專利名稱：治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療劑，特別是，但不僅僅是用于治療涉及增殖性免疫應(yīng)答(proliferative immune response)的疾病的治療劑。
背景技術(shù)：
WO 97/02839涉及病毒抑制，病毒感染的治療和預(yù)防。它提供用于生產(chǎn)治療患者內(nèi)病毒感染的中和抗體的方法，其包含步驟a.將哺乳動(dòng)物暴露于病毒以使所述哺乳動(dòng)物生產(chǎn)針對(duì)所述病毒的中和抗體，和b.從所述哺乳動(dòng)物收集所述中和抗體。
在實(shí)施例中，通過將HIV病毒與從山羊獲得的HIV中和抗體混合獲得命名為AAV2的HIV疫苗。
WO 01/60156涉及中和抗體和免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)組合物。它提供一種免疫調(diào)節(jié)組合物，其包含對(duì)抗原特異的異種抗體；和抗原，其中為了與藥用載體結(jié)合所述異種抗體與抗原形成復(fù)合體。
實(shí)施例與WO 97/02839類似，再次通過將HIV病毒與從山羊獲得的HIV中和抗體混合獲得命名為AAV2的HIV疫苗。
WO 02/07760涉及一種治療劑。它提供預(yù)防HIV感染或治療感染HIV的個(gè)體的方法，其包含下列步驟(1)將山羊免疫系統(tǒng)暴露于治療劑；(2)在HIV攻擊后純化來源于山羊的抗體；和(3)用在上面步驟2中獲得的抗體治療個(gè)體。
在基于WO 02/07760的抗體產(chǎn)品的初步臨床實(shí)驗(yàn)中，使用來自用HIV攻擊后的山羊的血清已經(jīng)成功地治療了HIV患者。
優(yōu)選治療使用一種血清組合物，其可以通過包括以下的方法獲得在山羊中產(chǎn)生(raise)有效抗體，從山羊中抽血，證明所抽血中的HIV中和能力，從血液中去除固體，使用過飽和的硫酸銨或其它適當(dāng)?shù)某恋韯┏恋砉腆w，分離沉淀，將沉淀溶解于適當(dāng)?shù)乃橘|(zhì)中，并用5-50,000道爾頓，優(yōu)選7-30,000道爾頓，更優(yōu)選8,500-15,000道爾頓，特別是大約10,000道爾頓的截止透析溶液。山羊免疫的方法可以是肌內(nèi)的，但也可以使用其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如皮下或皮內(nèi)給藥。通過其它常規(guī)使用的分級(jí)作用方法(例如辛酸)也可以完成純化過程，條件是使用總殘?jiān)?br> 更具體地，治療典型地使用以下列方式獲得的山羊血清。生產(chǎn)山羊血清的實(shí)例使用濃度為109個(gè)病毒顆粒/ml的HIV-3b的肌肉注射，通過肌肉注射給山羊接種懸浮在常規(guī)商用上清液中的溶解的HIV3b病毒。在60℃下預(yù)先熱殺病毒30分鐘。在適當(dāng)?shù)拈g隔如兩周后，抽取血樣用于初始評(píng)估。在優(yōu)選方法中，每周給山羊注射共4周，然后在6周時(shí)將動(dòng)物放血以獲得試劑。
在無菌操作下從山羊抽取約400cc血液。削刮和用聚維酮碘(betadine)準(zhǔn)備用于針提取的區(qū)域。使用18號(hào)的針從動(dòng)物抽取約400cc的血液。值得注意的是動(dòng)物可以忍受約400cc的抽血而動(dòng)物不遭受任何不適作用。動(dòng)物不一定必須犧牲。在它補(bǔ)充它的血量后大約10-14天內(nèi)可以將動(dòng)物再放血。
證實(shí)可能有效抗體的存在。一旦證實(shí)該試劑的存在，在4-6周之間從山羊上采血，并離心分離血清。然后過濾300ml血清以去除大的凝塊和顆粒物質(zhì)。然后用過飽和的硫酸銨(室溫下45％的溶液)處理血清以沉淀抗體和其它物質(zhì)。在5000rpm下將產(chǎn)生的溶液離心5分鐘，此后除去上清液。將沉淀的免疫球蛋白重懸浮于足以再增溶沉淀的磷酸鹽緩沖鹽水(‘PBS緩沖液’，參見Sambrook等‘分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)’1989)中。
然后將溶液透析通過具有10,000道爾頓的分子量截止的膜。在PBS緩沖液中進(jìn)行透析，在24小時(shí)期間每4小時(shí)更換所述PBS緩沖液。在4℃下進(jìn)行透析。
在24小時(shí)透析后將透析袋的內(nèi)容物注入無菌燒杯。調(diào)節(jié)溶液以使每單位體積的質(zhì)量＝10mg/ml。使用PBS進(jìn)行稀釋。然后將產(chǎn)生的溶液過濾通過0.2微米的濾器到無菌容器中。在過濾后，將溶液等分成1ml的單劑量并且在使用前存儲(chǔ)在-22℃。
試劑然后隨時(shí)可以使用。
在該方法中可以進(jìn)行修改，如例如通過改變硫酸銨的濃度或轉(zhuǎn)換為其它試劑。類似地透析截止不必為10,000道爾頓。
本發(fā)明作為使用山羊血清治療的一部分，應(yīng)當(dāng)指出有其它有利的結(jié)果。例如，在I型糖尿病的HIV患者中，不僅在他們?cè)瓉淼腍IV感染方面，而且在糖尿病癥狀方面也注意到改善。對(duì)于帶有某種癌癥的HIV患者，在癌癥以及HIV的癥狀方面注意到緩解。
發(fā)現(xiàn)在感染HIV的患者以及帶有不同病癥如多發(fā)性硬化和一些腫瘤的那些患者中的顯著的臨床改善，該發(fā)現(xiàn)具有所有這些疾病是處于慢性炎性狀態(tài)的潛在的聯(lián)系。
根據(jù)本發(fā)明，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)山羊血清的活性在于抗HLA活性的存在。
出乎我們意料之外，我們能夠容易地證明HIV免疫的山羊生產(chǎn)的血清能夠切斷混合淋巴細(xì)胞應(yīng)答測(cè)定，其是體外使用的傳統(tǒng)活化測(cè)定中的一種?？紤]到這可能是山羊血清的某種固有性質(zhì)，我們注意到當(dāng)未被注射時(shí)山羊血清在這些測(cè)定中未能具有任何活性。
我們還證明該活性與抗II類HLA抗體的活性緊密相關(guān)。我們不知道這是否表示分子模擬應(yīng)答或者山羊是否發(fā)現(xiàn)當(dāng)它出芽和從感染的細(xì)胞釋放時(shí)由病毒攜帶的II類HLA，或者該HLA(MHC分子)是與病毒分開釋放但共純化以致也產(chǎn)生針對(duì)該細(xì)胞膜組分的抗體。實(shí)際上，其它細(xì)胞膜分子如趨化因子受體和相關(guān)分子可能也在制劑中并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)有利療效的抗體應(yīng)答，這沒有逃脫我們的注意。然而如果確實(shí)如此，似乎抗-HLA應(yīng)答是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的，我們相信這在誘導(dǎo)觀察到的抗炎應(yīng)答方面可能扮演重要但未必是唯一的角色。
我們已經(jīng)研究來自用不同病毒/細(xì)胞制劑免疫的不同山羊的血清，并且可以表明注射混合物的山羊產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其發(fā)現(xiàn)HIV包膜的隱藏即沉默部分，該部分在未來疫苗的設(shè)計(jì)中很可能是非常重要的。
在本發(fā)明的一方面，提供用于涉及增殖性免疫應(yīng)答的疾病的抗體，其識(shí)別II類HLA抗原。
關(guān)于血清中針對(duì)II類和I類HLA的高效價(jià)抗體，具有最高水平的抗體的是最好地切斷混合淋巴細(xì)胞應(yīng)答并且在臨床情況下似乎具有最好功效的那些。
出乎我們意料之外，我們發(fā)現(xiàn)針對(duì)FAS，一種主要的編程性細(xì)胞死亡配體的抗體非常高。實(shí)際上它們與MHC類別II抗體相關(guān)。不受理論約束，我們假設(shè)對(duì)FAS的高效價(jià)在抗體附著在FAS抗原之上的幾分鐘內(nèi)可能導(dǎo)致立即的編程性細(xì)胞死亡，細(xì)胞可能被殺死。這可能導(dǎo)致有毒的趨化因子的抑制，該趨化因子被認(rèn)為與MS的失能有關(guān)。
因此，關(guān)于本發(fā)明，我們報(bào)導(dǎo)針對(duì)FAS的抗體在HIV，多發(fā)性硬化和其它病癥的治療中可能是重要的，并且在治療中具有與針對(duì)II類和I類的其它抗體的共同益處。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于治療對(duì)該治療敏感的疾病的抗FAS抗體。
另外，本發(fā)明還提供包含抗HLA抗體和/或抗FAS抗體的組合物，和使用該組合物治療的方法。
本發(fā)明的主要用途是關(guān)于包含抗HLA作為治療具有不適當(dāng)?shù)馗咚降腍LA的疾病的血清。這些包括多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病，原發(fā)性膽道性肝硬化(primary biliary chirrosis)，chirrosis自身免疫和病毒性b和c自身免疫性疾病，其包括心臟，肺，皮膚，胃腸道，腎，腦，CNS。一般地說，通過本發(fā)明可以治療的病癥包括HIV，炎性疾病，自身免疫性疾病，軸突或神經(jīng)損傷或相關(guān)損傷，或者癌癥，以及具有炎性組分的其它疾病或病癥。
