專利名稱：一種化合物在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化工領(lǐng)域及醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種化合物在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
親環(huán)素Cycliphilins (CyPs)是普遍分布的細胞內(nèi)蛋白，在植物、細菌和哺乳 動物中均存在，具有高度保守性，最初是作為環(huán)孢素A的細胞受體被發(fā)現(xiàn)的。環(huán) 孢素A (CyclosporinA， CsA)是從真菌代謝產(chǎn)物中分離得到的含11個氨基酸的 環(huán)狀多肽，作為免疫抑制劑藥物在臨床上常用于治療器官移植后所產(chǎn)生的排斥反 應(yīng)及自身免疫系統(tǒng)疾病。目前已發(fā)現(xiàn)和克隆的CyPs有130多種異構(gòu)體[Galat A，Metcalfe SM. Peptidyl proline cis-trans iso-merases. Prog Biophys Molec Biol, 1995; 63:67.]，它們構(gòu)成了 Cyclophilins家族。CyPs具有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase) 活性，催化蛋白質(zhì)折疊過程，尤其是富含脯氨酸的蛋白質(zhì)折疊，并且起著分子伴 侶作用[Ivery MT, Immunophilins:switched on protein binding domains Med Res Rev. 2000;20(6):452-484.]。與此同時，CyPs也廣泛參與相關(guān)的生物學過程如細胞凋亡 [Lee JP,Palfrey HC,Bindokas VP, et al. The role of immunophilins in mutant superoxide dismutas-l linked familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96(6):3251-3256.]和細胞間信號傳導[Jin ZJ,Melaragno MQLiao DF,et al. Cyclophilin A is a secreted growth factor induced by oxidative stress. Circ Res. 2000; 87(外789-796,]等。
有許多研究顯示，CyPA能夠與人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的Gag多聚蛋白 (Gagpolyprotein)結(jié)合。這種結(jié)合使得CypA能夠被特異地包裝到HIV-1病毒體 中，而不被包裝到其它逆轉(zhuǎn)錄病毒中[Franke EK， Yuan HE， Luban J. Specific incorporation of cyclophilin A into HIV-1 virions. Nature. 1994; 372(6504》359-362.]。' 在HIV-1型病毒自組裝過程中，CyPA作為特定的組成部分進入病毒，在HIV-1 感染細胞的早期階段發(fā)揮作用[Braaten D, Franke EK, Luban J. Cyclophilin A is required for an early step in the life cycle of human immunodeficiency virus type 1 before the initiation of reverse transcription. J Virol. 1996; 70(6):3551-3560.]。 CypA與
Gag的互作位點目前己經(jīng)被確定在Gag的N端CA結(jié)構(gòu)域(該結(jié)構(gòu)域在HIV-l成 熟后經(jīng)過切割成為p24外殼蛋白)，CypA的脯氨酸異構(gòu)酶活性能夠協(xié)助病毒完成 感染細胞后的脫衣殼過程[Gamble TR， Vajdos FF, Yoo S, Worthylake DK, Houseweart M， Sundquist WI， Hill CP. Crystal structure of human cyclophilin A bound to the ammo-terminal domain of HIV-l capsid. Cell. 1996; 87(7): 1285-1294,]。使用 RNAi技術(shù)沉默CypA的表達[Bmaten D， Luban J. Cyclophilin A regulates HIV-l infectivity, as demonstrated by gene targeting in human T cells. EMBO J. 2001; 20(6): 1300-1309; Sokolskaja E, Sayah DM, Luban J. Target cell cyclophilin A modulates human immunodeficiency virus type 1 infectivity. J Virol. 2004; 78(23): 12800-12808.]，或者使用CsA及其衍生物[Sokolskaja E， Sayah DM, Luban J. Target cell cyclophilin A modulates human immunodeficiency virus type 1 infectivity. J Virol. 2004; 78(23): 12800-12808.; Bartz SR, Hohenwalter E, Hu MK， Rich DH, Malkovsky M. Inhibition of human immunodeficiency virus replication by nonimmunosuppressive analogs of cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92(12):5381-5385.; Steinkasserer A， Harrison R， Billich A, Hammerschmid F， Werner G Wolff B， Peichl P， Palfi Q Schnitzel W， Mlynar E, et al. Mode of action of SDZ NIM 811, a nonimmunosuppressive cyclosporin A analog with activity against human immunodeficiency virus type 1 (HIV-l): interference with early and late events in HIV-l replication. J Virol. 1995; 69(2):814-824.]來抑制CypA的活性，均能干擾 HIV-l病毒的復制。
