專利名稱：：方法方法本發(fā)明涉及用于在培養(yǎng)物中制備葉生物質(zhì)的方法。在本說明書中明顯地先前公開的文件的列出和討論不應(yīng)必然地被認(rèn)為是承認(rèn)該文件是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或者是公共知識(shí)。培養(yǎng)物中制備生物質(zhì)可用于制備基因工程多肽；制備包括藥用物質(zhì)、多糖、木質(zhì)素和脂質(zhì)的內(nèi)源性植物產(chǎn)品；通過代謝工程制備自然條件下在植物中未發(fā)現(xiàn)的新的簡單和復(fù)雜化學(xué)品，所述化學(xué)品包括新形式的多糖、木質(zhì)素、糖、芳香族和脂肪族化合物；以及捕獲ニ氧化碳。所述生物質(zhì)也可以用來做某些環(huán)境下的燃料。WO00/57690涉及從分化植物碎片微繁殖(micropropagation)和生成植物藥物(phytopharmaceutical)植物。尤其是WO00/57690涉及刺激提取自成株的分化細(xì)胞的小碎片生成新的小植株，所述新的小植株可以生長為完整的生成植物藥用的植物，該植物能夠在典型植物培養(yǎng)基(例如，土壌、堆肥)中進(jìn)行正常植物生長。WO01/94602涉及用于再生植物的方法和其應(yīng)用固體生長培養(yǎng)基繁殖和/或轉(zhuǎn)化植物的用途。由WO01/94602中描述的方法生成的植物為可存活植物，該可存活植物可以在典型植物生長培養(yǎng)基(例如，土壌、堆肥)中在正常生長下生長。WO2008/028115涉及通過使用轉(zhuǎn)基因的単一容器體系在短時(shí)間內(nèi)生成大量轉(zhuǎn)基因玉米植株，井生長成為可存活植物的高通量方法。所生成的玉米植株是具有根、莖和葉結(jié)構(gòu)的可存活植株，并且該玉米植株在典型植物生長培養(yǎng)基(例如，土壌、堆肥)中能夠進(jìn)行正常植物生長。例如在Etienne&Berthoulバ2002)PlantCell,TissueandOrganCulture69,215-231,Hanhineva&Karenlampi(2007)BMCBiotechnology7，11-23，以及在Ducos^A(2007)InVitroCellular&DevelopmentalBiology_Plant43:652-659中已知臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)體系(例如臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器或TIB)的使用。例如，Hanhineva&Karenlampi(2007)描述了TIB在生成轉(zhuǎn)基因草莓植株中的用途，其中產(chǎn)生的植株包含外源基因和包含根和苗兩者的形成，使得它們能夠在例如土壌或堆肥中進(jìn)行正常植物生長。為什么研究者們選擇了植物來表達(dá)生物藥物和其他高值蛋白，主要的原因之ー是與植物生長關(guān)聯(lián)的尺度放大的強(qiáng)大可能性和非常低的維持成本。然而，使用轉(zhuǎn)基因植物具有其缺點(diǎn)，即公眾關(guān)心的轉(zhuǎn)基因向周圍的非轉(zhuǎn)基因作物的轉(zhuǎn)移和食物鏈污染的可能性(Fox,2003)。很長一段時(shí)間以來，人們假定大多數(shù)物種中的質(zhì)體基因組在花粉中不存在并且由母體遺傳(Hagemann,2004；Zhang等人，2003；kottandffilkinson,1999)。因此，認(rèn)為將基因插入到葉綠體基因組或原質(zhì)體系中從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)質(zhì)體植物(transplastomicplant)對花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因流提供固有天然屏障。然而，ー些最近的出版物表明，葉綠體DNA包含物的滲漏比最初認(rèn)為的更加頻繁和廣泛。例如，估計(jì)葉綠體DNA到花粉的轉(zhuǎn)移，在粟(Setariaitalica)(foxtail)中達(dá)到0.03%(Wang等人，2004)、在煙草中達(dá)到0.01-0.00029%(Ruf等人，2007;Svab和MaligEi,2007)以及在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中達(dá)到0.0039%(Azhagiri和MaligEi,2007)。5關(guān)注的另一點(diǎn)在于隨著時(shí)間推移葉綠體DNA轉(zhuǎn)移到核基因組的可能性(Skppard等人，2008)，所述轉(zhuǎn)移從其可以傳遞的地方到附近的非轉(zhuǎn)基因物種，并采用與傳統(tǒng)核轉(zhuǎn)化體相同的方式。畑草中檢測到的頻率為每16000個(gè)花粉粒中一個(gè)葉綠體DNA轉(zhuǎn)移到核DNA(Huang等人，2003)?？紤]到，根據(jù)煙草物種，每英畝地可以生長5000-16000株煙草植物的事實(shí)，葉綠體DNA轉(zhuǎn)移到核的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。還引起關(guān)注的是，抗生素抗性盒例如用于選擇葉綠體轉(zhuǎn)化體的aadA基因可以被轉(zhuǎn)移到土壤細(xì)菌(Monier等人，2007)和在植食性昆蟲的腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌中(BrinkmarmandTebbe,2007)。為了避免在田地中種植轉(zhuǎn)質(zhì)體種子可以產(chǎn)生的任何環(huán)境問題，ー種方案是植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中制備重組蛋白，所述培養(yǎng)物是在限制性條件下生長的。實(shí)際上，已經(jīng)將植物細(xì)胞懸浮液改性為表達(dá)多種異源蛋白(Hellwig等人綜述，2004)。對于制備重組蛋白植物細(xì)胞懸浮液相對于完整的植物顯示出ー些優(yōu)點(diǎn)，例如收獲前的時(shí)間段較短、生長完全受控制和不受天氣狀況或疾病限制。也可以容易地應(yīng)用基于細(xì)菌生產(chǎn)系統(tǒng)的現(xiàn)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范，cGMP，導(dǎo)致聯(lián)邦藥品管理局(FDA)或歐洲藥品評價(jià)局(EMEA)的更快監(jiān)管批準(zhǔn)(Ma等人綜述，2003；Fischer等人，2004；Twyman等人，2003)。