抗-FAS的存在使血清特別適合于與慢性活化細(xì)胞相關(guān)的疾病，所述慢性活化細(xì)胞可能分泌損傷信使如細(xì)胞因子和趨化因子。這些包括多發(fā)性硬化，所有形式的神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎性疾病，以及慢性感染如與慢性炎性病變相關(guān)的病毒性，細(xì)菌性和局部(tropical)癌癥，特別是肺，胰，肝，腸，淋巴結(jié)的那些，皮膚尤其是扁平細(xì)胞和基細(xì)胞癌也可以有益于腦和脊髓的原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤。
在具有外傷性損傷神經(jīng)的那些人中觀察到的神經(jīng)功能改善提示神經(jīng)元生長(zhǎng)因子性質(zhì)，因此可以用于創(chuàng)傷，傳染后損傷例如急性熱病性多神經(jīng)炎，惡性損傷等，糖尿病相關(guān)的神經(jīng)病，酒精中毒，金屬或其它毒素中毒等。
觀察到的對(duì)頭發(fā)和皮膚色調(diào)和色澤的益處提示其它獨(dú)特的性質(zhì)，其至今不能通過關(guān)于抗體等的上述觀察解釋，即抗老化，關(guān)于該血清的減小的繼發(fā)性癌癥活性提示直接的抗癌活性這個(gè)可能與FAS活性相關(guān)，但也可能由于其它還未鑒定的因素導(dǎo)致。
在一方面，優(yōu)選抗體是從已經(jīng)接種狂犬病疫苗的山羊獲得。
在一個(gè)變體中，本發(fā)明擴(kuò)展至從馬，羊和其它適當(dāng)?shù)膭?dòng)物生產(chǎn)的抗體?？梢砸耘c為山羊抗體提供的類似的方法獲得抗體，并可以評(píng)估抗HLA和/或抗FAS活性。在另一個(gè)變體中，不需要將HIV病毒用作免疫原來產(chǎn)生抗體，將人白細(xì)胞或來源于人的細(xì)胞系膜(cell-line-membrane)抗原用作抗原以產(chǎn)生有效的抗體制劑。另外，我們?cè)O(shè)想抗體可以被免疫原替代，治療組合物可以包含HIV物質(zhì)或白細(xì)胞。
在還有另一個(gè)變體中，在熱滅活后上清液溶液也可以用作免疫原來產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目贵w應(yīng)答，所述上清液溶液之上已經(jīng)培養(yǎng)病毒培養(yǎng)物或者能夠培養(yǎng)病毒培養(yǎng)物但還未用來培養(yǎng)培養(yǎng)物?？梢詫⑦m于HIV或另外病毒的體外培養(yǎng)的任何上清液溶液或其它培養(yǎng)基用來生產(chǎn)可接受的免疫原，其將產(chǎn)生有效的抗體應(yīng)答。給出細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基如PMBC的上清液或用于培養(yǎng)HIV11 1b的無限增殖癌細(xì)胞系作為實(shí)例。不需要存在HIV或其它選擇的病毒來生產(chǎn)有效的免疫原以產(chǎn)生抗體制劑。
優(yōu)選本發(fā)明的抗體是多克隆抗體，其識(shí)別II類HLA抗原的所有組成成分和gp120抗原，或者識(shí)別FAS。我們的發(fā)現(xiàn)提示優(yōu)選含有II類HLA抗原。
通過使用作為免疫原的選擇的抗原可以產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目贵w，優(yōu)選所述抗原是抗原混合物?？梢允褂枚喾N不同的抗原產(chǎn)生抗體，其識(shí)別在患者中產(chǎn)生更強(qiáng)應(yīng)答的抗原的共同結(jié)構(gòu)。我們假設(shè)HIV分離物的選擇將提供在結(jié)構(gòu)上較小變化的表位，將產(chǎn)生泛抗體(pan-antibody)。
因此，為了產(chǎn)生血清，我們優(yōu)選使用最初在PBMC中生產(chǎn)的不同HIV病毒的混合物，而不單獨(dú)使用T細(xì)胞?；旌衔镞m當(dāng)?shù)匕?，3，4，5，6或更多的這樣的病毒。優(yōu)選病毒是裂解物的形式。優(yōu)選裂解物的實(shí)例包括下列HIV-1分離物91US056，92HT593，92US723，92US657，92US660和92US714。優(yōu)選混合物至少包括1，2，3，4，5或所有6種這些具體的分離物。
例如使用伴刀豆凝集素A的細(xì)胞的激活可以產(chǎn)生利益，例如使用伴刀豆凝集素A可以獲得更高水平的抗多巴胺活性。SHULA(未激活)在抗多巴胺R水平方面在O.D.基線以上未有顯著的升高。同時(shí)，HIV 3B(12只山羊和兔的平均)有顯著的升高。在混合物中伴刀豆凝集素A激活的PBMC細(xì)胞之間的多巴胺R水平方面也有升高。
在還有另一個(gè)變體中，適合于HIV病毒但不限于HIV體外生長(zhǎng)的上清液將以PBMC或其它培養(yǎng)基形式，如例如為了培養(yǎng)HIV 111b使用的無限增殖細(xì)胞系將獨(dú)立地生產(chǎn)有效的抗體制劑，而無需引入病毒，如果以常規(guī)使用的方法熱殺，HIV病毒不應(yīng)該存在。
這些抗體還可以通過使用蛋白質(zhì)獲得，所述蛋白質(zhì)包含從HIV裂解物，合成肽，細(xì)菌融合蛋白和來源于系統(tǒng)發(fā)育無關(guān)的來源的蛋白質(zhì)/肽，其包含或模擬所需的細(xì)胞培養(yǎng)物或其它上清液碎片?？梢垣@得和檢驗(yàn)針對(duì)裂解物的抗體。
不受我們當(dāng)前的理論約束，似乎本發(fā)明的抗體作用為抑制HIV或其它依賴于該免疫應(yīng)答的疾病所需類型的細(xì)胞增殖。因此，例如本發(fā)明在治療多發(fā)性硬化中獲得應(yīng)用。
現(xiàn)在知道來源于山羊血清的抗體的抗HLA和抗FAS活性的意義，評(píng)估各種這樣的山羊血清的可能應(yīng)用現(xiàn)在成為可能。簡(jiǎn)單的測(cè)定可以評(píng)估抗HLA和/或抗FAS活性的存在，并允許鑒定適合于對(duì)患者給藥的候選血清。
按照本發(fā)明，提供一種制備血清，特別是山羊血清的方法，其包含對(duì)動(dòng)物給藥一種或多種，優(yōu)選至少幾種HIV分離物，允許免疫應(yīng)答發(fā)展，從動(dòng)物中抽血，監(jiān)視抗HLA抗體和/或抗FAS抗體的存在，和制備適合于人類治療的抗HLA和/或抗FAS血清。
通常將使用多種動(dòng)物，可以評(píng)估提供更好產(chǎn)率的有效血清的動(dòng)物。然后可以繁殖這種更好的動(dòng)物以提供特別適合本發(fā)明的動(dòng)物譜系。
通常采用質(zhì)量控制方法來確保抗HLA抗體，典型地多種抗HLA抗體，和/或抗FAS抗體，典型地多種抗-FAS抗體的存在。可以進(jìn)行逐批(batch-to-batch)相關(guān)性對(duì)比以提供標(biāo)準(zhǔn)化的產(chǎn)品。
基于血清顯著抑制MLR的能力，提出該血清可以用作強(qiáng)抗炎藥。存在由此可以實(shí)現(xiàn)這個(gè)的多種機(jī)制，HLA識(shí)別的抑制是最有可能中的一種。
另一種作用機(jī)制有可能是由于補(bǔ)體涉及該山羊血漿的事實(shí)，因?yàn)檫@是已知被熱處理抑制的唯一活性。補(bǔ)體有可能使患者削弱的背叛者(defector)機(jī)制活躍。例如；抗體靶向病毒和腫瘤細(xì)胞致死和細(xì)胞介導(dǎo)的抗體定向致死都需要補(bǔ)體，并且在缺乏補(bǔ)體的情況下完全缺少效應(yīng)或機(jī)制。
另外，本發(fā)明提供一種組合物，其包括活性組分，所述活性組分可以通過血清提取技術(shù)來源于適當(dāng)攻擊的山羊的血液，所述血清提取技術(shù)不是設(shè)計(jì)來分離單獨(dú)的特異性抗體。特別是，本發(fā)明設(shè)想從受攻擊的山羊的血清中分離活性組分，或者協(xié)同作用的抗-HLA抗體和/或FAS抗體的混合物，而沒有完全純化和提取來獲得單獨(dú)的抗體。
通常，將來源于非人宿主的抗體注射到人中是違反指示的。針對(duì)外源抗體自身通常產(chǎn)生強(qiáng)免疫應(yīng)答。然而，意外地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用山羊血清提取物未激發(fā)對(duì)其它外源動(dòng)物蛋白質(zhì)所預(yù)料的免疫反應(yīng)。免疫抑制的患者和正常個(gè)體都耐受山羊血清提取物的注射。
本發(fā)明特別使用一種血清提取物，其可能包含來源于HIV攻擊山羊的全體抗體分子。不希望受理論限制，我們相信該方法具有顯著的益處。用該血清提取物處理的患者在被治療的數(shù)分鐘內(nèi)顯示顯著的益處。
通過肌內(nèi)注射將滅活病毒注射到明確標(biāo)記的山羊中，并允許潛伏，此后抽取測(cè)定量的血液并相應(yīng)地修飾。
任選地檢驗(yàn)血清的期望抗體活性，以及抗融合能力，AIDS病毒的中和，它增強(qiáng)吞噬作用的能力和它對(duì)人體的可接受性中任選的一種或多種。
在將所選山羊接種HIV病毒后，與早期研究一致注意到在暴露于外源蛋白質(zhì)抗原后的免疫應(yīng)答。然后進(jìn)一步修飾提取的血清以便將它準(zhǔn)備給人使用。
響應(yīng)接種HIV的動(dòng)物生產(chǎn)的并且通過本方法修飾和精制的試劑已經(jīng)顯示AIDS復(fù)合體總體上的逆轉(zhuǎn)。
對(duì)于這實(shí)際上是如何完成的解釋是復(fù)雜的，但當(dāng)給予HIV陽性或帶有充分發(fā)展AIDS的個(gè)體時(shí)導(dǎo)致1.在患者生活質(zhì)量方面幾乎立即的改善。
2.產(chǎn)生CD4和CD8細(xì)胞的擴(kuò)增，由此增加CD4和CD8細(xì)胞數(shù)。
3.通常以0.5對(duì)數(shù)的增量將病毒負(fù)荷減少至理論發(fā)育零點(diǎn)(theoreticalzero)。
