專利名稱：抗艾滋病藥物篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗艾滋病藥物篩選技術(shù)和研究方法。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDQ是一種由艾滋病病毒、即人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，簡稱HIV)侵入人體后破壞人體免疫功能，使人體發(fā)生多種不可治愈的感染和腫瘤，最后導(dǎo)致被感染者死亡的一種嚴重傳染病。回顧過去的25年，艾滋病的流行已經(jīng)遠遠超過了人們的擔心和估計。直至目前，醫(yī)學(xué)界尚未找到對付這種疾病的最佳解決辦法，有關(guān)科研機構(gòu)正在努力尋找著該病毒自身防御中的弱點，從而研發(fā)針對病毒本身及宿主因子的抗病毒藥物，以便抑制或殺死該病毒。目前對現(xiàn)有的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物耐藥的HIV病毒株的迅速增加，是對當前人類免疫缺陷病毒1型(Hiv-I)治療成功的嚴重威脅，開發(fā)新的抗HIV-I藥物就顯得日趨重要。傳統(tǒng)的病毒上清刺激靶細胞的實驗方法，受到一些條件的限制和影響，比如病毒上清保存，每次感染前病毒載量的測定等工作，這樣既費時又費力，而且需要特定的保存條件。目前抗艾滋病篩選的方法很多，要找到一種既方便又快捷的方法，對于抗艾滋病藥物的研究領(lǐng)域有很大的實際應(yīng)用價值。國際上通常用來篩選抗艾滋藥物的方法，是以適量藥物處理細胞，同時用病毒感染，測量病毒在藥物存在條件下的復(fù)制水平，以評估藥物抗病毒活性。由于艾滋病毒對人具有感染性，因此必須嚴格限制在負壓的P3實驗室進行，居高不下的成本使大規(guī)模普篩藥物受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種抗艾滋病藥物篩選方法，其能改善目前實驗研究領(lǐng)域篩選新型抗HIV-I藥物的能力，并且有效而且快速的完成抗艾滋病藥物的篩選。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種抗艾滋病藥物篩選方法，包括以下步驟1)、將待測藥物稀釋成不同濃度的藥物溶液；2)、將上述不同濃度的藥物溶液1毫升各自放入一個培養(yǎng)皿小孔內(nèi)，然后在每個小孔內(nèi)各放入數(shù)量為IO6的JLTRG細胞，于36. 8 37. 2°C的細胞培養(yǎng)箱中進行撫育，細胞培養(yǎng)箱中( 的濃度為5%，濕度(相對濕度)為75%，撫育時間為5 7小時；3)、在1毫升的含有5% FBS (胎牛血清)、1%鏈霉素和青霉素的1640培養(yǎng)基中加入數(shù)量為IO5的H9細胞，得懸浮液；在步驟2、所得的每孔內(nèi)加入上述懸浮液，于36. 8 37. 2°C的細胞培養(yǎng)箱中進行共培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%，濕度(相對濕度)為75%;共培養(yǎng)的時間為68 76小時；4)、在熒光顯微鏡下觀察步驟幻所得的細胞綠色熒光強度和密度；用細胞流式儀測定綠色熒光的表達情況，通過綠色熒光細胞百分率和平均熒光強度的乘積，再除以90%的計算方法，得出糾正之后的細胞熒光值；5)、分別設(shè)置陽性對照和陰性對照以沒有加入藥物單純加入H9細胞的組為陽性對照，以沒有加入藥物也沒有加入H9細胞的組為陰性對照；6)、根據(jù)上述實驗結(jié)果測得待測藥物對抗艾滋病半數(shù)有效劑量。在本發(fā)明中，步驟1)中藥物如可稀釋成0. 6uM，0. 15um,0. 03uM,0. 