與細(xì)菌一祥，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的生長和維持成本低廉。由于植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物既不隱藏人病原體，也不產(chǎn)生內(nèi)毒素，因而它們在本質(zhì)上也是安全的。植物細(xì)胞懸浮液可以在簡單的合成培養(yǎng)基中維持，但是也可以如動(dòng)物細(xì)胞一祥合成復(fù)雜的多聚蛋白質(zhì)。與田地生長的植物相反，培養(yǎng)的植物細(xì)胞的特性與氣候、土壤質(zhì)量、季節(jié)和日長無關(guān)。沒有霉菌毒素、除草劑或殺蟲劑(Doran，2000)污染的風(fēng)險(xiǎn)，并且副產(chǎn)品(例如，纖維、油、蠟、酚類化合物)較少。相對于完整植株，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物最重要的優(yōu)點(diǎn)也許是產(chǎn)品的分離和純化過程簡單很多(Fischer等人，1999)。然而，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的主要缺點(diǎn)是生長緩慢和通過核轉(zhuǎn)化生產(chǎn)重組蛋白的產(chǎn)量通常較低(Hellwig等人，2004)。另ー個(gè)弱點(diǎn)是，植物細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)率可以變化相當(dāng)大，其重組蛋白水平通常為可溶性總蛋白(TSP)的0.0064%-4%，雖然在特殊情況下可以達(dá)到TSP的20%(Huang等人，2001)。一般來說，葉綠體轉(zhuǎn)化比傳統(tǒng)的核轉(zhuǎn)化的重組蛋白更好地出產(chǎn)重組蛋白。例如，將大腸桿菌(E.coli)不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)在煙草中通過核轉(zhuǎn)化和質(zhì)體轉(zhuǎn)化兩者表達(dá)。當(dāng)將腸毒素基因插入到質(zhì)體基因組時(shí)，重組蛋白收率高250倍(Kang等人，200。同樣地，當(dāng)由核和質(zhì)體DNA表達(dá)霍亂毒素B抗原(CTB)吋，畑草葉綠體中的抗原產(chǎn)量比由核中高410倍(Daniell等人，2001)。即使對于ー些蛋白的過表達(dá)而言葉綠體轉(zhuǎn)化看起來是更優(yōu)的，但關(guān)于在轉(zhuǎn)質(zhì)體中重組GFP的可能產(chǎn)量高于植物細(xì)胞懸浮液，僅發(fā)表了一個(gè)報(bào)道(Langbecker等人，2004)。該研究描述了黑暗生長的煙草植物細(xì)胞培養(yǎng)物的質(zhì)體轉(zhuǎn)化，但是沒有對表達(dá)的潛カ進(jìn)行估計(jì)。在實(shí)施例描述的工作中，已經(jīng)研究了質(zhì)體編碼的重組蛋白的表達(dá)水平，在這種情況下，葉組織、愈傷組織和細(xì)胞懸浮液中的綠色熒光蛋白GFP+的變體在不同條件下生長(Scholz等人，2000)。結(jié)果表明，在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中的表達(dá)，對于葉綠體中外源蛋白的高水平和限制性表達(dá)是可行的途徑，盡管表達(dá)水平遠(yuǎn)低于在植物葉中的表達(dá)水平。還描述了基于臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器開發(fā)的新表達(dá)體系，該表達(dá)體系能夠從細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物開始制備非常高水平的重組蛋白，并且能夠由未分化植物細(xì)胞制備高水平的葉生物質(zhì)。本發(fā)明的第一方面提供了用于從未分化的植物細(xì)胞中制備葉生物質(zhì)的方法，該方法包括提供未分化的植物細(xì)胞；將其接觸促進(jìn)細(xì)胞分化為葉組織的試劑；和使該細(xì)胞在臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)體系中生長。所謂“未分化植物細(xì)胞”我們包括以下的含義，即細(xì)胞大體上沒有顯示分化為任何特定植物組織如苗或葉的跡象，并且在不存在誘導(dǎo)未分化細(xì)胞分化的試劑的條件下，尤其是應(yīng)當(dāng)沒有誘導(dǎo)未分化細(xì)胞分化為苗的試劑的條件下，它們將在這種狀態(tài)下保持至少ー個(gè)月。所述未分化細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。通常，未分化細(xì)胞可以得自永久愈傷組織或愈傷組織材料。永久愈傷組織是未分化植物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。這種永久愈傷組織細(xì)胞保持未分化的形式至少ー個(gè)月。未分化細(xì)胞也可以從分化的植物材料在體外得到，所述分化的植物材料例如葉、莖、花、種子或根，將所述葉、莖、花、種子或根切割并與某些植物激素，例如生長素接觸放置。當(dāng)該植物材料與激素接觸吋，在植物材料的某些區(qū)域?qū)?huì)形成愈傷組織。認(rèn)為通過激素對未分化植物材料誘導(dǎo)形成的愈傷組織不是永久愈傷組織。當(dāng)植物不是轉(zhuǎn)基因植物吋，提供未分化細(xì)胞的步驟包括放置植物切割碎片(植物材料)與植物激素接觸，然后該植物激素在那些切割碎片的邊緣生成愈傷組織；然后將所述愈傷組織作為愈傷組織繼代培養(yǎng)，并保持沒有任何選擇性。所述切割植物材料可以是整個(gè)或部分的根、葉、莖、花或種子。當(dāng)植物是質(zhì)體轉(zhuǎn)基因植物吋，提供未分化細(xì)胞的步驟包括通過靶向葉綠體DNA的同源重組方法將轉(zhuǎn)基因核酸分子引入到植物細(xì)胞的葉綠體中。誘導(dǎo)含有轉(zhuǎn)基因核酸分子的植物細(xì)胞，從而形成未分化細(xì)胞的愈傷組織；和將該愈傷組織在有效實(shí)現(xiàn)同型異源性的條件下繁殖。本發(fā)明工作的愈傷組織是永久性愈傷組織，所述永久性愈傷組織作為未分化細(xì)胞已經(jīng)培養(yǎng)和維持至少ー個(gè)月。