4.P24值減小至0。
本質(zhì)上這意味著可以將患者的免疫系統(tǒng)恢復(fù)到正常并消除病毒，盡管目前未知該狀態(tài)將持續(xù)多久，當(dāng)前觀察的是3年并且正在增長(zhǎng)。
用藥物已經(jīng)成功治療大約200個(gè)兩種性別的10歲和10歲以上的人，其中沒有一個(gè)已經(jīng)顯示任何復(fù)發(fā)或遭受任何副作用。
治療是通過皮下注射給予的，數(shù)量在1/10和10cc之間變化，并被設(shè)計(jì)來盡可能迅速地將藥物遞送到淋巴系統(tǒng)。關(guān)于本發(fā)明，對(duì)于HIV患者的優(yōu)選劑量通常為每周1ml，或根據(jù)需要作為分劑量給予到兩臂中。通常每2或3周給藥，然后每3個(gè)月給藥。對(duì)于癌癥患者，每周0.3ml似乎最佳。
在大多數(shù)情形中，在3個(gè)月期間每4周進(jìn)行治療一次。相同的常規(guī)觀察如下1.在注射后60分鐘以內(nèi)中度至重度的抑郁被逆轉(zhuǎn)。
2.患者通常在注射后2周內(nèi)恢復(fù)他們的食欲并積極地找尋食物。
3.在首次治療約2周內(nèi)患者開始增加體重。
4.獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告證實(shí)在首次治療4-6周后病毒負(fù)荷和P24值顯著降低并且CD4和CD8細(xì)胞顯著增加。
5.未觀察到副作用。
重要的是注意本藥療法，不同于當(dāng)前治療，不要求患者保持嚴(yán)格的每小時(shí)或每天的方案，依靠每周或每月施用的簡(jiǎn)單的注射。
優(yōu)選地，組合物被純化并且基本上只由純化的血清提取物組成。在另一個(gè)變體中，通過常規(guī)或其它任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟ€可以將抗體作為整體或按照疾病特異的要求選擇和分組從復(fù)雜的血清或血漿混合物中純化，所述方法包括但不限于例如免疫親和層析，鹽沉淀，離子交換層析，大小層析，親和層析，當(dāng)適當(dāng)或需要時(shí)結(jié)合。
關(guān)于本發(fā)明的抗-HLA抗體，和/或抗-FAS抗體，還可以考慮聯(lián)合治療，但不是必須的。
可以將本文所述的山羊血親提取物按照本發(fā)明配制成組合物來抑制病毒體外或體內(nèi)復(fù)制。同樣地，本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的山羊試劑，適合于如病毒病的疾病治療。本發(fā)明的試劑可以與適當(dāng)?shù)乃幱幂d體混合。
藥物組合物的實(shí)例包括具有適當(dāng)組成的任何固體(片劑，丸劑，膠囊，顆粒劑等)，或者口服，局部或腸胃外給藥形式，并且它們可以包含載體。當(dāng)腸胃外給藥時(shí)組合物可能必須無菌。
通常使用試驗(yàn)劑量以查看人是否對(duì)超免疫山羊血清發(fā)生變態(tài)反應(yīng)。皮內(nèi)注射后等待30分鐘，看看是否存在作為水腫，紅斑(erythemia)，和瘙癢顯示的中間反應(yīng)。如果該反應(yīng)是陰性的，那么假定很可能發(fā)生即發(fā)性敏感性反應(yīng)(immediate sensitivity reaction)。然而變態(tài)反應(yīng)不因?yàn)榭赡艿淖儜B(tài)反應(yīng)而妨礙人接受可能拯救生命的治療。
可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ缤ㄟ^靜脈輸注，皮下，肌內(nèi)注射，口服制劑，腹膜內(nèi)和靜脈給藥給藥本發(fā)明的組合物。正確的劑量將根據(jù)具體的配方，施用的方式，和具體位置，宿主和治療的疾病狀況而變化。應(yīng)當(dāng)考慮到其它因素如年齡，體重，性別，飲食，給藥時(shí)間，排泄速率，宿主的疾病狀況，藥物結(jié)合，反應(yīng)靈敏度和疾病嚴(yán)重性。可以在最大耐受劑量?jī)?nèi)連續(xù)或周期性地進(jìn)行給藥。
本產(chǎn)品，不同于大部分其它治療，不要求患者保持嚴(yán)格的每小時(shí)或每天的服藥方案，依靠簡(jiǎn)單的周期性的注射的施用。在兩年前治療并已經(jīng)保持方案的患者的免疫系統(tǒng)似乎已經(jīng)穩(wěn)定并恢復(fù)到正常有效水平。
對(duì)于HIV的治療，設(shè)計(jì)本產(chǎn)品來抑制由HIV導(dǎo)致的炎癥，因此允許無需高毒性化學(xué)藥品而使人免疫系統(tǒng)自身改方向來抵抗病毒。不同于它的競(jìng)爭(zhēng)者，本藥療法可以以更小的劑量作為懷疑被感染的地方的預(yù)防劑或在疾病早期期間使用。
不同于現(xiàn)有藥物，其經(jīng)常需要在患者剩余的生命中每日服用，典型的治療依靠由醫(yī)生每周或每月施用的簡(jiǎn)單的注射。常規(guī)的治療方案是3個(gè)月周期，如果病毒再現(xiàn)，預(yù)期在6個(gè)月，12個(gè)月和2年或根據(jù)需要接續(xù)方案。
本發(fā)明的組合物可以與其它藥物一起使用以提供聯(lián)合治療。其它藥物可以形成相同組合物的一部分，或者作為用于同時(shí)給藥的分開的組合物提供。
本發(fā)明還擴(kuò)展到產(chǎn)生保護(hù)性組合物的方法，所述組合物包含用于保護(hù)非山羊物種的試劑，該方法包含用非山羊抗原(例如病毒或異種蛋白)免疫山羊，和純化在用抗原攻擊后的山羊中生產(chǎn)的血清提取物。然后可以將試劑用于保護(hù)非山羊動(dòng)物以防用作免疫原的抗原。
本發(fā)明另外涉及在藥物中包含在用人HIV病毒攻擊后山羊的血清提取物的組合物的用途，和在用于治療包括HIV和AIDS的病癥的制劑中包含在用人HIV病毒攻擊后山羊的全體抗原的組合物的用途。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物通過下列各項(xiàng)的一種或全部處理用45％硫酸銨沉淀，-70℃冷凍24小時(shí)或微量過濾。
本發(fā)明的抗體產(chǎn)品用于治療具有炎性成分的疾病，不僅包括HIV，而且包括糖尿病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，神經(jīng)炎，多發(fā)性骨髓瘤，結(jié)腸癌等。在H Baum的文章中給出更多的實(shí)例，對(duì)此參見他的網(wǎng)址www..kcl.ac.uk/kis/schools/life_sciences/life_sci/baum.Html特別是在他關(guān)于當(dāng)今免疫學(xué)中的分子模擬，1996，2月17日，64-70，的文章中，其在此引入作為參考。
在一方面，本發(fā)明提供治療不具有HIV的患者的方法。特別地，治療方法可以用于治療非HIV患者中的糖尿病或癌癥。
在許多MS患者中看到的恢復(fù)，以及在接受治療的該小時(shí)內(nèi)報(bào)導(dǎo)的振奮的情緒，也已經(jīng)促使我們尋找針對(duì)CNS中的受體的活性，所述CNS可能涉及神經(jīng)刺激和可能再生。我們已經(jīng)篩選各種血清針對(duì)許多抗原的活性，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)針對(duì)多巴胺受體，5-羥色胺受體，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75和趨化因子CXCL10(IP10)的活性。
因此，本發(fā)明擴(kuò)展到針對(duì)多巴胺受體，5-羥色胺受體，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75和趨化因子CXCL10(IP10)中的一種或多種的抗體。這些抗體活性中的一種或多種可能單獨(dú)或與抗-HLA和/或抗-FAS活性結(jié)合存在。
現(xiàn)在知道來源于山羊血清的抗體針對(duì)多巴胺受體，5-羥色胺受體，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75或趨化因子CXCL10的活性的意義，評(píng)估各種這樣的山羊血清的可能應(yīng)用現(xiàn)在成為可能。簡(jiǎn)單的測(cè)定可以評(píng)估該活性的存在，并允許鑒定適合于對(duì)患者給藥的候選血清。特別是，抗FAS和/或抗HLA抗體與針對(duì)多巴胺受體，5-羥色胺受體，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75或趨化因子CXCL10中的一種或多種的抗體的組合可能是重要的，因此測(cè)定可以以不同的抗體活性為目標(biāo)以確保它們存在產(chǎn)品中。
本發(fā)明還提供組合物，其包含針對(duì)多巴胺受體，5-羥色胺受體，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75或趨化因子CXCL10中的一種或多種的抗體，通常還與抗FAS抗體和/或抗HLA抗體一起，和使用該組合的治療方法。
在一個(gè)變體中，本發(fā)明擴(kuò)展到從馬，羊和其它適當(dāng)?shù)膭?dòng)物中生產(chǎn)的抗體?？梢砸垣@得山羊抗體的類似方法獲得抗體，并且可以評(píng)估針對(duì)HLA，F(xiàn)AS，多巴胺受體，5-羥色胺受體，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75和/或趨化因子CXCL10中的一種或多種的活性。
