所述步驟6中的微球是單分散羧基化聚苯乙烯微球，大小 50nm，表面載基團(tuán)為羧基。該微球的活化是首先用活化劑EDC(碳化二亞胺)活化微球，然后加入保護(hù)劑Sulfo-NHS使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體，以備連接抗體分子之用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhbFGF)的免疫膠乳微球及其制備方法，該免疫微球由抗hbFGF蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小50nm；所述的免疫微球制備的方法，是根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并構(gòu)建全長(zhǎng)人bFGF(hbFGF)基因表達(dá)序列，將基因序列通過(guò)限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合表達(dá)載體中并進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)，利用親合層析柱純化獲得GST-hbFGF融合蛋白，以凝血酶切割該融合蛋白，經(jīng)親合層析柱去除凝血酶后獲得人bFGF，再將佐劑溶合抗原后免疫小鼠，經(jīng)分離純化得到hbFGF多克隆抗體，將抗體通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化后的微球，得到檢測(cè)hbFGF的免疫膠乳微球；所述的檢測(cè)hbFGF的應(yīng)用，是指通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法，檢測(cè)hbFGF樣品，最低檢測(cè)限為hbFGF蛋白50pg/ml，相關(guān)系數(shù)R2＝0.83；該免疫膠乳微球用于檢測(cè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子靈敏度較高，且操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/62GK102585010SQ20111002352
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月16日
發(fā)明者董貴俊 申請(qǐng)人:董貴俊