專利名稱：一種檢測人結(jié)直腸癌braf基因突變的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測BRAF基因突變的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的發(fā)生途徑除經(jīng)典的 “腺瘤-癌”途徑外，還存在“畸形隱窩灶-增生性息肉-鋸齒狀腺瘤-癌”途徑，即鋸齒狀腺瘤途徑。該途徑由有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activedprotein kinases，MAPK)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulatedkinases，ERK)信號通路調(diào)控，BRAF 基因是其重要的調(diào)控因子。BRAF基因全名為鼠類肉瘤濾過性毒菌(v-raf)致癌同源體Bi，定位于人染色體 7q34，其具有功能的編碼區(qū)由2510對堿基組成，編碼MAH(通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，BRAF蛋白位于MAPK/ERK途徑的入口處，將信號從RAS轉(zhuǎn)導(dǎo)至MEK1/2，從而參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件。在結(jié)直腸癌(CRC)中，BRAF突變率約為15%左右，這些突變主要發(fā)生于外顯子15上的激活區(qū)，其中約92%位于第1799位核苷酸上(T突變?yōu)锳)，導(dǎo)致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌EGFR靶向藥物的臨床治療中，KRAS基因突變會使肺癌患者對EGFR酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥；使結(jié)直腸癌患者對抗EGFR抗體類藥物(西妥西單抗、 帕尼單抗)產(chǎn)生耐藥。但是在KRAS野生型患者中使用抗EGFR單抗治療，部分沒有KRAS基因突變的患者也會對EGFR靶向藥物產(chǎn)生耐藥性，研究證明這主要是由于KRAS下游的BRAF 基因V600E突變造成的。進(jìn)一步研究顯示，KRAS下游基因BRAF突變狀況與西妥昔單抗和帕尼單抗的耐藥有關(guān)在KRAS野生型的患者中，有5%左右的BRAF基因突變，BRAF基因突變的患者對西妥昔單抗和帕尼單抗治療均無反應(yīng)，并且無進(jìn)展生存(pre)和總生存(0 均較 BRAF野生型的患者短。Lambrechts等在2009年ASCO會議上報(bào)道BRAF的突變率為5%，與 KRAS基因突變具有排他性；BRAF野生型與客觀療效及生存獲益明顯相關(guān)。CAIR0-2研究中， BRAF野生型患者的PFS與OS均優(yōu)于BRAF基因突變型患者。提示BRAF野生型患者可從抗 EGFR單抗治療中獲益。美國國家癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)在2010年版的結(jié)腸癌病理評估原則4_3中指出腫瘤患者接受EGFR靶向藥物治療之前，必須進(jìn)行KRAS基因突變檢測，根據(jù)檢測結(jié)果決定是否使用EGFR靶向藥物作為臨床治療措施。同時(shí)NCCN新增了針對KRAS基因檢測無突變的患者，在診斷檢測中推薦加入BRAF基因狀態(tài)檢測的評估原則，并指出對于KRAS基因野生型但同時(shí)具有BRAF V600E突變的患者，似乎抗EGFR抗體靶向治療無效，已知BRAF突變的患者似乎不能從抗EGFR抗體靶向的治療中獲益。因此BRAF基因突變檢測能提高腫瘤臨床治療的針對性，降低治療費(fèi)用，節(jié)省寶貴的治療時(shí)間。但是，盡管BRAF基因突變的意義已得到重視和臨床應(yīng)用，目前全球范圍內(nèi)仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法。
傳統(tǒng)的直接測序方法一直是公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是這種方法的靈敏度低，要求突變率達(dá)到20% -30%時(shí)才能檢出，因此需要顯微切割或選擇性組織抽提來富集突變細(xì)胞。 且費(fèi)用高、通量低、檢測周期長，臨床應(yīng)用局限性大。限制性片段多態(tài)性分析(RFLP)雖然具有較高的靈敏度，但所檢測的突變位點(diǎn)必須具有限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，實(shí)際設(shè)計(jì)和操作復(fù)雜。高效變性液相(dHPLC)的靈敏度在5% -10%之間，但只能區(qū)分雜合型樣本，當(dāng)檢測純合型樣本時(shí)，需要摻入野生型樣本混合成雜合型來檢測，帶來額外的檢測費(fèi)用、延長了檢測周期。上面的幾種檢測方法由于自身的缺陷，在臨床應(yīng)用方面局限性較大，至今仍然只是作為一種檢測方法，而非成品試劑盒。高分辨率熔解(High-resolution melting，簡稱HRM)分析是一門新興的技術(shù)。它僅僅通過PCR之后的熔解曲線分析，就能檢測PCR片段的微小序列差異，從而應(yīng)用在突變掃描、序列配對和基因分型等多個方面。HRM既可以對未知突變進(jìn)行篩查、掃描，也可以對已知突變進(jìn)行分析。相對于傳統(tǒng)的突變分析而言，操作步驟大大簡化，時(shí)間和成本也降低了不少。而且樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行HRM分析，無需轉(zhuǎn)移，真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作，降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)中，采用高分辨率熔解分析BRAF基因突變的報(bào)道有UMartin Pichler等人采用HRM方法從野生型DNA樣本背景中檢測出1 %的BRAF 基因突變。在與DNA測序法、實(shí)時(shí)等位基因特異性PCR(eal-timeallele-specific PCR)、高效變性液相色譜法等方法比較后，證明HRM方法比DNA測序和高效變性液相色譜法的敏感度更高，與實(shí)時(shí)等位基因特異性P CR的靈敏度一致。通過對60例石蠟包埋的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行HRM法檢測并用DNA測序法進(jìn)行驗(yàn)證，HRM檢測結(jié)果與DNA測序法一致。結(jié)論是，HRM分析是檢測BRAF基因V600E突變的有效手段。該方法有高靈敏度，高通量的特點(diǎn)， 可以用于臨床石蠟包埋組織標(biāo)本的檢測。(參考Martin Pichler，MarijaBalic, Journal of Molecular Diagnostics 2009，v080100)2、蘇州為真生物醫(yī)藥有限公司銷售一種BRAF基因突變試劑盒，采用高分辨率熔點(diǎn)曲線分析，可在配有HRM模塊的熒光定量PCR儀器(如LightCylcerfSO等)上分析，用于檢測B RAG基因的熱點(diǎn)突變區(qū)V600E(1799T > A)。試劑盒可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測。現(xiàn)有的試劑盒雖然采用了 HRM的方法，但是在實(shí)際中，往往需要后續(xù)的PCR富集和DNA測序來對檢出的突變進(jìn)行基因分型，因此對突變位點(diǎn)的準(zhǔn)確識別可以將與腫瘤的預(yù)后和靶向治療療效密切相關(guān)的突變與其他突變有效的區(qū)分開來，有利于臨床分析和科學(xué)研