在另一個(gè)變體中，不需要使用HIV病毒作為免疫原來產(chǎn)生抗體，而將人白細(xì)胞用作免疫原來產(chǎn)生有效的抗體制劑。另外，我們?cè)O(shè)想可以用免疫原替代抗體，即治療組合物可以包含HIV物質(zhì)或白細(xì)胞。
一般地說，似乎使用起源于人的細(xì)胞(或蛋白質(zhì)混合物)作為免疫原可以獲得有效的抗體。然后在宿主物種中制造來源于這些人細(xì)胞的抗體，最終的抗體產(chǎn)品被用回到人中。在原始的供體和受體之間蛋白質(zhì)混合物(cocktail mixtures)可以極端類似地同源。該同源性允許例如猿神經(jīng)來源的蛋白質(zhì)或細(xì)胞的概念能夠應(yīng)用于人。來源于緊密相關(guān)的動(dòng)物的高度保守的蛋白質(zhì)混合物是所考慮的。
還預(yù)計(jì)在貢獻(xiàn)原始細(xì)胞的人的HLA類型和受體的HLA類型之間存在關(guān)系。該關(guān)系可能解釋已經(jīng)看到的變異性，并且當(dāng)選擇與患者匹配的配方時(shí)可以考慮。
另外，我們?cè)O(shè)想使用活化的或來源于身體不同部分的癌細(xì)胞系，其包括來源于神經(jīng)胚細(xì)胞瘤，胰腺癌，前列腺和扁皮細(xì)胞癌?？梢灶A(yù)測(cè)在這些不同的細(xì)胞類型之間產(chǎn)生的抗體之間的細(xì)微差異以產(chǎn)生極其不同的輪廓(profile)，并且在非常廣的意義上可以幫助靶向特定的器官系統(tǒng)。
有一些證據(jù)顯示給予山羊的狂犬病疫苗可能導(dǎo)致觀察到的療效。我們從在威爾士獲得的山羊中篩選血清，包括3種不同血清(正常血清)的集合和來源于供體小山羊的血清，沒有發(fā)現(xiàn)狂犬病或其它保護(hù)性疫苗。這些動(dòng)物不含活性抗體。
在還有另一個(gè)變體中，我們?cè)O(shè)想在細(xì)胞體外繁殖期間脫落的細(xì)胞膜可以提供抗原，對(duì)其山羊或其它物種可以指導(dǎo)抗體應(yīng)答。這可以在缺少病毒感染的情形下發(fā)生。
1至9涉及確定抗-HLAclass II抗體的存在；

圖10至16涉及MLR研究；圖17至19涉及確定抗-FAS抗體的存在；圖20至29涉及確定另外的抗體的存在；和圖30提供來源于用不同免疫原免疫的山羊的血清的輪廓。
本發(fā)明的實(shí)施例下列細(xì)節(jié)表示我們當(dāng)前制備抗體產(chǎn)品的方法。
山羊血清純化的實(shí)施例通過使用溶解的HIV病毒混合物并配制有弗氏佐劑的肌內(nèi)注射將山羊接種。將病毒預(yù)先在60℃下熱殺30分鐘。在適當(dāng)?shù)拈g隔如2周后抽取血樣用于初始評(píng)估。在優(yōu)選方案中，每周給山羊注射，共4周，然后在第6周于是將動(dòng)物放血來獲得試劑。
在無菌操作下從山羊抽取約400cc血液。削刮和用聚維酮碘準(zhǔn)備用于針提取的區(qū)域。使用18號(hào)的針從動(dòng)物抽取約400cc的血液。值得注意的是動(dòng)物可以忍受約400cc的抽血而動(dòng)物不遭受任何不適作用。動(dòng)物不一定必須犧牲。在它補(bǔ)充它的血量后大約10-14天內(nèi)可以將動(dòng)物再放血。
證實(shí)可能有效抗體的存在，已經(jīng)考慮所需抗體活性。一旦證實(shí)該試劑的存在，在4-6周之間從山羊上采血。
然后將為了產(chǎn)生試劑，離心基礎(chǔ)血液制品以分離血清。然后過濾300ml血清以去除大的凝塊和顆粒物質(zhì)。然后用過飽和的硫酸銨(室溫下45％的溶液)處理血清，以沉淀抗體和其它物質(zhì)。在5000rpm下將產(chǎn)生的溶液離心5分鐘，此后除去上清液。將沉淀的免疫球蛋白重懸浮于足以再增溶沉淀的磷酸鹽緩沖鹽水(‘PBS緩沖液’，參見Sambrook等‘分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)’1989)中。
然后將溶液透析通過具有10,000道爾頓的分子量截止的膜。在PBS緩沖液中進(jìn)行透析，在24小時(shí)期間每4小時(shí)更換所述PBS緩沖液。在4℃下進(jìn)行透析。
在24小時(shí)透析后將透析袋的內(nèi)容物注入無菌燒杯。調(diào)節(jié)溶液以使每單位體積的質(zhì)量＝10mg/ml。使用PBS進(jìn)行稀釋。然后將產(chǎn)生的溶液過濾通過0.2微米的濾器到無菌容器中。在過濾后，將溶液等分成1ml的單劑量并且在使用前存儲(chǔ)在-22℃。
試劑然后隨時(shí)可以使用。
血漿至血清的轉(zhuǎn)化材料
100mg/mL葡聚糖硫酸酯的制備。
將所需數(shù)量的氯化鈉，正磷酸二氫鈉和正磷酸氫二鈉溶解于1升水中以制備1升磷酸鹽緩沖鹽(PBS)溶液中。
當(dāng)完全溶解時(shí)將10g葡聚糖硫酸酯潑灑到100mL磁攪拌的PBS中?；旌献钌?0分鐘以完全增溶溶解。過濾0.2μm至無菌容器(例如100mL袋)中并室溫下保存，如果不需要立即使用。這是葡聚糖硫酸酯儲(chǔ)液。血漿轉(zhuǎn)化為血清使用1.0275的換算因子，即1000mL重1027.5g稱出待處理的所需體積的血漿。
將10mL葡聚糖硫酸酯儲(chǔ)液加入每1000mL的血漿(1mg/mL的終濃度)。
在室溫下磁力攪拌30分鐘。轉(zhuǎn)移至1升Stedim袋中。
在22℃下4000-4200rpm(相對(duì)離心力＝4910g)離心最少30分鐘。
小心將上清液吸入1L Stedim袋中并丟棄沉淀。
定所需數(shù)量的1L Stedim袋的皮重。
將上清液過濾0.2μm至1L Stedim袋中。每只袋包含大約500ml過濾的上清液。
記錄每袋中血清的體積。將每只袋編號(hào)和標(biāo)記。
如果血清不是立即處理冷凍保存在4-8℃下可達(dá)7天的時(shí)期或在-20℃下更長(zhǎng)時(shí)期。
36％w/v硫酸鈉的制備材料
稱出1.5升水(假設(shè)1mL＝1克)至2L已滅菌的Duran中。
通過將Duran放入預(yù)先加熱的恒溫箱中至少1小時(shí)將水加熱至30-35℃。
導(dǎo)入一個(gè)無菌磁flea并放置在磁攪拌器上。
攪拌同時(shí)緩慢加入360g硫酸鈉。
保持?jǐn)嚢柚敝聋}完全溶解并且溶液清澈。
如果溶液不夠溫?zé)峄蛟试S冷卻，鹽將開始從溶液中結(jié)晶出來。通過將溶液加熱至50℃可以將鹽再增溶。
將1升36％w/v硫酸鈉溶液過濾0.2μm至1升的Stedim袋中。相應(yīng)地給袋作標(biāo)記。
將剩余的500mL過濾到分開的Stedim袋中。通過過濾繼續(xù)加入另外500mL注射用水并給這個(gè)袋標(biāo)記18％w/v硫酸鈉。
使用硫酸鈉從血清中沉淀免疫球蛋白注意。在用硫酸鈉處理之前必須通過葡聚糖硫酸酯將血漿去纖維蛋白。
材料
使用設(shè)置在30-35℃的恒溫箱加熱在Stedim袋中的過濾血清。取2×5mL樣品。
將等體積的加熱的36％硫酸鈉溶液加至袋中的血清，例如500mL鹽溶液500mL血清。
通過用手搖動(dòng)袋子，或者放置在搖擺器盤上溫和混合鹽血清混合物(乳白色溶液)。混合30分鐘。
稱量和平衡袋子并在4000-4200rpm下25-30℃離心最少30分鐘。
小心吸取上清至廢物。盡力避免擾動(dòng)沉淀。取1×5mL上清樣品。
向每袋沉淀加入足量的18％w/v硫酸鈉，將每袋的重量補(bǔ)足到大約1000g。
用手或用搖擺器至少10分鐘混合以將殘存的清蛋白從免疫球蛋白中洗脫。
將袋轉(zhuǎn)移至離心機(jī)并如上所述重復(fù)離心。
小心吸取上清至廢物。盡力避免擾動(dòng)沉淀。
向每袋沉淀加入足量的磷酸鹽緩沖鹽水，將每袋的重量補(bǔ)足到大約1000g。
用手或用搖擺器至少10分鐘混合并將袋轉(zhuǎn)移至冷凍儲(chǔ)藏過夜。
從儲(chǔ)藏中取出袋并確保沉淀已經(jīng)再增溶。
過濾0.2μm至適當(dāng)大小的滲濾袋。
取2×5mL樣品。
免疫球蛋白溶液的bulk制劑用至少0.1m2 30,000 MWCO的膜裝配超濾(UF)裝置。
通過再循環(huán)0.5M-1M氫氧化鈉溶液最少30分鐘將系統(tǒng)消毒。
將系統(tǒng)排放氫氧化鈉溶液并繼續(xù)用沖洗用水沖洗直至水的pH為中性。
將包含免疫球蛋白溶液的滲濾袋與UF連接。
通過蠕動(dòng)泵將包含PBS(10×體積的免疫球蛋白溶液)的袋與滲濾袋連接。
將滲余物導(dǎo)管與滲濾袋連接。
將滲濾物導(dǎo)管與廢物袋連接。
繼續(xù)通過超濾裝置加工產(chǎn)品，使用泵速和閥門調(diào)節(jié)將入口和出口壓力調(diào)整為入口2.0巴和出口0.5巴。
繼續(xù)將免疫球蛋白溶液離心至大約50g/L。這是通過考慮初始濃度和測(cè)量去除液體的量來計(jì)算的。例如初始溶液是2升，25g/L＝50g。在滲濾中去除的溶液體積為1升。因此濃度是50/1＝50g/L。
測(cè)量滲濾流速并將來自包含PBS的袋的泵速調(diào)整為等于該流速。
繼續(xù)進(jìn)行滲濾直至已經(jīng)交換10體積的緩沖液，即1升IgG溶液需要10升PBS。
將系統(tǒng)濃縮的滲濾的IG溶液排放到滲濾袋中。斷開袋并將包含至少1升PBS的PBS袋直接與系統(tǒng)連接。
再循環(huán)PBS沖洗液并將該沖洗物(rinsate)回收到包含IgG溶液的袋中。
繼續(xù)過濾0.2μm散裝(buck)配制的IgG溶液至預(yù)先稱重的Stedim袋中。
當(dāng)完成時(shí)取1mL過濾的溶液樣品并評(píng)估蛋白質(zhì)濃度。
將袋子稱重并計(jì)算IgG溶液的體積。
使用蛋白質(zhì)濃度和IgG體積計(jì)算將溶液稀釋至10mg/mL的終濃度所需的PBS體積，例如IgG的體積＝1300mL。蛋白質(zhì)濃度＝30mg/mLIgG總量＝39000mg需要量＝10mg/mL終濃度。