優(yōu)選地，當(dāng)與試劑接觸時(shí)僅存在的細(xì)胞為未分化細(xì)胞。通常，當(dāng)與試劑接觸時(shí)，存在的細(xì)胞中至少90%、或95%、或99%、或99.9%、或99.99%為未分化細(xì)胞。優(yōu)選地，基本上所有的葉和葉狀生物質(zhì)材料是由未分化細(xì)胞接觸試劑之后分化產(chǎn)生。通常，由使用試劑處理未分化細(xì)胞制備的植物材料應(yīng)為至少50%，優(yōu)選地70%，和更優(yōu)選地大于85%的葉生物質(zhì)。所謂“葉”和“葉狀”生物質(zhì)，我們包括植物材料為葉或“葉狀”組織的形式的含義。通過組織碎片的形狀、葉綠體的數(shù)量和顯著的光合作用活性將這些葉組織與其他植物組織區(qū)分開。例如，對于任何給定的植物，按照植物組織共聚焦顯微分析計(jì)數(shù)，葉材料有更多的葉綠體和發(fā)育中的葉綠體，并且如植物組織吸收ニ氧化碳檢測的，這些葉綠體比非葉材料的葉綠體具有更高的光合作用活性(使用熒光計(jì)測定Fv/Fm)和更高的葉綠素含量(通過吸收分光光度法分析提取的色素)。該確定方法對于技術(shù)人員來說是熟知的，例如在(Baker(2008)Ann.Rev.PlantBiol.59:89-113)中描述的。所述臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)體系可以是如本領(lǐng)域已知的任何此種體系(例如參見Etienne&Berthouly(2002)PlantCell,TissueandOrganCulture69，215-231，Hanhineva&KJirenlampi(2007)BMCBiotechnology7，11-23，并且也可以來自Ducos等人(2007)InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant43:652-659，將它們所有引入本文作為參考。通常，所述體系包括細(xì)胞居住在其上的多孔固體基質(zhì)(例如，網(wǎng)或海綿或泡沫)，如以下進(jìn)一步描述的該多孔固體基質(zhì)浸入液體生長培養(yǎng)基中持續(xù)短的時(shí)間。所述植物細(xì)胞可以是來自單子葉植物或雙子葉植物的細(xì)胞。適合的雙子葉植物包括煙草、馬鈴薯、番茄、豆、大豆、胡蘿卜、木薯或擬南芥(Arabidopsis)中任意的。適合的單子葉植物包括玉米(corn)、黑麥、燕麥、小米、甘蔗、高粱、玉米(maize)、小麥或水稻中任意的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物細(xì)胞來自藥用植物，該藥用植物中主要的藥用物質(zhì)在葉中產(chǎn)生。應(yīng)理解到，該方法代表通過從葉生物質(zhì)提取藥用物質(zhì)從而獲得它們的有利方法。適合的藥用植物包括顛茄屬(Atropasp)、莨菪屬(Hyoscyamussp)、曼陀羅M(Daturasp)>S1M(Papaversp)>^ICIIfM(Scopoliasp)>^iiilItM(Digitalissp)、油麻藤屬(Macunasp)、紅豆杉屬(iTaxussp)、喜樹屬(Camptothecasp)、三尖杉屬(Cephalotaxussp)或者長春花屬(Catharanthussp·)、蒿屬(Artemisiasp)例如黃花蒿(Artemisiaannua)中任意的?？梢缘米赃@些藥用植物的藥品包括但不限于莨菪烷類生物堿，例如阿托品、東莨菪堿和莨菪堿以及它們的前體和衍生物；嗎啡烷型生物堿，例如可待因、嗎啡、蒂巴因、去甲血根堿、血根堿和隱品堿以及它們的前體和衍生物；強(qiáng)心苷，例如毛地黃毒苷、毛地黃毒苷配基、芰皂配基、雙羥洋地黃毒甙、吉托洛苷(Gitaloxigenin)以及它們的前體和衍生物；L-DOPA(L-3,4-二羥基苯丙氨酸)及其前體和衍生物；抗腫瘤化合物，例如紫杉醇及其前體和衍生物、喜樹堿及其衍生物、高三尖杉酯堿、三尖杉酯堿、異三尖杉酯堿和三尖杉堿以及它們的前體和衍生物；和長春花生物堿，例如長春花堿、長春新堿、長春花朵靈、長春堿，它們的前體和衍生物；瘧疾藥物，例如青蒿素，其前體和衍生物。由葉生物質(zhì)制備的藥用化合物可以通過與藥學(xué)上可接受的賦性劑、稀釋劑或載體組合加入藥物組合物中。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植物可以是能源作物。所謂能源植物，我們指用于制備包括乙醇或生物柴油的生物燃料的植物物種。本發(fā)明使生物質(zhì)能夠不依賴于季節(jié)和植物物種地連續(xù)制備，所述生物質(zhì)可以用于生物燃料的連續(xù)制備。所生成的生物質(zhì)可以內(nèi)源性含有相對升高水平的多糖，所述多糖用于基于發(fā)酵的乙醇制備過程，或相對高水平的一種或多種脂質(zhì)，所述脂質(zhì)可以進(jìn)一步加工用于制備生物柴油。這些升高水平的有益化合物也可以通過基因工程由生物質(zhì)生成。適當(dāng)?shù)?，所述植物是芒?Miscanthussp)、麻風(fēng)樹屬(Jatrophasp)、黍?qū)?Panicumsp)、柳樹、棕櫚樹、玉米、木薯或楊樹中任意的。通常，促進(jìn)細(xì)胞分化為葉組織的試劑是植物激素(植物激素(phytohormone)或植物生長調(diào)節(jié)劑)，優(yōu)選為細(xì)胞分裂素。細(xì)胞分裂素為一組主要影響細(xì)胞分裂和苗形成的化學(xué)品，但是也具有延遲細(xì)胞衰老的作用、負(fù)責(zé)介導(dǎo)生長素貫穿植物中的運(yùn)輸并且影響節(jié)間長度和葉生長。生長素是對細(xì)胞膨大、芽形成和根發(fā)生有正面影響的化合物。它們還促進(jìn)其他激素的生成，并與細(xì)胞分裂素共同控制莖、根、果實(shí)的生長和將莖轉(zhuǎn)變?yōu)榛?。所述?xì)胞分裂素可以是任意屬于腺嘌呤型或苯脲型的天然或人工細(xì)胞分裂素。優(yōu)選地，所述細(xì)胞分裂素是具有細(xì)胞分裂素活性的腺嘌呤、激動(dòng)素、玉米素、6-芐氨基嘌呤、二苯脲、噻苯隆(TDZ)和它們各自的衍生物中任意的。所述試劑可以促進(jìn)、誘導(dǎo)和激發(fā)分化，使得苗從得自本發(fā)明的愈傷組織/細(xì)胞懸液的任何單個(gè)未分化植物細(xì)胞開始快速生長，優(yōu)選地以指數(shù)方式快速生長。這些苗發(fā)育為葉生物質(zhì)或葉狀生物質(zhì)。優(yōu)選地，促進(jìn)細(xì)胞分化為葉組織的試劑是噻苯隆(TDZ)。