006uM,0. 0015, 0. 0003uM,步驟2~)中的培養(yǎng)皿例如可選擇12孔的細胞培養(yǎng)板；步驟幻中的1640培養(yǎng)基是從GIBCO公司購買的成品細胞培養(yǎng)基，含有L-谷氨酰氨，Lot :690169.在本發(fā)明中，發(fā)明人引入了 T-細胞為基礎(chǔ)的報告基因細胞株(JLTRG)，其同時表達CD4受體和CXCR4受體，通過基因改造技術(shù)獲得的這種持有報告基因的細胞株，它包含 HIV-I長末端重復(fù)穩(wěn)定整合副本(LTR)的EGFP報告結(jié)構(gòu)。JLTRG細胞被HIV感染后HIV-ITat 蛋白與細胞基因組特定區(qū)域結(jié)合，激發(fā)綠色熒光蛋白的表達，我們可以通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測增強綠色熒光蛋白信號(EGFP)來作為直接和定量的感染檢測指標，同時進行數(shù)據(jù)采集和分析，非常適用于高通量篩選的檢測，并且可以確定抗艾滋病藥物的半數(shù)抑制量(50% concentration of inhibition，IC50)。在本發(fā)明中，發(fā)明人運用綠色熒光報告基因的JLTRG細胞在細胞培養(yǎng)和不斷量化的過程中，報告基因序列對于細胞系沒有任何影響；并且可以確定藥物的抑制濃度 (IC50)；用于實驗的準備和分析。此外，綠色熒光蛋白標記允許在一個最佳的時間點預(yù)審選擇陽性對照并用熒光顯微鏡進行數(shù)據(jù)采集。這些特性使系統(tǒng)非常靈活，快速，又便宜。由于其內(nèi)在的靈活性，以幾TRG細胞為基礎(chǔ)的報告系統(tǒng)提供了一個強大的工具，極大地方便了 HIV-I抑制劑的篩選。在發(fā)明過程中，發(fā)明人通過細胞共培養(yǎng)的方法，把JLTRG細胞與分泌HIV的H9細胞按照不同的比例在不同的共培養(yǎng)時間和血清濃度下，通過細胞流式儀和熒光顯微鏡檢測 JLTRG細胞的綠色熒光蛋白表達量，判斷JLTRG細胞受感染的程度，并選出感染的最佳細胞比例、共培養(yǎng)條件和最佳檢測時間?；谝陨系那捌诠ぷ?，發(fā)明人運用國際上公認的抗艾滋病有效的藥物(T20、EFV)和一種待檢測對于抗艾滋病是否有效的藥物(PTD)，通過以上選出的最佳條件結(jié)合藥物的半衰期方法檢測藥物的有效性及藥物的IC50。通過這種方法得到的結(jié)果與國際上發(fā)表的相關(guān)文獻結(jié)果對比，T20、EFV兩種藥物的作用效果和半數(shù)有效性與文獻報道是一致的，而另外一種藥物PTD在實驗過程中不同濃度下沒有顯示出統(tǒng)計學(xué)差異。同時也說明了本發(fā)明所研究的抗艾滋病藥物篩選技術(shù)是一種新型的抗艾滋病藥物篩選方法，并且具有耗時短、操作方便等優(yōu)點，在抗艾滋病藥物篩選領(lǐng)域開創(chuàng)了新的技術(shù)平臺。綜上所述，本發(fā)明通過攜帶GFP基因的T細胞與持續(xù)釋放HIV的H9細胞共培養(yǎng)， 較目前的抗艾滋病藥物篩選技術(shù)有以下幾個優(yōu)點(1)在整個共培養(yǎng)體系中，受HIV感染的細胞只占很小的比例，隨著時間的推移，HIV病毒的持續(xù)存在，靶細胞的不斷擴增，可以使這個系統(tǒng)更精確地評估抗艾滋病藥物的藥效。( 共培養(yǎng)體系為我們研究細胞與細胞間HIV 傳播提供了新的模型，比如由DC介導(dǎo)的HIV傳播。這兩大特點，共培養(yǎng)體系可以更加真實的模擬人體內(nèi)HIV的感染和傳播，使測到的藥物的藥效更加準確，體外的IC50更加接近人體內(nèi)的藥物半數(shù)有效量。