然而，到目前為止，尚未有人報道具有抗HIV病毒的CypA抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種化合 制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)如<formula>formula see original document page 4</formula>
的分子在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用；其中，R, = 3，4-二甲基-苯基，1,3-二
氫-苯并呋喃-5-基或者2，3-二氫-lH-茚-5-基；R2 =環(huán)丙基，環(huán)己基，t-丁基，環(huán)
戊烷基或者異丙基。本發(fā)明還包括對上述化合物進行常規(guī)替代所得到的化合物，
本發(fā)明統(tǒng)稱為FD8。
本發(fā)明中，R!可以是2,3-二氫-lH-茚-5-基。
本發(fā)明中，R2可以為環(huán)戊垸基。
本發(fā)明的一個實施例中，R,是2，3-二氫-lH-茚-5-基，R2為環(huán)戊烷基，這樣本 發(fā)明的化合物就成為N-[4-(N-(5-[(2,3-z:氫-lH-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰肼 基) 苯基] 環(huán)戊烷甲酰胺 (即 N-[4-(N- ■{ 5-[(2,3-dihydro-1 H-inden-5-yloxy)methyl]-2-fUroyl} ethanehydrazonoyl) phenyl] cyclopentanecarboxamide ) ， 也 可 稱 為 S—IXZ^-dihydro-l/f-inden-S-yloxjOmethyU-A^-IXlZ).:!- (4-cyclopentanecarboxamide)-phenylethylidene]-2 —fiirohydrazide， 5-[(2,3-二氫-1//-茚-5-氧)甲基]-^-[(12)-1- (4-環(huán) 戊垸甲酰胺基)-苯基亞乙基]-2-呋喃酰肼，其分子量為524.62，結(jié)構(gòu)式為
鑒于抑制CypA活性的物質(zhì)可能干擾HIV-1病毒的復制，本發(fā)明針對CypA 的活性位點設(shè)計了若干小分子抑制劑。由于是針對細胞靶點設(shè)計的藥物，而細胞 靶點相對于病毒靶點來說突變速率相對較慢，因此不易形成耐藥性，適合AIDS 患者終身用藥的需求。
首先，本發(fā)明對CypA小分子抑制劑進行了虛擬篩選。
Cyclophilin A (CypA, PPIA)基因在人類基因組數(shù)據(jù)庫中己經(jīng)被登錄，其錄入 號為NMJ)21130。在PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中，檢索到了人類CypA蛋白的X光 衍射晶體結(jié)構(gòu)(PDB代碼1CWA)。這個結(jié)構(gòu)是CypA與其天然抑制劑環(huán)孢菌素 A (CsA)的復合物晶體結(jié)構(gòu)。從這個結(jié)構(gòu)中，確定了CypA的活性位點，并且確 定了活性位點中，能夠被CsA所抑制的若干關(guān)鍵氨基酸位點。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)信息， 本發(fā)明針對CypA活性位點，對若干小分子數(shù)據(jù)庫進行了篩選。用于篩選的小分 子數(shù)據(jù)庫主要包括SPECS和CNPD,最后篩選到了本發(fā)明的FD8。整個計算過程 是在中科院上海藥物所64CPU-SGI ORIGN3800計算機和上海超算中心392CPU-神威I超級計算機上進行的。
其次，本發(fā)明利用BIAcore分子互作儀驗證虛擬篩選結(jié)果
BIAcore分子互作儀是基于表面等離子共振技術(shù)來實現(xiàn)跟蹤生物分子間的相 萬.作用，無需任何標記物，因此最大限度的保證了實驗結(jié)果的真實性。實驗時， 將目的生物分子(CypA蛋白)固定在傳感芯片表面，然后將小分子化合物溶于溶 劑并且流過芯片表面。監(jiān)測器能實時跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面目的生物 分子結(jié)合、解離整個過程的變化。通過BIAcore的結(jié)合數(shù)據(jù)，我們最終確定了 12 個能夠與CypA發(fā)生結(jié)合的小分子化合物，并且計算出了這些小分子化合物與 CypA結(jié)合的平衡一解離常數(shù)KD。本發(fā)明的N-[4-(N-(5-[(2，3-二氫-lH-茚-5-基氧) 甲基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺其平衡解離常數(shù)KD (M)為 KD=8.42±0.13x10.6， Chi2=0.263;而CsA為KD=2.18±0,36xl()-7， Chi2=0.232。其中， On2是BIAcore統(tǒng)計軟件中用于檢測實驗誤差的一個數(shù)據(jù)。
再次，本發(fā)明利用酶活實驗證明小分子化合物對CypA酶活抑制的能力，從 而尋找出CypA的抑制劑。
測定CyP活性的方法很多，但以a -胰凝乳蛋白酶活性測定法(a -chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物，如 N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe對硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide) 在溶液中其順式、反式結(jié)構(gòu)處于平衡，CyP能催化該底物發(fā)生順反異構(gòu)作用，即 催化脯氨酸由順式變?yōu)榉词?；當其處于反式結(jié)構(gòu)時，C端p-nitroanilide被a-胰凝 乳蛋白酶裂解，釋放出色素基團對硝基苯胺，在390nm連續(xù)測定吸光值的變化即 可得知CyP的PPIase活性。