所述試劑可以方便地與另一種植物激素聯(lián)合使用，所述另一種植物激素例如生長素，如天然存在的生長素4-氯-吲哚乙酸、苯乙酸(PAA)、吲哚-3-丁酸和吲哚-3-乙酸，或合成的生長素類似物1-萘乙酸(NAA)、2，4_二氯苯氧乙酸。通常，將所述試劑以0.01-100μΜ的濃度加入到培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，所述濃度為0.1-10μM0所述試劑可以在在臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)步驟的開始時(shí)或過程中加入。為了優(yōu)化葉生物質(zhì)的制備或用于優(yōu)化葉生物質(zhì)中特定產(chǎn)物的濃度，可以選擇任何合適的浸漬方案，所述產(chǎn)物如目的多肽或藥用物質(zhì)。通常，每培養(yǎng)2-Μ小時(shí)浸漬時(shí)間為1-30分鐘。優(yōu)選地，每培養(yǎng)2-6小時(shí)浸漬時(shí)間為1-10分鐘。為了以最有效的方式，即以最合適的速度、數(shù)量和質(zhì)量生成用于特定目的的特定生物質(zhì)，技術(shù)人員能夠根據(jù)植物物種和來源容易地選擇最合適的浸漬培養(yǎng)參數(shù)，例如時(shí)間、溫度和生長培養(yǎng)基。臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)物中液體的體積可以是任何合適的體積，但通常為1-10000升?？晒┻x擇地，所述體積可以為1-5000升、1-1000升或1-500升。含有所述臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)體系的容器可以是任意合適的大小，并且通常為1-10000升?？晒┻x擇地，所述體積可以為1-5000升、1-1000升或1-500升。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將所述植物細(xì)胞不經(jīng)基因工程改造。如熟知的，植物在它們的葉子中內(nèi)源地產(chǎn)生許多重要的產(chǎn)物，如上面描述的藥用物質(zhì)，還有油、色素、抗氧化劑、簡單和復(fù)雜的生物化學(xué)品，例如糖(碳水化合物)、脂類、氨基酸、揮發(fā)性芳香族化合物和多種香料/香料前體。目的植物材料也可以能夠濃縮、捕獲或降解樣品中，例如給水源的樣品中的毒性污染物(基于植物的體外凈化/純化)。所述植物材料也可以用于將包含在臨時(shí)反應(yīng)溶液中的一種化合物轉(zhuǎn)化為一種或多種其他化合物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述植物細(xì)胞經(jīng)基因工程改造為，例如表達(dá)多肽。所述多肽可以是任意的目的多肽，但是優(yōu)選是治療多肽、酶、生長因子、免疫球蛋白、激素、結(jié)構(gòu)蛋白、植物應(yīng)激反應(yīng)中涉及的蛋白、生物藥物、肽或疫苗抗原中的任意一種。當(dāng)多肽是酶時(shí)，其可以用于改變?nèi)~材料的代謝，從而使得能夠產(chǎn)生新型聚合物和代謝物。也可以在葉材料內(nèi)表達(dá)一種或多種多肽，以增強(qiáng)葉組織純化或降解在樣品中例如水源中發(fā)現(xiàn)的污染物的能力。所述經(jīng)基因工程處理的植物細(xì)胞(重組的或轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞)可以為(i)核轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中外源核酸(轉(zhuǎn)基因)存在于核中；(ii)轉(zhuǎn)質(zhì)體植物細(xì)胞，其中外源核酸(轉(zhuǎn)基因)存在于質(zhì)體例如葉綠體中；或(iil)既是核轉(zhuǎn)化的也是轉(zhuǎn)質(zhì)體的的植物細(xì)胞。制備核轉(zhuǎn)化植物和轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可以使用粒子轟擊、微注射、聚乙二醇-電穿孔、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、植物病毒等方法將核酸分子引入植物細(xì)胞中(參見，例如Birch1997，Maliga2004，Gleba等人，2008)。如果所述植物是轉(zhuǎn)質(zhì)體植物，則是優(yōu)選的。也可以采用多種本領(lǐng)域認(rèn)可的方式來轉(zhuǎn)化植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，方法的選擇可以依賴于靶向轉(zhuǎn)化的植物的類型。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的適當(dāng)方法的實(shí)例包括微注射(Crossway等人，BioiTechniques4:320-334(1986))、電穿孔(Riggs等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA835602-5606(1986)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hinchee等人，Biotechnology6915-921(1988))、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人，EMB0J.32717-2722(1984))和使用得自Agracetus,Inc.,Madison,WisconsinandDupont,Inc.,Wilmington,Delaware的裝置的沖擊粒子加速(參見例如，Sanford等人第4，945，050號美國專利)。通常，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化對于單子葉植物是無效的，而對于單子葉植物，上面提到的其他方法是優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^熟知的技術(shù)鑒定成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的細(xì)胞。例如，一個(gè)選擇技術(shù)涉及將編碼轉(zhuǎn)化細(xì)胞中可選性狀的DNA序列(標(biāo)記物)合并到表達(dá)載體中。這些標(biāo)記物包括二氫葉酸還原酶、針對真核細(xì)胞培養(yǎng)物的G418或新霉素抗性基因，和用于在大腸桿菌和其他細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。