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是幾了1 細胞與!19細胞按照不同的細胞比例共培養(yǎng)對!1，48!1，72!1，96!1后，細胞免疫熒光圖片(10X10)；圖2是JLTRG細胞與H9細胞在不同的細胞比例和共培養(yǎng)時間下，用流式細胞儀測定各組細胞的綠色熒光值，得出最佳的藥物篩選時間和細胞比例；圖2中的橫坐標為JLTRG細胞和H9細胞之間的不同比率(每個比率下，從左至由依次是MH、48H、72H、96H)，縱坐標表示綠色熒光細胞百分率和平均熒光強度的乘積，再除以90%的計算方法，得出糾正之后的細胞熒光值；(-)代表陰性對照；圖3是用不同的T20濃度與JLTRG細胞共撫育6小時后，JLTRG細胞與H9細胞按照10 1的細胞比例共培養(yǎng)72H后，細胞免疫熒光圖片(10X10)；圖4是用不同的T20濃度與JLTRG細胞共撫育6小時后，JLTRG細胞與H9細胞按照10 1的細胞比例共培養(yǎng)72H后，測定細胞綠色熒光值，可以得出T20半數(shù)有效量約為 IOnM ；圖5是用不同的PTD濃度與JLTRG細胞共撫育6小時后，JLTRG細胞與H9細胞按照10 1的細胞比例共培養(yǎng)72H后，細胞免疫熒光圖片(10X10)；圖6是用不同的PTD濃度與JLTRG細胞共撫育6小時后，JLTRG細胞與H9細胞按照 10 1的細胞比例共培養(yǎng)72H后，測定細胞綠色熒光值，可以得出PTD對于抑制HIV無效。圖7是用不同的EFV濃度與JLTRG細胞共撫育6小時后，JLTRG細胞與H9細胞按照10 1的細胞比例共培養(yǎng)72H后，細胞免疫熒光圖片(10X10)；圖8是用不同的EFV濃度與JLTRG細胞共撫育6小時后，JLTRG細胞與H9細胞按照10 1的細胞比例共培養(yǎng)72H后，測定細胞綠色熒光值，可以得出EFV的半數(shù)有效量約為 5nM。上述圖1、圖3、圖5和圖7中，左圖代表正常光鏡下細胞形態(tài)圖片；右圖代表與左圖相同細胞狀態(tài)下，細胞發(fā)出綠色熒光圖片；上述圖4、圖6和圖8中，橫坐標表示⑴為陽性對照，藥物的不同濃度，㈠為陰性對照；縱坐標綠色熒光細胞百分率和平均熒光強度的乘積，再除以90%的計算方法，得出糾正之后的細胞熒光值。
具體實施例方式實施例1、最佳細胞比例和最佳共培養(yǎng)條件的選擇(1)正常細胞培養(yǎng)(即能使細胞正常生長)JLTRG細胞和H9細胞，使用含10% FBS， 鏈霉素和青霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(即每升1640培養(yǎng)基內(nèi)加入IOOg的FBS、10g
的鏈霉素和IOg的青霉素)，細胞計數(shù)；一般，每2ml的含10% FBS, 1 %鏈霉素和1 %青霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)中懸浮數(shù)量為IO6的細胞。于37°C的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)箱中CO2的濃度(體積濃度)為5%，濕度(相對濕度)為75%。培養(yǎng)時間一般為對小時。(2)把JLTRG細胞和H9細胞按照不同的細胞比例(10 1,20 1,50 1， 100 1，為細胞數(shù)量之比)在5% FBS，1%鏈霉素和青霉素的1640培養(yǎng)基中共培養(yǎng)分別為M小時，48小時，72小時，96小時。于37°C的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%，濕度為75%。每2ml的5% FBS，1 %鏈霉素和青霉素的1640培養(yǎng)基中懸浮細胞數(shù)量為106。