專(zhuān)利名稱(chēng)：山羊顆粒凍精稀釋液的制作方法
山羊顆粒凍精稀釋液 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于保存山羊顆粒凍精的稀釋液。 [背景技術(shù)]精液冷凍保存技術(shù)，就是將精子置于超低溫環(huán)境中，使其新陳代謝幾乎停止，升溫后又恢復(fù)受精能力。該技術(shù)是人工授精技術(shù)的一大革新，具有很明顯的優(yōu)勢(shì)可以不受時(shí)間、地域和種公畜年限的限制，發(fā)揮和提高優(yōu)良種公畜的利用率，加速品種的改良步伐。山羊精液冷凍保存技術(shù)的研究始于50年代。直到20世紀(jì)60年代，一些國(guó)家才開(kāi)始應(yīng)用羊凍精進(jìn)行人工授精試驗(yàn)。J. M. Corteel報(bào)道，在非繁殖季節(jié)，利用同期發(fā)情技術(shù)，對(duì)同期發(fā)情效果較好的一千多只母羊進(jìn)行冷凍精液的人工授精，獲得了 38. 7%的分娩率。這是關(guān)于羊的冷凍精液技術(shù)人工授精結(jié)果較早的報(bào)道。90年代以來(lái)，山羊凍精制作和應(yīng)用的研究，雖然取得了一定成績(jī)，但存在的問(wèn)題也很多，特別是沒(méi)有有效地把受胎率穩(wěn)定在50%以上，說(shuō)明這一方面的研究還有待取得更大的突破。山羊的精液保存是一個(gè)復(fù)雜的物理化學(xué)過(guò)程，稀釋液的組成成分、滲透壓、PH值及精液的稀釋倍數(shù)、保存溫度對(duì)精液的保存效果都有重要的影響。目前，在精液冷凍稀釋液中，其主要成分可以劃分為緩沖劑、營(yíng)養(yǎng)劑、抗冷凍劑以及添加劑四個(gè)組成部分。目前報(bào)道的精液稀釋液配方，按緩沖劑、營(yíng)養(yǎng)劑、抗冷凍劑以及添加劑四個(gè)組成部分主要有以下幾種檸檬酸鈉-糖類(lèi)-甘油-卵黃、Tris-檸檬酸-糖類(lèi)-甘油-卵黃、 EDTA-檸檬酸鈉-糖類(lèi)-甘油-卵黃和Tris-檸檬酸-糖類(lèi)-甘油-卵黃，但各自對(duì)精子的冷凍保護(hù)效果，不同的研究者結(jié)論不同，差異較大，未形成定論。到目前為止，尚未形成公認(rèn)的最適技術(shù)參數(shù)，因此，人們對(duì)其仍在不斷的優(yōu)化和提高。山羊精液在凍前的平均損傷率為19. 4%，凍后平均損傷率為17. 1%。由此可見(jiàn)山羊精液在凍前和凍后損傷較大。因此，就降低精子損傷率而言，我們有必要對(duì)冷凍精液的稀釋液配方進(jìn)行研究和改進(jìn)。在受胎率方面，目前，我國(guó)山羊凍精的受胎率為45. 5 60%。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于保存安徽白山羊顆粒凍精的稀釋液，其可提高山羊顆粒凍精的品質(zhì)，相應(yīng)提高山羊凍精的受胎率。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種用于保存山羊顆粒凍精的稀釋液，所述的稀釋液由葡萄糖3. Og,檸檬酸鈉1. 6g，甘油5ml，卵黃20ml，羥乙基哌嗪乙磺酸1. 6g，二甲基甲酰胺Iml，十二烷基硫酸鈉0. Ig,青霉素10IU，鏈霉素10IU，并用蒸餾水將上述物質(zhì)定溶至IOOml組成。山羊的精液保存是一個(gè)復(fù)雜的物理化學(xué)過(guò)程，稀釋液的組成成分、滲透壓、PH值及精液的稀釋倍數(shù)、保存溫度對(duì)精液的保存效果都有重要的影響。目前，在精液冷凍稀釋液中，其主要成分可以劃分為營(yíng)養(yǎng)劑、緩沖劑、抗冷凍劑以及其他添加劑四個(gè)組成部分。緩沖劑作為冷凍稀釋液的重要組成部分，對(duì)于精液冷凍的效果發(fā)揮著重要作用。檸檬酸鈉無(wú)毒性、具有PH調(diào)節(jié)性能及良好的穩(wěn)定性。檸檬酸鹽離子容易與鈣結(jié)合，所以在鈣離子的情況下不能使用。羥乙基哌嗪乙磺酸作為一種緩沖劑，受外界因素影響小，緩沖功能強(qiáng)大，并且不易形成緩沖劑-金屬離子復(fù)合物。本發(fā)明將檸檬酸鈉和兩性離子羥乙基哌嗪乙磺酸的組合添加于稀釋液中達(dá)到了很好的效果?？箖鰟┦蔷豪鋬鱿♂屢褐胁豢扇鄙俚牟糠?，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。相對(duì)于非滲透性抗凍劑而言，滲透性抗凍劑的作用又更加重要。目前，最常用的滲透性抗凍劑是甘油。甘油對(duì)于精液冷凍過(guò)程中的精子具有很好的保護(hù)作用，但也存在缺點(diǎn)，一是甘油對(duì)精子有毒性作用，會(huì)影響凍后精液的存活時(shí)間；二是可能具有抑制受孕的負(fù)作用。二甲基甲酰胺 (DMF)屬于一種低分子量酰胺類(lèi)化合物，分子量為73. 1，能夠通過(guò)滲入精細(xì)胞內(nèi)，平衡精細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，降低其冰點(diǎn)而起保護(hù)作用。與甘油相比，二甲基甲酰胺的分子量小，更容易穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到精子內(nèi)部，但其缺點(diǎn)是粘性小，抑制水結(jié)晶能力較弱，并且也具有一定毒性。