因此最后所需體積＝39000/10＝3900mL。當(dāng)前體積為1300mL。因此需要加入的PBS體積為3900-1300＝2600mL。
將PBS過濾到包含散裝配制的IgG溶液的袋中以達(dá)到10mg/mL的所需終體積。
試劑隨時(shí)可以使用并可以冷凍儲(chǔ)藏達(dá)1周，或者為了更長(zhǎng)儲(chǔ)藏需要冷凍至-20℃。
在這些方法中可以進(jìn)行改變，如例如通過改變硫酸鈉的濃度或轉(zhuǎn)換它們的試劑。類似地滲析截止不需要為10,000道爾頓。
活性方法介紹私人觀察顯示給予來源于HIV免疫的山羊的血清的AIDS患者有時(shí)似乎明顯改善，我們尋找潛在的機(jī)制。盡管用HIV注射山羊并且免疫應(yīng)答被認(rèn)為是高度特異性，這個(gè)根據(jù)未解釋對(duì)于多發(fā)性硬化和有時(shí)癌癥患者觀察到的益處。
研究的科學(xué)根據(jù)盡管Dalgleish和同事幾年前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD4受體作為HIV的侵入門戶，HIV殺死CD4細(xì)胞的傳統(tǒng)解釋不是發(fā)病機(jī)理的適當(dāng)解釋，所述CD4細(xì)胞隨著感染進(jìn)展成AIDS顯著下降。與該解釋不很好符合的主要觀察包括(1)從感染至AIDS發(fā)作的長(zhǎng)時(shí)期(大約10年)。
(2)在幾乎所有黑猩猩中和在大約5％HIV感染人群中疾病的缺少。黑猩猩具有與人相同的受體和共同受體并且在它們的CD4數(shù)量未下降的感染的黑猩猩中可以容易地檢測(cè)到病毒。
基于這些觀察，研究者已經(jīng)尋找經(jīng)感染后發(fā)展疾病的那些個(gè)體和不發(fā)展疾病的那些個(gè)體之間的解釋性的差異。疾病的主要預(yù)示是在首次感染后的免疫激活和它持續(xù)的水平。換句話說，免疫激活越高，到疾病的時(shí)間越短。中等程度的激活可以導(dǎo)致在AIDS發(fā)展之前的更長(zhǎng)時(shí)間和缺少免疫激活，甚至當(dāng)病毒復(fù)制在黑猩猩和稀有個(gè)體中起作用時(shí)。
應(yīng)當(dāng)指出本文中的術(shù)語“免疫激活”指全免疫激活，即免疫系統(tǒng)的所有方面都被激活，包括T細(xì)胞以及B細(xì)胞的所有亞型。僅存在3種認(rèn)識(shí)的全免疫激活的原因。
這些中的第一個(gè)是HIV明顯顯示的抗原的高變異性，然而在未進(jìn)展的感染的人和黑猩猩中檢測(cè)到高變異性。
第二種可能性是超抗原，其回避抗原特異性機(jī)制并導(dǎo)致整個(gè)免疫系統(tǒng)的激活。盡管10年前的最初的熱情，還未發(fā)現(xiàn)令人信服的超抗原與HIV相關(guān)，解釋這些發(fā)現(xiàn)。Westby和Dalgleish顯示已經(jīng)提示超抗原的可能性的T-細(xì)胞所有組成成分的變異性完全是CD4群體的下降的結(jié)果，并且差異可以通過隨機(jī)CD4破壞來解釋。
唯一另外的解釋是身體發(fā)現(xiàn)異種細(xì)胞或器官并且對(duì)它產(chǎn)生慢性應(yīng)答。這在臨床上移植和特別是骨髓移植后經(jīng)常發(fā)生，并稱為慢性移植物抗宿主反應(yīng)(GVH)疾病。在這種情況下甚至幾個(gè)異種細(xì)胞的存活足以激活整個(gè)免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致與在感染HIV患者中看到的類似的攻擊性自身免疫應(yīng)答。該疾病的臨床特征如此顯著類似于AIDS以致在發(fā)現(xiàn)病毒之前，美國領(lǐng)銜免疫學(xué)家，NIH(USA)的Gene Shearer提出疾病可能是由通過輸血或性交傳遞的異種細(xì)胞引起的。幾個(gè)月后病毒的發(fā)現(xiàn)和通過因子VIII(非細(xì)胞產(chǎn)物)的傳遞導(dǎo)致該觀察被忽略的意義。
全激活的另外的解釋的缺乏導(dǎo)致Dalgleish和Habeshaw尋找病毒可能能夠模擬I類或II類HLA(其是鑒定自身和本發(fā)明抗原的分子)證據(jù)。盡管已經(jīng)公開GP120的一些序列，具有與HLA較小的同源性，我們能夠鑒定HIV包膜(GP120)的主要區(qū)域，其與I類HLA和II類HLA具有顯著的結(jié)構(gòu)同源性。在詳細(xì)結(jié)構(gòu)已知的那些HLA分子以外ElizabethHounsell(MRC)能夠模擬GP120?；谶@些分子和序列，Habeshaw和Hounsell預(yù)測(cè)病毒可能是被具有HLA-B8的人看成“異種的”，還被具有HLA-B27的人看成“自身的”。在由MRC在英國進(jìn)行的全-HIV HLA標(biāo)記研究中唯一重要的差別是具有HLA B8的人要以比剩余群體快得多的速率發(fā)展疾病，并且長(zhǎng)期無進(jìn)展者或極慢的進(jìn)展者是HLA-B27現(xiàn)在是公布事實(shí)的問題。
隨后的工作已經(jīng)顯示(1)響應(yīng)異種細(xì)胞(即不同的HLA類型)攻擊產(chǎn)生的殺傷T細(xì)胞也將殺死感染HIV的自身細(xì)胞。
(2)稱為GP120的HIV病毒的包膜(我們相信與鑒別自身的HLA分子具有結(jié)構(gòu)同源性)可以以與HLA非常類似的方法與肽結(jié)合。另外，針對(duì)肽產(chǎn)生的T細(xì)胞和模擬GP120的HLA也將響應(yīng)含有肽的GP120，但不響應(yīng)不含肽的GP120，提示與肽結(jié)合的能力可能在它的確認(rèn)中非常重要，因此在易感受試者中導(dǎo)致慢性免疫激活的能力。
(3)新近我們已經(jīng)顯示肽在HLA上結(jié)合的區(qū)域存在GP120上，如果去除分子的該部分，如由波士頓Dana Faber的Sodroski教授友好地進(jìn)行的，該肽將不再結(jié)合。
上述觀察的影響提示系統(tǒng)的免疫激活理論上可以被切斷，因此疾病可以不進(jìn)展。在這點(diǎn)上有兩個(gè)主要的觀察，其中之一是作為本科學(xué)結(jié)果的臨床研究，其中對(duì)由于骨髓衰竭導(dǎo)致可能不再服用AZT的患者施用甾類化合物，一種強(qiáng)效(heavy hitting)抗炎藥，其不能長(zhǎng)期給予而無顯著的副作用。我們能夠看見使用甾類化合物顯著改善具有強(qiáng)烈類似于GUH疾病的常規(guī)特征的非常病重的患者，并能夠顯示發(fā)揮該作用所需的劑量極高，從長(zhǎng)遠(yuǎn)觀點(diǎn)來看不是實(shí)際的提議。新近杜克大學(xué)(美國)小組已經(jīng)顯示在針對(duì)HIV給藥甾類化合物的患者中病毒負(fù)荷下降，其現(xiàn)在越來越多爭(zhēng)論什么被認(rèn)為是自身免疫(慢性移植物抗宿主反應(yīng)疾病的常規(guī)特征)。簡(jiǎn)而言之，誘導(dǎo)途徑的抗炎藥可能在HIV感染中有益存在科學(xué)根據(jù)，所述抗炎藥特別作用于I類或II類HLA。
測(cè)定和結(jié)果為了看山羊血清是否具有任何炎癥性質(zhì)，我們將它加到通過混合具有不同遺傳背景的不同個(gè)體的細(xì)胞形成的反應(yīng)中。出乎我們意料之外，它在抑制該反應(yīng)上極其有效。使用大量分子抗體，我們能夠看到唯一接近山羊反應(yīng)性的抗體是抗II類HLA?？笽類抗體只部分減少該反應(yīng)。非常讓人感興趣的是針對(duì)HIV V3的抗體實(shí)際上使該全激活更差，所述抗體被科學(xué)界的大部分認(rèn)為是疫苗的主要目標(biāo)。該發(fā)現(xiàn)可能符合免疫激活理論，因?yàn)獒槍?duì)病毒的免疫應(yīng)答實(shí)際上給病毒提供生長(zhǎng)和刺激而轉(zhuǎn)移，這可以解釋為什么針對(duì)該區(qū)域的疫苗如此無效。
考慮到神奇的性質(zhì)已經(jīng)經(jīng)常被授予山羊，來源于其它動(dòng)物的血清可能在具體測(cè)定中具有意外的活性，我們獲得未接種的山羊的血清，其根本不具有活性。我們?nèi)缓髲木哂胁煌臃N方案的山羊獲得另外的血清。出乎我們意料之外我們可以顯示該血清只發(fā)現(xiàn)HIV包膜和II類HLA。實(shí)際上，已知與HLA具有顯著同源性的病毒的較小部分沒有在血清中被發(fā)現(xiàn)。
我們因此非常感到驚訝地發(fā)現(xiàn)混合物注射和分開注射之間的重大差別，因?yàn)镚P120中保守的HLA區(qū)域的所有組成成分被注射混合物的山羊的血清有效識(shí)別。
注射HIV的山羊生產(chǎn)強(qiáng)烈的類似于抗II類MHC的應(yīng)答的事實(shí)概括這個(gè)數(shù)據(jù)的解釋，所述應(yīng)答可以通過使用不同分離物擴(kuò)展。這是如何發(fā)生的可能解釋如下(1)HIV全部組成成分與II類HLA如此類似以致它因此被具有完全不同的HLA所有組成成分的山羊免疫系統(tǒng)識(shí)別。
(2)第二種可能性是在免疫原，即病毒制劑中，位于病毒出芽的細(xì)胞表面上的HLA被識(shí)別，免疫應(yīng)答不是針對(duì)病毒而是針對(duì)共同聯(lián)合(co-associated)的HLA。
(3)第三種解釋涉及上述兩種解釋的結(jié)合?？赡茉谒苽鋾r(shí)出芽病毒已經(jīng)與HLA融合，該組合被山羊血清強(qiáng)烈發(fā)現(xiàn)。近來的報(bào)導(dǎo)顯示除非病毒通過具有HLA的細(xì)胞出芽并將HLA結(jié)合到膜內(nèi)，那么病毒保持無傳染性。這意味著它必須具有來源與宿主細(xì)胞的一些HLA以激活細(xì)胞進(jìn)入機(jī)制。