(3)在所設(shè)定的培養(yǎng)時間到后，收集細胞，用體積濃度為2%的多聚甲醛溶液固定后，在熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光強度和密度；同時，用細胞流式儀測定綠色熒光的表達情況(無需加入任何抗體)。說明JLTRG細胞在受到HIV(艾滋病病毒)感染后，會發(fā)出綠色熒光。我們用流式細胞儀測的綠色熒光的數(shù)值，受感染的細胞越多，綠色熒光值越高。(4)從細胞流式儀上獲得綠色熒光細胞百分率和平均熒光強度；通過綠色熒光細胞百分率和平均熒光強度的乘積，再除以90%的計算方法，得出糾正之后的細胞熒光值。根據(jù)圖1和圖2，我們得出把JLTRG細胞和H9細胞按照10 1的細胞比例，在5% FBS，鏈霉素和青霉素的1640培養(yǎng)基中共培養(yǎng)72小時為最佳共培養(yǎng)條件。(因為共培養(yǎng)96小時后，細胞的狀態(tài)有改變，衰老和死亡的細胞比較多，所以排除96小時是最佳時間。)實施例2、以三種現(xiàn)有的藥物(T20、EFV、PTD)為實驗檢測目標，確定本發(fā)明方法的實用性按照上面篩選出的實驗條件，JLTRG細胞和H9細胞按照10 1細胞比例，用5% FBS，1%鏈霉素和青霉素的1640培養(yǎng)基共培養(yǎng)細胞。(1)稀釋不同的藥物，T20 (0. 00015uM, 0. 0006uM, 0. 3uM, 0. 003uM, 0. 015uM, 0. 06uM)，PTD (1. 5uM. 0. 75uM, 0. 375uM, 0. 18，0. 09，0. 045uM)，EFV(0. 6uM, 0. 15um, 0. 03uM, 0. 006uM, 0. 0015,0. 0003uM)；均以RBO 1640培養(yǎng)基作為稀釋劑。(2)將上述不同濃度的3類藥物溶液與JLTRG細胞共撫育6小時，具體為各取上述不同濃度的3類藥物溶液1毫升各自放入一個培養(yǎng)皿小孔內(nèi)，然后在每個小孔內(nèi)各放入數(shù)量為IO6的JLTRG細胞，于37°C的細胞培養(yǎng)箱中進行撫育，細胞培養(yǎng)箱中(X)2的濃度為 5%，濕度為75% ；撫育時間為6小時。(3)在每1毫升的含有5% FBS、1%鏈霉素和青霉素的1640培養(yǎng)基中加入數(shù)量為IO5的H9細胞，得懸浮液；在步驟幻所得的每孔內(nèi)加入上述懸浮液，于37°C的細胞培養(yǎng)箱中進行共培養(yǎng) (即，培養(yǎng)基總體積為2ml)，細胞培養(yǎng)箱中(X)2的濃度為5%，濕度為75%;共培養(yǎng)的時間為 72小時。(4)在熒光顯微鏡下觀察步驟C3)所得的細胞綠色熒光強度和密度；同時，用細胞流式儀測定綠色熒光的表達情況，通過綠色熒光細胞百分率和平均熒光強度的乘積，再除以90%的計算方法，得出糾正之后的細胞熒光值。(5)、分別設(shè)置陽性對照和陰性對照以沒有加入藥物單純加入H9細胞的組為陽性對照，以沒有加入藥物也沒有加入H9細胞的組為陰性對照。陽性對照是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，這個實驗中的陽性對照是在沒有任何藥物作用下，H9細胞所釋放出來的病毒感染JLTRG細胞，所能達到的最大感染率，通過流式細胞儀可以測得綠色熒光值獲得。