我們以不加小分子抑制劑的反應(yīng)作為對照反應(yīng)，測定各個小分子配體在不同 濃度下對酶活反應(yīng)的抑制率，從而計算出各個小分子配體的ICso值。本發(fā)明的 N-[4—(N^5-[(2，3-二氫-lH-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯基]環(huán)戊烷甲 酰胺，其酶活抑制ICso值(pM)為18.67±1.74，例如，16.84、 18.86或者20.3。
最后，本發(fā)明還測定了 CypA小分子抑制劑對HIV—l病毒復制的影響
化合物抗HIV-1病毒增值測試簡單的說，就是利用雙抗夾心法測定每個孔 內(nèi)p24蛋白產(chǎn)生的量。以空白對照孔的光吸收值為參照，計算各個化合物抑制
HIV-1病毒p24蛋白產(chǎn)生的IC5o值。結(jié)果N-[4-(N-(5-[(2，3-二氫-lH-茚-5-基氧)甲 基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯基]環(huán)戊垸甲酰胺抑制HIV-l病毒p24蛋白產(chǎn)生的IC50 值(ug/ml)為22,92±9.06?？梢?，N-[4-(N-(5-[(2,3-二氫-lH-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺具有抑制HIV—1病毒復制的能力，可以 作為新的抗艾滋病藥物進行開發(fā)。
本發(fā)明的小分子化合物可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。例如，采用人工 化學合成的方法。
利用本發(fā)明小分子化合物，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與FD8發(fā)生相 5作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明及其抑制劑、拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同 的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體 介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物 質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑 進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人FD8為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯(lián)用。這 類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載 體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥 物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人FD8可以被制成針劑形式，例如用生 理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠 囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片 劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1 微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的FD8還可與其他治療劑一 起使用。
本發(fā)明的人FD8在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用中，可以是針劑或者片劑。 當本發(fā)明的人FD8多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于 哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情 況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千 克體重。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟 練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
艾滋病(AIDS)是一種由艾滋病病毒，即人體免疫缺陷病毒(human
immunodeficiencyvirus，簡稱HIV)侵入人體后破壞人體免疫功能，使人體發(fā)生多 種不可治愈的感染和腫瘤，最后導致被感染者死亡的一種嚴重傳染病。被稱為"當 代瘟疫"和"超級癌癥"的艾滋病已引起世界衛(wèi)生組織(WHO)及各國政府的高度重 視，無論是人員和經(jīng)費的投入均放在首位，我國已將其列入乙類法定傳染病，并 為國境衛(wèi)生監(jiān)測傳染病之一。然而，到目前為止，尚無可以治愈該病的有效藥物。 本發(fā)明的小分子化合物FD8具有抑制HIV—1病毒復制的能力，而且是針對細胞 靶點設(shè)計的藥物，不易形成耐藥性，適合AIDS患者終身用藥的需求。因此，本 發(fā)明的FD8可以作為新的抗艾滋病藥物進行開發(fā)，為治療和治愈艾滋病提供了 -種新的途徑和手段。
具體實施例方式
實施例1 CypA小分子抑制劑的虛擬篩選
Cyclophilin A (CypA, PPIA)基因在人類基因組數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)被登錄，其錄入 號為NM—021130。在PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中，我們檢索到了人類CypA蛋白的X 光衍射晶體結(jié)構(gòu)(PDB代碼1CWA)。這個結(jié)構(gòu)是CypA與其天然抑制劑環(huán)孢菌 素A (CsA)的復合物晶體結(jié)構(gòu)。從這個結(jié)構(gòu)中，我們確定了CypA的活性位點， 并且確定了活性位點中，能夠被CsA所抑制的若干關(guān)鍵氨基酸位點。根據(jù)這些結(jié) 構(gòu)信息，我們與中國科學院上海藥物所合作，針對CypA活性位點，對若干小分 子數(shù)據(jù)庫進行了篩選。用于篩選的小分子數(shù)據(jù)庫主要包括SPECS和CNPD。最后 篩選到了本發(fā)明的FD8。整個計算過程是在中科院上海藥物所64CPU-SGI ORIGN3800計算機和上海超算中心392CPU-神威I超級計算機上進行的。