這里我們已經(jīng)顯示注射HIV制劑的山羊針對(duì)II類HLA分子產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答。已知許多疾病產(chǎn)生純粹破壞性的炎癥損傷，因?yàn)榧?xì)胞涉及過量表達(dá)II類HLA。盡管多種類型的自身免疫疾病顯示該性質(zhì)，但是最著名的實(shí)例之一是多發(fā)性硬化。因此情況可能是山羊的免疫應(yīng)答破壞了對(duì)這些分子的耐受性，該過程可能允許體內(nèi)發(fā)生強(qiáng)烈的抗炎過程，其可能與臨床益處有關(guān)。如果無顯著的副作用，如果慢性給藥山羊血清，如果情況是這樣，將明顯優(yōu)于長(zhǎng)期高劑量的甾類化合物的使用。
抗-HIV應(yīng)答，其是強(qiáng)烈的抗II類HLA，有可能提供關(guān)于抗AIDS疫苗的真正要求的重要聯(lián)系，我們意欲分析該應(yīng)答以生產(chǎn)候選HIV疫苗。HIV-1免疫的山羊血清和抗炎性質(zhì)介紹提供來源于用HIV-3B病毒裂解物或6種不同HIV-1分離物的NIH病毒混合物免疫的動(dòng)物的血清。該血清中的一些先前已經(jīng)被用作實(shí)驗(yàn)性治療方案的一部分達(dá)到好的效果，然而它作用的機(jī)制未知。為了確定作用機(jī)制我們?cè)贓LISA板上針對(duì)HIV-1 gp120，HLA-DR1篩選血清，從病毒表面糖蛋白的不同區(qū)域選擇肽，一些與HLA具有序列同源性。
材料和方法血清和抗體提供原始的HIV-3B免疫的山羊血清樣品以及關(guān)于放血和免疫日期的信息，所述山羊血清樣品已經(jīng)與來源于許多HIV-3B病毒裂解物免疫的山羊的樣品(在1999年9月14日免疫，在1999年9月21日和再次在2000年9月29日和11月07日免疫的動(dòng)物#0125，#0126，#0127，#0128，#0129)一起用于患者治療。對(duì)于ELISA，我們簡(jiǎn)單地選擇篩選從后期(2000年11月30日和2000年12月01日)生產(chǎn)放血(production bleed)采集的血清樣品。使用由下列HIV分離物(92HT593，92US657，92US660，92US714，92US723，91US056)組成的NIH病毒混合物免疫動(dòng)物#378。免疫是在11月7日和28日進(jìn)行。將在2001年1月25日從生產(chǎn)放血采集的血清用于ELISA篩選。還提供對(duì)照山羊血清。在ELISA和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)研究中，與血清一起我們包括抗人HLA-DR和抗人HLA-DR，DP和DQ(Pharmingen)，在MLR研究期間包括對(duì)于HIV-I IIJb的V3結(jié)構(gòu)域(IRIQRGPGR)特異的小鼠抗-gp120 IgG(EVA3047)，其是通過Harvey Holmes博士(MRC AIDS試劑計(jì)劃，國家生物標(biāo)準(zhǔn)和控制研究院，Potter′s Bar，英國)從J Laman博士獲得的。
肽和蛋白質(zhì)重組HIV-i IIIB gp120是在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中生產(chǎn)，由J Raina博士通過MRC AIDS試劑計(jì)劃的Harvey Holmes博士提供。重組的HLA-DR 1是由Don C.Wiley教授提供的相同蛋白質(zhì)，其在肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)期間使用。本研究使用的HIV-1肽在表1中列出。肽ARP7022，ARP7 10，ARP740-23，-28，-42，-44，-45，-46和47是從MRC AIDS試劑計(jì)劃的Harvey Holmes博士獲得。對(duì)照肽P12表示HIV-1 gp120的CS區(qū)域的混雜序列，由英國倫敦Birkbeck大學(xué)，生物和化學(xué)科學(xué)學(xué)院E.F.Hounsell教授提供。肽等分保存在-20℃直至使用。
ELISA按照與Brown等(J.Immunological methods 1997，20079-88)所述類似的方案進(jìn)行ELISA。將肽和蛋白質(zhì)與0.05M pH9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽結(jié)合緩沖液分別以16μg/m1和1μg/ml混合，并一式兩份涂布在Immulon4 LIBX高度結(jié)合微量滴定板(Dynex Technologies，INC.14340 SullyfieldCircle，Chantilly，VA 20151-1683，USA)上40℃過夜。使用PBS中的5mg/ml酪蛋白將孔封閉并讓它在40℃下過夜。將山羊血清在PBS/0.25％酪蛋白中稀釋1/500和1/1000倍，而將純化的抗體分別稀釋1/1000和1/3000倍，并在37℃下溫育1小時(shí)。使用Wellwash 4機(jī)器(Denley)用PBS/0.05％吐溫20將孔洗滌3次。
使用與在PBS/0.25％酪蛋白/0.01％吐溫20中稀釋1/1000的小鼠單克隆抗-山羊/綿羊IgG克隆GT-34(SIGMA)偶聯(lián)的過氧化物酶檢測(cè)固定化的山羊抗體，使用在37℃下溫育1小時(shí)的山羊抗-小鼠IgG過氧化物酶偶聯(lián)物(SIGMA)檢測(cè)抗-HLA抗體。在另一輪洗滌后，在黑暗中室溫下在孔中溫育新鮮制備的鄰苯二胺二鹽酸鹽(dihydrocbloride)底物(OPD；SIGMA)，在15分鐘后通過加入50μl/孔2.5M H2SO4終止反應(yīng)。使用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器在492nm下測(cè)量OD值。
表1.在測(cè)定過程中使用的肽ARP7022(DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC)來源于HIV gp41保守區(qū)域的24個(gè)殘基的肽(593-616)，其被大多數(shù)歐洲和非洲HIV陽性血清識(shí)別。對(duì)照肽。
ARP710(VKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR)來源于導(dǎo)致gp120/41切割位點(diǎn)的、HIV gp120保守的C-末端(CS)區(qū)域的23殘基的肽。包含與HLA的結(jié)構(gòu)同源性(486-508)。
ARP740/23(RPVVSTQLLLNGSLAEEEVV)來源于gp120的C2區(qū)域的20個(gè)殘基的肽(252-271)。
包含與HLA DR40-鏈的序列同源性。
ARP740/28(NTRKRIRIQRGPGRAFVTIG)(302-321)來源于V3環(huán)HIV-1 gp120的20個(gè)殘基的肽。
ARP740/42(GQIRCSSNITGLLLTRDGGNS)(438-458)包含與DR-β1鏈的同源性。
ARP740/44(NNESEIFRLGGGDMRDNWRS)(459-478)包含與HLA-A2的序列同源性ARP740/45(GQDMRDMWRSELYKYKVVKI)(469-488)被M38識(shí)別的序列，與HLA-C和C5區(qū)域交叉反應(yīng)的抗體。
ARP740/46(ELYKYKVVKIEPLGVAPTKA)(469-478)來源于gp120的C5末端的20個(gè)殘基的肽。在C-末端包含同源性的開始的3個(gè)殘基。
ARP740/47(EPLGVAPTKAKRRVVQREKR)(479-498)來源于gp120的C5區(qū)域的20個(gè)殘基的肽。包含與HLA的結(jié)構(gòu)同源性。
P 12.(RAKTVERKVERRK)HIV gp120的CS區(qū)域的混雜序列，由E.Hounsell提供。不被WV陽性血清識(shí)別。對(duì)照序列。
混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)抑制測(cè)定供血者在許可下通過倫敦，Tooting，南泰晤士河輸血服務(wù)的Liz Buckland從供血者提供HLA class II錯(cuò)配的血樣。
PBMC制劑將新鮮抽取的靜脈血稀釋在Hanks平衡鹽溶液(HBSS；SIGMA)中，小心覆蓋在Histopaque(SIGMA)上并在800g下20℃離心25分鐘。使用巴氏滴管從密度界面收獲PBMC，在HBSS中洗滌3次并使用貝克曼庫樂爾特顆粒計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
混合淋巴細(xì)胞抑制測(cè)定對(duì)于給定的MLR，將來源于2位II類HLA錯(cuò)配的個(gè)體的PBMC再懸浮在包含10％熱失活的人AB血清(SIGMA)，4nM L-谷氨酰胺，青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)(SIGMA)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并命名為刺激物或效應(yīng)器細(xì)胞。將細(xì)胞平板接種，一式三份，刺激物1×細(xì)胞/孔，效應(yīng)器1×10～細(xì)胞/孔以產(chǎn)生10∶1的效應(yīng)器-刺激物比率。為了測(cè)定由山羊血清和各種抗體施加的對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，將3μl未稀釋的山羊血清或1μl純化的抗體加入包含混合細(xì)胞培養(yǎng)物的孔中，并在37℃下在5％CO2中溫育6天。在第5天，細(xì)胞收獲前18小時(shí)用1μCi含氚的胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-Thd；Amersham)脈沖。使用Tomtec Harvester 96 Mach III細(xì)胞收集器將細(xì)胞收獲在玻璃纖維濾墊上，并使用Wallach 1450 microbeta液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量結(jié)合的3H-Thd。結(jié)果顯示為平均的每分次數(shù)(cpm)。