可供選擇地，該種可選性狀的基因可以位于用于共轉(zhuǎn)化需要的宿主細(xì)胞的另一個(gè)載體上。所述標(biāo)記基因可以用于鑒定轉(zhuǎn)化體，但是希望確定哪一個(gè)細(xì)胞含有重組DNA分子和哪一個(gè)細(xì)胞含有自身連接載體分子。這可以通過使用克隆載體來實(shí)現(xiàn)，所述克隆載體中DNA片段的插入破壞了存在于分子上的基因中的一個(gè)的完整性。因而，由于該基因功能的丟失，可以鑒定重組體。另一種鑒定成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法涉及使由本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的引入所產(chǎn)生的細(xì)胞生長，從而制備本發(fā)明的多肽?？梢允褂美缬蒘outhern(1975)J.Mol.Biol.98，503或Berent等人(198Biotech.3，208描述的方法來收獲和裂解細(xì)胞，并且檢查其DNA含量來檢查DNA的存在。可供選擇地，上清中蛋白質(zhì)的存在，可以使用如下描述的抗體來檢測。當(dāng)重組DNA能夠直接表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，除了直接檢測重組DNA的存在以外，可以通過熟知的免疫學(xué)方法驗(yàn)證成功的轉(zhuǎn)化。例如，用表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生顯示適當(dāng)抗原性的蛋白質(zhì)。收獲懷疑被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞樣品并使用適當(dāng)?shù)目贵w檢測蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解，可以通過植物轉(zhuǎn)化技術(shù)來制備穩(wěn)定或不穩(wěn)定(臨時(shí))的轉(zhuǎn)化體。所述臨時(shí)的轉(zhuǎn)化體僅臨時(shí)表達(dá)含有由DNA構(gòu)建體編碼的本發(fā)明化合物的產(chǎn)品。該臨時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可以用于分子遺傳研究也用于某些特定商業(yè)應(yīng)用，其中在轉(zhuǎn)化后不久，收獲負(fù)責(zé)制備有價(jià)值蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。當(dāng)異源DNA序列整合到宿主基因組中時(shí)，可以產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。對于植物而言，可以將所述異源DNA插入到染色體的一個(gè)中或插入到細(xì)胞器基因組中(線粒體，葉綠體)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，大腸桿菌可以用作中間宿主，并且其可以用于使用標(biāo)準(zhǔn)的或修飾的質(zhì)粒載體來構(gòu)建各種包含編碼序列的質(zhì)粒。植物轉(zhuǎn)化可以使用從該中間宿主中回收的并用于例如通過基因槍裝置直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞的質(zhì)粒DNA來實(shí)現(xiàn)?？晒┻x擇地，可以將含有編碼序列的嵌合DNA構(gòu)建體鏈接到用于在農(nóng)桿腫瘤菌(Agrobacteriumtumefaciens)或農(nóng)桿根群菌(Agrobacteriumtumefaciens)中繁殖的基于Ti或Ri質(zhì)粒的載體中，并且隨后通過農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中。載體的實(shí)例包括克隆載體、表達(dá)載體和穿梭載體。克隆載體包括，為了制備更多DNA序列的目的，用于攜帶DNA片段進(jìn)入受體的試劑。表達(dá)載體含有攜帶DNA序列進(jìn)入宿主，并且在宿主中指導(dǎo)特定產(chǎn)物例如蛋白或反義轉(zhuǎn)錄物合成的試劑。表達(dá)載體可通過將編碼DNA序列插入到載體中含有插入位點(diǎn)的表達(dá)盒中來制備。穿梭載體包括遺傳元件，所述遺傳元件被構(gòu)建成具有用于兩個(gè)宿主的復(fù)制原點(diǎn)，以使其可以用于攜帶外源序列到一個(gè)以上的宿主。例如，穿梭載體可以具有用于大腸桿菌和農(nóng)桿根群菌(A.tumefaciens)的復(fù)制原點(diǎn)。通常，將DNA以表達(dá)的適當(dāng)方向和正確閱讀框插入到載體中。如果必要，可以將所述DNA與由需要的宿主識(shí)別的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)控制核苷酸序列相連，雖然通常載體中有這些控制。調(diào)節(jié)元件可以得自植物或得自替代來源，所述替代來源包括植物病毒或農(nóng)桿菌屬的Ti/Ri質(zhì)粒?？梢詫⑺鯠NA插入物可操作地與合適的啟動(dòng)子連接，所述啟動(dòng)子例如植物病毒啟動(dòng)子或植物啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、臨時(shí)調(diào)控啟動(dòng)子、發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子、細(xì)胞優(yōu)選啟動(dòng)子和/或細(xì)胞特異啟動(dòng)子、組織優(yōu)選啟動(dòng)子和/或組織特異啟動(dòng)子和化學(xué)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子也可以是由轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的人工組合構(gòu)建的合成啟動(dòng)子或人工啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子包括CaMV35S和19S啟動(dòng)子(Fraley等人，第5，352，605號美國專利)?？梢詫cElroy等人，Mol.Gen.Genet231,150-160(1991)描述的啟動(dòng)子表達(dá)盒容易地進(jìn)行修飾用于編碼序列的表達(dá)，并且其特別適用于在單子葉植物宿主中使用。