實施例2利用BIAcore分子互作儀驗證虛擬篩選結(jié)果
BlAcore分子互作儀是基于表面等離子共振技術(shù)來實現(xiàn)跟蹤生物分子間的相 互作用，無需任何標記物，因此最大限度的保證了實驗結(jié)果的真實性。實驗時， 將目的生物分子(CypA蛋白)固定在傳感芯片表面，然后將小分子化合物溶于溶 劑并且流過芯片表面。監(jiān)測器能實時跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面目的生物 分子結(jié)合、解離整個過程的變化。通過BIAcore的結(jié)合數(shù)據(jù)，我們最終確定了 12 個能夠與CypA發(fā)生結(jié)合的小分子化合物，并且計算出了這些小分子化合物與 CypA結(jié)合的平衡一解離常數(shù)KD。本發(fā)明的本發(fā)明的^[4-(^{5-[(2,3-二氫-111-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺其平衡解離常數(shù)KD
(M)為KD=8.42±0.13xl(T6, Chi2=0.263。其中，Chi2是BIAcore統(tǒng)計軟件中用于 檢測實驗誤差的一個數(shù)據(jù)。
實施例3利用酶活實驗證明小分子化合物對CypA酶活抑制的能力 測定CyP活性的方法很多，但以a -胰凝乳蛋白酶活性測定法(a -chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。
我們以不加小分子抑制劑的反應(yīng)作為對照反應(yīng)，測定各個小分子配體在不 同濃度下對酶活反應(yīng)的抑制率，從而計算出各個小分子配體的IC50值。本發(fā)明的 N-[4-(N-(5-[(2,3-:i氫-lH-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯基]環(huán)戊烷 甲酰胺(CHEMCATS Order Number: AK-968/15604391 )。其酶活抑制IC50值 (,)為18.67土1.74，例如，16.84、 18.86或者20.3。
實施例4化合物抗HIV-1病毒增值測試
MT-2細胞種于96孔板中，每孔104個。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。HIV-1病毒以100個50%組織感染當量來感染細胞，同時加入不同 濃度梯度的化合物培養(yǎng)過夜(以不加化合物的孔為空白對照)。次日，更換不含小 分子化合物的新鮮培養(yǎng)基。第四天，取100uL培養(yǎng)液上清，加入5%體積的Triton 一X100處理后得到病毒裂解液，然后用ELISA方法測定p24蛋白含量(p24是 HIV-1的外殼蛋白，可以作為衡量病毒粒子數(shù)量的指標)。簡單的說，就是利用雙 抗夾心法測定每個孔內(nèi)p24蛋白產(chǎn)生的量。將抗HIV免疫球蛋白包板過夜(pH 9.6 碳酸緩沖液，4°C)，然后加入含4X脫脂奶粉的PBS封閉；加入100uL病毒裂解 液后于37°C孵育1個小時，用預(yù)冷PBS沖洗若干次；加入辣根過氧化物酶標記 的抗p24單克隆抗體，用TMB顯色一刻鐘；然后加入IN的硫酸溶液終止反應(yīng)， 在酶標儀上讀取450nm時的光吸收值。以空白對照孔的光吸收值為參照，計算各 個化合物抑制HIV-1病毒p24蛋白產(chǎn)生的IC50值。
結(jié)果N-[4-(N-(5-[(2,3-二氫-lH-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯 基]環(huán)戊烷甲酰胺抑制HIV-1病毒p24蛋白產(chǎn)生的IC50值如下(ug/ml): FD8 =22.92±9.06。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)如的分子的應(yīng)用，其特征是在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用；其中，R1＝3，4-二甲基-苯基，1，3-二氫-苯并呋喃-5-基或者2，3-二氫-1H-茚-5-基；R2＝環(huán)丙基，環(huán)己基，t-丁基，環(huán)戊烷基或者異丙基。
2. 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于，R,為2，3-二氫-1H-茚-5-基。
3. 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于，R2為環(huán)戊垸基。
4. 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于，該抗艾滋病藥物為針劑或者片劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及化工領(lǐng)域，涉及一種具有抗HIV活性的小分子化合物，其制備方法及應(yīng)用。CyPA能夠與人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的Gag多聚蛋白結(jié)合。使用RNAi技術(shù)沉默CypA或者抑制CypA的活性，均能干擾HIV-1病毒的復制。本發(fā)明的小分子化合物是CyPA抑制劑，具有抗HIV-1病毒的功能，而且本發(fā)明的小分子化合物是針對細胞靶點設(shè)計的，不易形成耐藥性，適合AIDS患者終身用藥的需求。因此，本發(fā)明的小分子化合物可以作為新的抗艾滋病藥物進行開發(fā)，為治療和治愈艾滋病提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號A61P31/00GK101108177SQ200610029170
公開日2008年1月23日 申請日期2006年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月20日
發(fā)明者龍 余, 唐麗莎, 蔣華良, 趙雪梅, 帥 陳 申請人:復旦大學