結(jié)果存在于山羊血清中的抗II類HLA抗體我們研究不同山羊血清可以識(shí)別取自貫穿HIV1 gp120的不同區(qū)域的HIV-1 gp120肽的程度，所述HIV-1 gp120肽許多與HLA具有序列和結(jié)構(gòu)同源性(表1)。我們還包括可溶解的HIV-1 gp120和HLA-DR1在這些測(cè)定中。結(jié)果在圖1至9中顯示。Bg表示本底水平。高于0.1的OD水平被認(rèn)為是陽性結(jié)果，條件是與免疫前的血清發(fā)現(xiàn)的任何抗原缺乏反應(yīng)性。
不同的血清給出不同的結(jié)果，但通常指向與HLA-DR1反應(yīng)的趨勢(shì)。免疫前的血清不與任何篩選的肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)，血清#0125和血清#0126未顯示任何強(qiáng)烈的反應(yīng)性。然而其它所有血清顯示了與HLA-DR1的高水平的反應(yīng)性，特別是#0127和#0128，具有極高的反應(yīng)性。為了清楚在圖9中將與HLA-DR的反應(yīng)性與抗人HLA-DR和抗人HLA DR，DQ和DP比較。
抗HLA活性是有趣的，因?yàn)樗芸赡鼙硎踞槍?duì)HLA分子的活性，所述HLA分子正是來源于在免疫前培養(yǎng)病毒的細(xì)胞。當(dāng)HIV在它的包膜中趨向拖動(dòng)比它表達(dá)gp120分子更多的HLA分子時(shí)，特別是在細(xì)胞中上調(diào)的II類HLA分子，結(jié)合的抗gp120和抗II類HLA活性可能表示對(duì)HIV的良好保護(hù)性應(yīng)答。某些血清的情況如此，特別是#0127和#0128，通過使用病毒免疫在這些山羊中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的“變態(tài)(allo)”應(yīng)答，所述病毒在它的表面上攜帶高水平的II類分子。
來源于用NIH病毒混合物的山羊的血清#0378顯示對(duì)多種HIV-I肽的最好的各方面的交叉反應(yīng)性，抗HLA DR1水平大約與原始的抗LILV-3B山羊血清相同，提示該血清總體上可以更好地進(jìn)行抵抗HIV。該血清與與HLA具有同源性的各種HIV-1肽很好地反應(yīng)。血清中沒有一個(gè)與混雜的對(duì)照序列P12反應(yīng)，證明反應(yīng)性對(duì)于LIIV肽是特異性的。在與HIV-igp120結(jié)合方面血清#0127和#0128代表最好的血清，同時(shí)包含極高量的抗HLA DR活性。
山羊血清的MLR抑制關(guān)于圖10和11的MLR，我們使用來源于隨機(jī)錯(cuò)配的個(gè)體的細(xì)胞。盡管這些不一定產(chǎn)生最大的增殖(在那個(gè)時(shí)候培養(yǎng)基存在問題)，出現(xiàn)的趨勢(shì)證明在MLR期間通過山羊血清(在每種情形下使用的原始HIV-3B免疫的血清)抑制增殖。隨后我們開始使用II類HLA錯(cuò)配的細(xì)胞(圖12)，其產(chǎn)生更好的增殖。如同抗HLA DR抗體一樣，山羊血清成功完全抑制細(xì)胞增殖并且似乎具有抗炎活性。
通過我們已經(jīng)從ELISA結(jié)果所看到的來判斷，很可能抗HLA DR抗體導(dǎo)致抑制作用。我們強(qiáng)調(diào)抗HLA DR而不是整個(gè)抗II類，因?yàn)樗坪鯊V泛范圍的抗體無論多近抑制增殖都不如抗HLA DR單獨(dú)有效。為什么這可以發(fā)生是神秘的，然而可能是HLA-DR代表涉及炎癥活性的主要的II類抗原，針對(duì)它的抗體可在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致信號(hào)發(fā)送來抑制復(fù)制。因此山羊血清似乎作為抗炎劑，抑制細(xì)胞增殖。這可能預(yù)示在HIV-1感染的情形中的陽性結(jié)果，在HIV-1感染中病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞激活對(duì)于病毒復(fù)制是必需的。盡管在表面上它似乎是反生產(chǎn)性(counter-productive)的，引入溫和的免疫抑制劑可以作用來抑制病毒復(fù)制和控制疾病，因?yàn)镠IV，不同于相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄病毒HTLV-1或HTLV-2，不使細(xì)胞無限增殖化和導(dǎo)致癌癥，因此完全依靠細(xì)胞激活來增殖。
至今對(duì)于HIV還未鑒定已知的T細(xì)胞超抗原，其導(dǎo)致似乎裝配相對(duì)不好，激活它感染的細(xì)胞的病毒是如何能設(shè)法導(dǎo)致疾病的要點(diǎn)。我們正在研究病毒誘導(dǎo)變態(tài)激活(alloactivation)為基礎(chǔ)的理論，條件是它與病毒相關(guān)HLA分子有關(guān)或者在HIV和HLA之間看到的分子模擬。山羊血清可能簡(jiǎn)單地通過限制該全激活(pan-activation)而有助于患者的健康。SaifuddinM等在文章(Clin.Exp.Immunology 2000，221324-331)中已經(jīng)沿著類似的路線進(jìn)行觀察，其證明了II類HLA分子，特別是HLA-DR在病毒復(fù)制中的重要性。他們注意到針對(duì)II類HLA分子的抗體在II類表達(dá)細(xì)胞中抑制病毒的表達(dá)，提示可誘導(dǎo)的II類MHC反式激活蛋白(CIITA)涉及HIV-1轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)。我們可以在山羊血清的情形中有效地發(fā)現(xiàn)這些效果。將這與抗V3環(huán)抗體比較，所述抗V3環(huán)抗體導(dǎo)致增加的增殖，因此可能在事情的總規(guī)劃中是反生產(chǎn)性的。gp120的高度可變的V3環(huán)區(qū)域不僅允許病毒逃避突變型，而且作為免疫系統(tǒng)更多輪次的激活的誘餌。不幸地該區(qū)域的當(dāng)務(wù)之急是最終有益于病毒和使免疫應(yīng)答遠(yuǎn)離更保守的區(qū)域，針對(duì)其的活性可能更有效。
如果抗炎作用實(shí)際上是血清活性的主要方式，它可能獲得應(yīng)用于多種其它的病癥，其中過興奮和細(xì)胞增殖是疾病癥狀的基礎(chǔ)，例如多發(fā)性硬化。對(duì)于將來的實(shí)驗(yàn)重要的是對(duì)所有血清重復(fù)ELISA以證實(shí)抗HLA和gp120活性的程度。在該情形中我們對(duì)來源于用NIH病毒混合物免疫的動(dòng)物的血清#0378非常感興趣，因?yàn)樗c許多與HLA抗原以及HLA-DR1具有同源性的HIV肽有效地反應(yīng)。
更多的實(shí)驗(yàn)下列數(shù)據(jù)來自與先前采取的那些類似的實(shí)驗(yàn)，其中我們鑒定山羊血清中的抗-HLA抗體，當(dāng)常規(guī)治療不再適合時(shí)所述山羊血清已經(jīng)被用作遭受多發(fā)性硬化和AIDS的志愿者治療的形式。我們的工作涉及研究治療后在這些患者的恢復(fù)中提出的山羊血清作用的抗炎機(jī)制。當(dāng)注意抗HLA抗體時(shí)這先前被提出。然而我們現(xiàn)在給存在于山羊血清中的抗FAS抗體增加一個(gè)功能，給予它們?cè)跀?shù)小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)FAS受體的細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的能力。
FAS/APO-1(CD95)大量地顯著存在于活性淋巴細(xì)胞上，在與FAS-配體或抗-FAS抗體交聯(lián)后通過其發(fā)送信號(hào)(signalling)可以誘導(dǎo)細(xì)胞自殺。這些分子的作用不僅在用于殺傷感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答中，而且在抗原已經(jīng)消失后下調(diào)免疫應(yīng)答以防止可能對(duì)宿主有害的細(xì)胞不斷擴(kuò)增中極其重要。因此該途徑被認(rèn)為對(duì)于維持平衡的免疫應(yīng)答是極為重要的。
在HIV感染的情況下，發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)異?；钴S，給病毒復(fù)制提供大量空間因?yàn)閷?duì)于該過程它要求激活的細(xì)胞。在多發(fā)性硬化患者中，高度激活的細(xì)胞貫穿血腦屏障并且導(dǎo)致對(duì)髓鞘的破壞，引起斑點(diǎn)形成和神經(jīng)功能的喪失。