再另一個(gè)優(yōu)選的組成型啟動(dòng)子得自泛素，所述泛素是已知在許多細(xì)胞類型中積累的另一種基因產(chǎn)品。所述泛素啟動(dòng)子已從幾個(gè)物種中克隆，在轉(zhuǎn)基因植物中使用(例如Binet等人，PlantScience79,87-94(1991)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括對非生物和生物環(huán)境刺激有應(yīng)答的啟動(dòng)子。非生物環(huán)境刺激包括光、溫度和水分有效性。生物環(huán)境刺激包括病原體(包括病毒誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、細(xì)菌誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、真菌誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、昆蟲誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和線蟲誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)，與共生生物和食草動(dòng)物的相互作用。所述啟動(dòng)子也可以對移動(dòng)、觸摸、組織損傷和植物激素(包括脫落酸、細(xì)胞分裂素、生長素、赤霉素、乙烯、油菜素內(nèi)酯和肽，所述肽如系統(tǒng)素和結(jié)瘤因子)有應(yīng)答。臨時(shí)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子包括晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)啟動(dòng)子(circadianregulatedpromoter),以及那些響應(yīng)非晝夜節(jié)律的守時(shí)機(jī)制的啟動(dòng)子。所述發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子包括用于器官和其他結(jié)構(gòu)的組織特異啟動(dòng)子和細(xì)胞類型特異啟動(dòng)子，所述其他結(jié)構(gòu)包括葉、莖、根、花、種子、胚、花粉和胚珠。用于表達(dá)植物中，特別是玉米和甜菜中編碼序列的組織特異啟動(dòng)子或組織優(yōu)選啟動(dòng)子是那些在根、髓、葉或花粉中指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。實(shí)例是來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)bl-微管蛋白基因的TUBl啟動(dòng)子(Snustad等人，PlantCell4,549,1992),來自豌豆(Pisumsativum)的類金屬硫蛋白基因的I^sMTA啟動(dòng)子區(qū)域(Evans等人，F(xiàn)EBSLetters262，29，1990)、來自擬南芥(A.thaliana)的RPLl6A和ARSKl啟動(dòng)子和在WO97/20057和WO93/07278中公開的另外的啟動(dòng)子。此外，化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子用于指導(dǎo)表達(dá)，且也是優(yōu)選的(參見WO95/19443)。尤其優(yōu)選的是16SrRNA、psbA和rbcL啟動(dòng)子。除了啟動(dòng)子以外，可以將多種轉(zhuǎn)錄終止子引入到本發(fā)明的DNA構(gòu)建體中。所述轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)責(zé)終止超出轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和它的正確多聚腺苷酸化作用。所述轉(zhuǎn)錄終止子可以得自與啟動(dòng)子相同的基因或可以得自不同的基因。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述編碼序列與它的天然存在的多聚腺苷酸信號序列可操作地連接。合適的轉(zhuǎn)錄終止子和那些已知在植物中發(fā)揮作用的終止子包括CaMV35S終止子、tml終止子、pearbcSE9終止子和本領(lǐng)域已知的其他終止子。合適的終止區(qū)域也可以得自農(nóng)桿根群菌(ltumefaciens)的Ti質(zhì)粒，例如章魚堿合成酶和胭脂堿合酶終止區(qū)域。參見，例如Rosenberg等人，Gene,56，125(1987)；Guerineau等人，Mol.Gen.Genet.，262,141-144(1991)；Proudfoot,Cell,64，671-674(1991)。除上述以外，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體也可以包含可以調(diào)節(jié)表達(dá)水平的任意其他序列。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多序列從轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)增強(qiáng)基因表達(dá)，并且這些序列可以與編碼序列共同使用，以提高在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。已經(jīng)表明許多內(nèi)含子序列增強(qiáng)表達(dá)，尤其是在單子葉細(xì)胞中的表達(dá)。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)玉米Adhl基因的內(nèi)含子導(dǎo)入玉米細(xì)胞時(shí)，顯著增強(qiáng)其同源的啟動(dòng)子下的野生型基因的表達(dá)(Callis等人，GenesDevelop.1，1183-1200(1987))。內(nèi)含子序列常規(guī)地引入到植物轉(zhuǎn)化載體中，通常是引入到非翻譯的前導(dǎo)區(qū)內(nèi)。