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種含有特異性探針的檢測人結(jié)直腸癌BRAF基因突變的試劑盒，彌補(bǔ)HRM檢測只能進(jìn)行突變篩查的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)基因分型，通過對檢測試劑以及檢測條件的優(yōu)化，使該試劑盒的操作簡單快速、檢測結(jié)果更為穩(wěn)定、檢測成本也更低。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方法是一種檢測人結(jié)直腸癌BRAF基因突變的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括用于對BRAF基因第15號外顯子的密碼子600進(jìn)行基因分型的特異性探針，所述的特異性探針包含密碼子600的核苷酸序列，所述BRAF基因具有SEQ ID No 1的連續(xù)核苷酸序列。所述的特異性探針為SEQ ID No. 2。所述的特異性探針3’端經(jīng)封閉處理、無法延伸。所述的試劑盒還包括PCR緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶、特異性引物對、SYTO 9熒光染料、水和野生型對照，其中特異性引物選自
權(quán)利要求
1.一種檢測人結(jié)直腸癌BRAF基因突變的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括用于對BRAF基因第15號外顯子的密碼子600進(jìn)行基因分型的特異性探針，所述的特異性探針包含密碼子600的核苷酸序列，所述BRAF基因第15號外顯子具有SEQ ID No 1的連續(xù)核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測人結(jié)直腸癌BRAF基因突變的試劑盒，其特征在于 特異性探針為SEQ ID No. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測人結(jié)直腸癌BRAF基因突變的試劑盒，其特征在于 特異性探針3’端經(jīng)封閉處理、無法延伸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人結(jié)直腸癌BRAF基因突變的試劑盒，其特征在于試劑盒還包括PCR緩沖液、dNTP、DNA聚合酶、特異性弓|物對、SYTO 9熒光染料、水和野生型對照， 其中特異性引物選自
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人結(jié)直腸癌BRAF基因突變的試劑盒，其特征在于每 20 μ 1 PCR反應(yīng)體系終濃度組成為2 μ 1 10XPCR緩沖液、0.6-1. 0μ 1氯化鎂溶液、1.6μ 1 dNTP、0. 1-0. 3 μ 1 Taq DNA聚合酶、100_200ηΜ正向引物和 20_40ηΜ反向引物、100_200ηΜ特異性探針，2-5μ1 SYTO 9熒光染料，其余為水。
6.一種檢測人結(jié)直腸癌BRAF基因突變的方法，其特征在于，包括以下步驟1)按照常規(guī)方法采集待分析的基因組DNA;2)對上述基因組DNA進(jìn)行BRAF基因15號外顯子的PCR擴(kuò)增，再通過Cold-PCR富集擴(kuò)增產(chǎn)物；反應(yīng)完成后，將擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行變性熔解；3)根據(jù)高分辨率熔解曲線法對擴(kuò)增后的BRAF基因進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟2中PCR擴(kuò)增的過程為95°C15 分鐘，95°C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒，進(jìn)行20個循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟2中Cold-PCR富集過程為 820C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒，進(jìn)行15個循環(huán)；72°C 2分鐘；反應(yīng)完成后，將擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行變復(fù)性，90°C 30 #,50°C 1分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟2中加入的DNA提取液的體積根據(jù)提取液中DNA濃度而調(diào)整，使加入的DNA量達(dá)到10ng。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟3中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣本在 LightCycler 480儀中進(jìn)行熔解曲線分析，儀器以0. 2V /s的速度從72°C升溫到95°C，獲得樣品的熔解曲線。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測基因突變的方法和試劑盒，具體涉及一種檢測BRAF基因突變的方法和試劑盒。其特征在于，所述試劑盒包括用于對BRAF基因第15號外顯子密碼子V600E進(jìn)行基因分型的特異性探針，所述第15號外顯子密碼子V600E的特異性探針包含V600E密碼子的核苷酸序列。本發(fā)明的試劑盒采用常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)合Cold-PCR富集擴(kuò)增產(chǎn)物的技術(shù)和高分辨熔解曲線分析技術(shù)，完成對樣本基因分型的判斷。
文檔編號C12Q1/68GK102586401SQ20111000114
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者侯青, 姬云, 張泓 申請人:蘇州科貝生物技術(shù)有限公司