陰性對照本次實驗中的陰性對照是單純的JLTRG細胞，因為自然界中一般細胞或多或少的都有一些自發(fā)熒光，為了去除本底。(6)、根據(jù)上述實驗結(jié)果測得待測藥物對抗艾滋病半數(shù)有效劑量。結(jié)果如下(1)、以共培養(yǎng)72小時，在JLTRG細胞與H9細胞10 1的細胞數(shù)量比例下，JLTRG 細胞的綠色熒光可以達最大數(shù)值。(2)以T20，EFV, PTD三種藥物為篩選藥物，通過上述方法測定它們的有效性和半數(shù)有效劑量，結(jié)果顯示T20，EFV對于抗HIV有效，IC50約為IOnM和5nM，這與相關(guān)文獻報道一致。另外PTD藥物顯示抗HIV無效。注T20、EFV和PTD的半數(shù)有效劑量是分別根據(jù)圖4、圖6和圖8的熒光數(shù)值圖形， 數(shù)值下降一半所得出。為了證明本發(fā)明的正確性，發(fā)明人設(shè)置了如下對比實驗PM抗原檢測是目前世界范圍內(nèi)診斷早期艾滋病病毒感染的一種方法。艾滋病病毒感染者多數(shù)在感染2-12周才出現(xiàn)艾滋病病毒抗體，抗體出現(xiàn)之前的這個時期稱為窗口期。在窗口期，艾滋病病毒抗體是檢測不到的。PM抗原的檢測有助于多數(shù)急性感染者血清艾滋病病毒抗體陽轉(zhuǎn)之前的論斷，大約可以使抗體窗口期縮短1周，因為從感染到檢出PM 抗體只需1周時間。但由于不是所有新近感染者都可以出現(xiàn)PM抗原，加上該項檢測費用較高，所以一般不作為常規(guī)診斷項目。本實驗中，我們運用HIV PM抗原進行熒光定量PCR 的方法來確定標本中HIV的病毒載量，是否跟實驗結(jié)果一致。結(jié)果如表1所示。表 權(quán)利要求
1.抗艾滋病藥物篩選方法，其特征是包括以下步驟1)、將待測藥物稀釋成不同濃度的藥物溶液；2)、將上述不同濃度的藥物溶液1毫升各自放入一個培養(yǎng)皿小孔內(nèi)，然后在每個小孔內(nèi)各放入數(shù)量為IO6的JLTRG細胞，于36. 8^37. 2°C的細胞培養(yǎng)箱中進行撫育，細胞培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%，濕度為75%，撫育時間為5 7小時；3)、在1毫升的含有5%FBS、1%鏈霉素和1%青霉素的1640培養(yǎng)基中加入數(shù)量為IO5的 H9細胞，得懸浮液；在步驟2)所得的每孔內(nèi)加入上述懸浮液，于36. 8^37. 2 V的細胞培養(yǎng)箱中進行共培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)箱中(X)2的濃度為5%，濕度為75% ；共培養(yǎng)的時間為68 76小時；4)、在熒光顯微鏡下觀察步驟3)所得的細胞綠色熒光強度和密度；用細胞流式儀測定綠色熒光的表達情況，通過綠色熒光細胞百分率和平均熒光強度的乘積，再除以90%的計算方法，得出糾正之后的細胞熒光值；5)、分別設(shè)置陽性對照和陰性對照以沒有加入藥物單純加入H9細胞的組為陽性對照，以沒有加入藥物也沒有加入H9細胞的組為陰性對照；6)、根據(jù)上述實驗結(jié)果測得待測藥物對抗艾滋病半數(shù)有效劑量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗艾滋病藥物篩選方法，包括以下步驟1)將待測藥物稀釋成不同濃度的藥物溶液；2)將JLTRG細胞放入上述藥物溶液中進行撫育；3)加入含有5%FBS、1%鏈霉素和1%青霉素的1640培養(yǎng)基以及H9細胞進行共培養(yǎng)；4)用細胞流式儀測定綠色熒光的表達情況，根據(jù)綠色熒光細胞百分率和平均熒光強度得出糾正之后的細胞熒光值；5)分別設(shè)置陽性對照和陰性對照；6)根據(jù)上述實驗結(jié)果測得待測藥物對抗艾滋病半數(shù)有效劑量。采用本發(fā)明的方法能快速有效的完成抗艾滋病藥物的篩選。
文檔編號C12Q1/18GK102174658SQ20111002178
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月15日
發(fā)明者馮婷婷, 吳南屏, 王英杰 申請人:浙江大學(xué)