所述構(gòu)建體也可以包括與合適的核苷酸序列可操作地連接的調(diào)控子，所述調(diào)節(jié)子例如葉綠體定位信號、葉綠體特異啟動(dòng)子、用于驅(qū)動(dòng)同源同源重組的葉綠體特異序列、核定位信號(Lassner等人，PlantMolecularBiologyl7,2四_2；34(1991))、植物翻譯共有序^lJ(Joshi,C.P.,NucleicAcidsResearchl5,6643-6653(1987))、內(nèi)含子(Luehrsenandffalbot,Mol.Gen.Genet.225，81-93(1991))等。通常使用的植物轉(zhuǎn)化載體為通過感染遞送DNA的農(nóng)桿菌屬載體。其他載體包括基因槍載體和適用于DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的載體。這些方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的。參見，例如，C.P.Lichtenstein禾口S.L.Fuller,的綜述“Vectorsforthegeneticengineeringofplants，，,GeneticEngineering,ed.P.W.J.Rigby,vol.6,104-171(AcademicPressLtd.1987)。本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法也可用于捕獲二氧化碳?？諝饪梢杂糜谶@種捕獲，雖然如果空氣富含二氧化碳時(shí)其是優(yōu)選的，例如空氣可以含有高達(dá)10%的二氧化碳。此外，為了使能夠更有效地捕獲二氧化碳，其允許進(jìn)一步憑借制備可用于植物細(xì)胞的額外的碳來生產(chǎn)生物質(zhì)?？梢酝ㄟ^將含有二氧化碳的空氣提供給臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器來實(shí)現(xiàn)二氧化碳的捕獲。二氧化碳的來源可以來自任何來源，包括大氣二氧化碳、二氧化碳罐，發(fā)電廠的廢氣或燃燒和/或發(fā)酵室的廢氣。為了調(diào)節(jié)臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器中生長培養(yǎng)基的pH和葉生物質(zhì)的生長，可以有利地控制二氧化碳的濃度。生物燃料可以通過具有以下步驟的方法制備使葉生物質(zhì)在以上描述的臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器中生長，例如所述生物反應(yīng)器為一個(gè)或多個(gè)封閉的臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器；以連續(xù)的、半連續(xù)的或分批模式方法收獲葉生物質(zhì)；以及將來自葉生物質(zhì)的脂質(zhì)或碳水化合物轉(zhuǎn)變?yōu)樯锶剂稀Ｋ鲋|(zhì)或碳水化合物從葉生物質(zhì)中的提取可以在轉(zhuǎn)變?yōu)樯锶剂现盎蛘咦鳛檗D(zhuǎn)變?yōu)樯锶剂系倪^程的一部分。可供選擇地，所述脂質(zhì)或碳水化合物可以由葉生物質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，并從培養(yǎng)基中收獲，用于轉(zhuǎn)變?yōu)樯锶剂?。為了改進(jìn)由葉生物質(zhì)制備生物燃料，可以將生物質(zhì)經(jīng)受環(huán)境壓力或幾個(gè)壓力的組合，從而提高脂質(zhì)或碳水化合物的產(chǎn)量。為了改進(jìn)將要轉(zhuǎn)變?yōu)樯锶剂系闹|(zhì)或碳水化合物的產(chǎn)量和可達(dá)性(例如通過促進(jìn)分泌到培養(yǎng)基中)，所述葉生物質(zhì)也可以是經(jīng)基因工程改造的。生物柴油可以通過酯基轉(zhuǎn)移過程由油/脂質(zhì)制備，并且是一種組成上與化石/礦物柴油類似的液體。它的化學(xué)名稱是脂肪酸甲酯(或乙酯)(FAME)。將油與氫氧化鈉和甲醇(或乙醇)混合，而化學(xué)反應(yīng)生成生物柴油(FAME)和甘油。生物醇化合物是生物制備的醇，最常見的是乙醇(生物乙醇)和不太常見的是丙醇和丁醇，并且其是通過微生物和酶的作用，經(jīng)糖、淀粉或纖維素的發(fā)酵制備的。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了在體外植物細(xì)胞中制備多肽的方法，所述方法包括提供含有葉綠體的未分化植物細(xì)胞，所述葉綠體攜帶編碼所述多肽的轉(zhuǎn)基因核酸分子，其中所述植物細(xì)胞顯示同型異源性；和根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法增殖植物細(xì)胞，以制備含有多肽的葉生物質(zhì)，換句話說，所述細(xì)胞通過包括以下步驟的方法增殖，即提供未分化植物細(xì)胞，將植物細(xì)胞與促進(jìn)細(xì)胞分化為葉組織的試劑接觸，和使細(xì)胞在臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)體系中生長?？梢允褂靡陨厦枋龅募皩?shí)施例中的方法將轉(zhuǎn)基因核酸分子導(dǎo)入到葉綠體中。所謂同型異源性，我們指植物細(xì)胞的每個(gè)葉綠體中大部分或所有的多拷貝葉綠體DNA都被轉(zhuǎn)化的情況。同型異源性可以通過在含有選擇性劑的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)轉(zhuǎn)質(zhì)體材料數(shù)代來實(shí)現(xiàn)。所述選擇性劑與轉(zhuǎn)化構(gòu)建體中使用的選擇性標(biāo)記相結(jié)合，并且可以是任何適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記，如抗生素的抗性基因，所述抗生素如壯觀霉素或卡那霉素。應(yīng)用DNA印跡法對同型異源性的實(shí)現(xiàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證。提供其中植物不是轉(zhuǎn)基因植物的未分化細(xì)胞的步驟包括放置植物切割碎片(植物材料)與植物激素接觸，然后該植物激素在這些切割碎片的邊緣生成愈傷組織；然后將所述愈傷組織亞培養(yǎng)為愈傷組織，并保持沒有任何選擇性。所述切割植物材料可以是整個(gè)或部分的根、葉、莖、花或種子。提供其中植物是轉(zhuǎn)基因植物的未分化細(xì)胞的步驟包括通過靶向葉綠體DNA的同源重組方法將轉(zhuǎn)基因核酸分子導(dǎo)入到植物細(xì)胞的葉綠體中。誘導(dǎo)含有轉(zhuǎn)基因核酸分子的植物細(xì)胞，從而形成未分化細(xì)胞的愈傷組織；和將該愈傷組織在有效實(shí)現(xiàn)同型異源性的條件下繁殖。