通過在山羊血清中存在的抗HLA抗體(至少抗HLA DR)介導(dǎo)的抗炎機(jī)制可能是患者恢復(fù)后的機(jī)制。我們現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗FAS抗體不同程度地存在于山羊血清中，并且打算在該提出的關(guān)于多發(fā)性硬化和AIDS患者的活性模型的抗炎機(jī)制中結(jié)合抗HLA和抗FAS抗體的作用。我們提出這些抗體把活性最高的細(xì)胞作為目標(biāo)，導(dǎo)致它們的死亡而抗HLA抗體抑制任何免疫活性。然后可能接著細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)量顯著降低，導(dǎo)致在多發(fā)性硬化的情形中對(duì)髓磷脂的免疫攻擊終止，或者在感染HIV的患者的情形中病毒負(fù)荷減少，條件是缺乏激活的細(xì)胞和正在分泌或?qū)⒎置诓《镜募?xì)胞的死亡。
實(shí)驗(yàn)工作我們開始尋找抗FAS抗體，條件是觀察到當(dāng)加入混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLRs)時(shí)來源于效應(yīng)器的山羊血清破壞細(xì)胞。MLR是來源于2個(gè)具有不同HLA類型的不同人的淋巴細(xì)胞以非特異性的方式反應(yīng)的結(jié)果，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖和增強(qiáng)的周轉(zhuǎn)。我們感覺這是檢驗(yàn)抗炎抗體的好系統(tǒng)，因?yàn)樽陨砻庖叻磻?yīng)全都針對(duì)在HLA類型2分子上不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)自身肽。
圖13至16是取自一些近來MLR的照片，含有或不含血清。
圖13是混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)72小時(shí)后的照片。
圖14是與免疫前的血清混合72小時(shí)的MLR。
在所有的情形中不存在從MLR自身的顯著變化。事實(shí)上，免疫前的血清促進(jìn)MLR。
圖15是加入血清#0125的MLR。該血清來自山羊，其被認(rèn)為對(duì)免疫無應(yīng)答因?yàn)榇嬖诘突蚩珊雎缘腍LA和/或FAS抗體，當(dāng)我們?cè)谛?yīng)器中鑒定抗HLA DR時(shí)一些與我們先前ELISA結(jié)果相關(guān)的事情。
圖16是加入血清#0127的MLR，其已經(jīng)顯示是非常好的效應(yīng)器。在MLR中存在許多PBMC的顯著的細(xì)胞破壞。對(duì)于與當(dāng)前用于處理的血清制劑一起的所有強(qiáng)效應(yīng)器該結(jié)果類似。
我們決定尋找能夠誘導(dǎo)破壞高活性細(xì)胞的抗體，如可能在MLR的情況下。我們因此尋找針對(duì)FAS的抗體的存在，所述抗體可能能夠交聯(lián)FAS受體并誘導(dǎo)出現(xiàn)編程性細(xì)胞死亡所需的信號(hào)。因此我們進(jìn)行針對(duì)FAS的ELISA，其證明該抗體的存在于被認(rèn)為是最好的效應(yīng)器和以抗HLA抗體補(bǔ)充先前結(jié)果的山羊血清中。
這些結(jié)果，連同我們先前的數(shù)據(jù)一起，與我們?cè)谖覀兊腗LR結(jié)果中已經(jīng)看到的良好地聯(lián)系起來，在MLR結(jié)果中由于細(xì)胞破壞導(dǎo)致減少的細(xì)胞增殖。
從近來的ELISA結(jié)果我們開始鑒定山羊血清中另外的可能的活性組分，所述山羊血清已經(jīng)被用作對(duì)于遭受常規(guī)治療不再適合的多發(fā)性硬化(MS)和AIDS的志愿者的治療形式。
以下結(jié)果來源于1/1000稀度的免疫前的血清的ELISA篩選。篩選的抗原為卵清蛋白，HLA DR1(DR1)，F(xiàn)as，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75(NGFr)，5-羥色胺受體(Ser R)，多巴胺受體(Dop R)，CXCL 10和單核因子，其由γ干擾素(MIG)誘導(dǎo)。
已經(jīng)明顯的是針對(duì)多巴胺受體的抗體高濃度地存在于血清中，而對(duì)于其它任何抗原無活性。然而在先前已經(jīng)被用于治療的原始3B血清，和從用T細(xì)胞系中生產(chǎn)的HIV IIIb免疫的山羊生產(chǎn)的血清0127中存在針對(duì)這些抗原中的許多的活性，包括針對(duì)NGFr，多巴胺受體和CXCL10的活性。
針對(duì)HLA和FAS的活性再次是明顯的并且與我們已經(jīng)提出的抗炎機(jī)制一致。與該主題一致我們現(xiàn)在可以加上針對(duì)CXCL10和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75(NGF R p75)的活性。通過在多發(fā)性硬化的鼠模型中大大減輕疾病的嚴(yán)重性，針對(duì)CXCL10的抗血清最近已經(jīng)顯示是有益的，所述減輕疾病的嚴(yán)重性是通過減少CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞侵入CNS，減少TH1細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)和增加髓鞘再生(remyelination)。假定炎癥損傷的局部細(xì)胞通常生產(chǎn)CXCL10，其通過它的受體CXCR3結(jié)合并吸引炎性TH1細(xì)胞，這是令人感興趣的。因此通過山羊血清中的抗體中和該趨化因子或封閉它的受體很可能是我們對(duì)于山羊血清已經(jīng)提出的作用的抗炎機(jī)制的一部分。
同時(shí)針對(duì)低親和力的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體NGF R p75的抗體通過阻止NGF與受體接觸與感染HIV的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞死亡有關(guān)，其又代表另外的抗炎機(jī)制。使人感興趣的是我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)針對(duì)這些受體的最強(qiáng)水平的抗體存在血清0378中，該血清是通過使用最初在PBMC中生產(chǎn)的6種不同HIV病毒的混合物而不是單獨(dú)T細(xì)胞免疫山羊生產(chǎn)的。即使使用1/4000的稀度活性仍然非常高。
我們因此增加這些抗原的活性，與在兩種疾病情形中的血清提出的作用的抗炎機(jī)制一致。我們還增加導(dǎo)致與治療相關(guān)的健康感覺的多巴胺和5-羥色胺受體的活性。
我們篩選許多新的山羊(707-718)，其最近已經(jīng)用HIV以及來源于這些山羊的免疫前的血清接種。盡管它們中沒有一個(gè)顯示類似如上所示的原始免疫前的血清的針對(duì)多巴胺受體的抗體，通過與未具有狂犬病疫苗的來自威爾士的山羊比較山羊中的一些平均具有高水平的該抗體。在原始免疫前的樣品中看到的更高水平可能是由于過去有時(shí)暴露于一些環(huán)境因素，接著強(qiáng)烈應(yīng)答所導(dǎo)致。
備選免疫原在另一個(gè)變體中，不需要使用HIV病毒作為免疫原來產(chǎn)生抗體，將人白細(xì)胞用作免疫原來產(chǎn)生有效的抗體制劑。圖30為來源于用HIV混合物，和用命名為SHULA的人白細(xì)胞免疫的山羊的血清提供輪廓。
權(quán)利要求
1.一種抗HLA抗體在制備用于治療涉及增殖性免疫應(yīng)答的疾病藥物中的用途。
2.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述抗HLA抗體是山羊抗HLA抗體。
3.按照權(quán)利要求2的用途，其中所述山羊抗HLA抗體是經(jīng)HIV攻擊后產(chǎn)生的。
4.按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的用途，其中所述抗體是多克隆的。
5.按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的用途，其中所述抗體具有抗HLA和抗HIV活性。
6.按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的用途，其中所述藥物用于治療HIV，炎癥疾病，自身免疫性疾病，軸突或神經(jīng)損傷或相關(guān)損傷，或者癌癥，以及具有炎性組分的其它疾病或病癥。
7.按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的用途，其中所述抗HLA抗體與針對(duì)FAS，多巴胺受體，5-羥色胺受體，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75和趨化因子CXCL10(IP 10)中的一種或多種的抗體一起存在。
全文摘要
在注射HIV抗原物質(zhì)后在山羊血清中存在抗HLA和其它抗體，構(gòu)成極其意外地有效治療HIV，多發(fā)性硬化和其它疾病的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1620311SQ02817170
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2002年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月2日
發(fā)明者A·G·達(dá)格利什, M·卡多根, J·希尼, S·D·T·懷特 申請(qǐng)人:艾姆斯科有限公司