因此，本發(fā)明以二甲基甲酰胺和甘油組成一種混合冷凍保護(hù)劑，得到更加有效的山羊精液冷凍稀釋液配方。十二烷基硫酸鈉(SDS)是一類(lèi)表面活性劑，對(duì)精子膜結(jié)構(gòu)有保護(hù)、修補(bǔ)作用，提高解凍后精液的活力、質(zhì)膜完整率及存活率。在本發(fā)明中，添加適當(dāng)?shù)氖榛蛩徕c對(duì)于冷凍精液品質(zhì)有顯著的改善(P <0.05)。因此，不管十二烷基硫酸鈉是自身作用于精膜起到抗冷凍效果還是通過(guò)作用于卵黃間接作用于精膜，十二烷基硫酸鈉對(duì)于冷凍精液的確實(shí)起到了保護(hù)作用。本發(fā)明的有益效果是，在常規(guī)的冷凍精液稀釋液中加入羥乙基哌嗪乙磺酸、二甲基甲酰胺和十二烷基硫酸鈉，組成如下配方100ml稀釋液中含葡萄糖3. 0g，檸檬酸鈉 1.6g，羥乙基哌嗪乙磺酸1.6g，甘油5ml，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸鈉0. lg，卵黃 20ml。經(jīng)檢測(cè)，采用上述稀釋液配方制作的安徽白山羊顆粒凍精復(fù)蘇活力達(dá)到0. 65，用該配方制作的顆粒凍精對(duì)55只發(fā)情正常的安徽白山羊進(jìn)行人工授精實(shí)驗(yàn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)人工授精受胎率為76. 4%。由此可見(jiàn)，該配方制作的冷凍精液具有較好的實(shí)際應(yīng)用效果。本實(shí)施例所使用的材料、試劑及其來(lái)源1)材料采精公羊安徽白山羊，6只，2 3歲，體質(zhì)健壯，繁殖性能良好；合肥博大牧業(yè)科技公司種羊場(chǎng)提供；采精公羊飼養(yǎng)管理舍飼，每天戶(hù)外運(yùn)動(dòng)4h 他；日糧精料0. 75kg/ d ·只，干花生秧、青綠飼料自由采食，采精期補(bǔ)喂雞蛋4枚/d ·只。2)主要器材精子品質(zhì)自動(dòng)分析儀(南寧松景天倫生物科技有限公司，CASA，Windows XP)； 生物光學(xué)顯微鏡(XSJ-2型，重慶光學(xué)儀器廠(chǎng))；相差顯微鏡(Olympus，日本)；滲透壓計(jì) (ADVANCED，美國(guó))；精密PH計(jì)(上海雙贏科學(xué)儀器有限公司)；液氮灌(北京信康億達(dá)科技發(fā)展有限公司)。3)主要試劑葡萄糖(Sigma公司)、檸檬酸納(Na3C6H5O7. 2H20,上海試劑公司)、羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(h印es，Sigma公司)、甘油(天津市化學(xué)試劑三廠(chǎng))、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF，沈陽(yáng)市試劑三廠(chǎng))、十二烷基磺酸鈉(SDS，上海雙龍化學(xué)品廠(chǎng))、卵黃(雞蛋黃，本地)、青霉素、鏈霉素(上海新亞藥業(yè)有限公司)。本實(shí)施例具體做法如下1稀釋液配制將表1所列各組分物質(zhì)用蒸餾水定溶至IOOml配制成稀釋液。表 權(quán)利要求
1. 一種用于保存山羊顆粒凍精的稀釋液，其特征在于，所述的稀釋液由葡萄糖3. 0g， 檸檬酸鈉1.6g，甘油5ml，卵黃20ml，羥乙基哌嗪乙磺酸1.6g，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸鈉0. lg，青霉素10IU，鏈霉素10IU，并用蒸餾水將上述物質(zhì)定溶至IOOml組成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于保存山羊顆粒凍精的稀釋液，所述的稀釋液由葡萄糖3.0g，檸檬酸鈉1.6g，甘油5ml，卵黃20ml，羥乙基哌嗪乙磺酸1.6g，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸鈉0.1g，青霉素10IU，鏈霉素10IU，并用蒸餾水將上述物質(zhì)定溶至100ml組成。本發(fā)明在常規(guī)的冷凍精液稀釋液中加入羥乙基哌嗪乙磺酸、二甲基甲酰胺和十二烷基硫酸鈉，組成優(yōu)化配方；經(jīng)檢測(cè)，采用優(yōu)化的稀釋液配方制作的安徽白山羊顆粒凍精復(fù)蘇活力達(dá)到0.65，通過(guò)用該配方制作的顆粒凍精對(duì)55只發(fā)情正常的安徽白山羊進(jìn)行人工授精實(shí)驗(yàn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)人工授精受胎率為76.4％。由此可見(jiàn)，該配方制作的冷凍精液具有較好的實(shí)際應(yīng)用效果。
文檔編號(hào)C12N5/076GK102586178SQ20111000119
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者丁建平, 任春環(huán), 凌英會(huì), 孫志輝, 張子軍, 張曉東, 張育軍, 張運(yùn)海, 李運(yùn)生, 章孝斌, 章孝榮, 阮崇美, 陳澤文 申請(qǐng)人:合肥博大牧業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司, 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)