所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體應(yīng)包含至少兩個(gè)與靶向葉綠體DNA相似(例如85%同源性以上)的核酸序列，從而實(shí)現(xiàn)同源重組(所謂的左右邊界)；選擇性標(biāo)記基因和編碼的肽或多肽序列；關(guān)于轉(zhuǎn)質(zhì)體未分化細(xì)胞的使用，同型異源性通過使用抗生素選擇來實(shí)現(xiàn)，例如使用鏈霉素、壯觀霉素或卡那霉素選擇?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來實(shí)現(xiàn)愈傷組織的同型異源性，所述方法包括但不限于(i)將核酸導(dǎo)入葉的葉綠體DNA中，再生成(生長)植物，將該植物繼代培養(yǎng)(將其切片，置于選擇性培養(yǎng)基上，從而從葉部分再生苗)至少2次以達(dá)到同型異源性。當(dāng)例如通過DNA印跡檢測到同型異源性時(shí)，將選擇的植物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中從而生成根，并在最后將選擇的植物轉(zhuǎn)移到土壤中，直到其長出花和種子。然后將種子種于選擇性培養(yǎng)基上，并且將長出的苗用于生成愈傷組織。(ii)按照上述⑴的方法，但是沒有將植物轉(zhuǎn)移到土壤中并開花。一旦達(dá)到同型異源性，便將所述植物的葉用于生成愈傷組織。(iii)將核酸導(dǎo)入到葉的葉綠體DNA中，然后當(dāng)?shù)谝粋€(gè)葉子長出時(shí)，在選擇性培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織(該植物材料為異源質(zhì)體，因?yàn)槠浜修D(zhuǎn)化的與未轉(zhuǎn)化的葉綠體DNA的混合物，其可以通過DNA印跡來驗(yàn)證)，然后將愈傷組織(callus)在選擇性培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)為多個(gè)愈傷組織(cal1i)，直到其最后達(dá)到同型異源性。(iv)將所述核酸導(dǎo)入到未分化細(xì)胞的葉綠體DNA中，并在選擇性培養(yǎng)基上將轉(zhuǎn)質(zhì)體愈傷組織繼代培養(yǎng)為愈傷組織，直到達(dá)到同型異源性。優(yōu)選地，所述核酸分子包含選擇性標(biāo)記基因。通常，所述選擇性標(biāo)記基因是抗生素抗性基因，例如aadA、nptII、AphVI。通常，將核酸分子插入到載體或PCR片段中。通常，載體是質(zhì)粒，并且通常載體可以在大腸桿菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中增殖。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒是葉綠體轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。優(yōu)選的是，多肽的表達(dá)是通過強(qiáng)的葉綠體特異啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)的。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子包括16SrRNA啟動(dòng)子、psbA啟動(dòng)子和rbcL啟動(dòng)子。植物細(xì)胞和葉綠體轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且包括以上所討論的禾口如SambrookandRussell(2001),MolecularCloning,Alaboratorymanual；GriersonandCovey(1988)Plantmolecularbiology禾口Watson等人(1997)RecombinantDNA中描述的轉(zhuǎn)基因方法。在生長培養(yǎng)基中可利用的光的量和/或蔗糖的量可以影響多肽的制備。為了制備每個(gè)特異性多肽，技術(shù)人員可以基于使用的植物材料和制備需要的生物質(zhì)，容易地優(yōu)化所述生長培養(yǎng)基和包括氣體混合物(例如，二氧化碳濃度)的條件。本發(fā)明的第二個(gè)方面的方法優(yōu)選地包括進(jìn)一步從葉生物質(zhì)中獲得多肽的步驟。如此獲得的多肽也包括在本發(fā)明中。適當(dāng)?shù)?，所述多肽通過壓碎葉組織從而生成組織提取物并從該組織提取物中分離多肽而獲得。適當(dāng)?shù)兀褂眠^濾、HPLC、離子交換樹脂提取、疏水相互作用樹脂提取、親和層析或油水相分離法中的至少一種，從所述組織提取物中純化多肽。所述多肽可以含有用于純化多肽的標(biāo)簽。所述標(biāo)簽可以為可裂解或不可裂解的標(biāo)簽，例如GST、生物素、6His、Mr印、HA或myc標(biāo)簽中的任一種。本發(fā)明還包括通過本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法獲得的葉生物質(zhì)。由所述方法獲得的多肽可以是治療性多肽、酶、生長因子、免疫球蛋白、激素、結(jié)構(gòu)14蛋白、植物應(yīng)激反應(yīng)中牽涉的蛋白、生物藥物或疫苗抗原中的任一種。本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了用于獲得存在于葉生物質(zhì)中的成分的方法，所述方法包括根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面制備葉生物質(zhì)和從所述葉生物質(zhì)中獲得所述成分。通常，所述成分以大體上純的形式獲得，因而所述方法可以包括純化所述成分的進(jìn)一步的步驟。所述的大體上純的形式通常包含>90%、或>95%或>99%的所述成分。所述成分可以通過其從葉生物質(zhì)中的分泌或通過從葉生物質(zhì)中提取獲得，所述提取例如通過壓碎葉生物質(zhì)以釋放所述成分。所述獲得的成分可以是藥用物質(zhì)、重組表達(dá)多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、油、揮發(fā)性芳香族化合物、抗氧化劑、色素、香味劑或香味劑前體；并且所述成分可以是內(nèi)源性的或外源性的。本發(fā)明還提供了將所獲得的成分加工為進(jìn)一步產(chǎn)品，例如生物燃料、食品或藥用女口廣PFtο本發(fā)明還包括用于在體外植物細(xì)胞中生產(chǎn)多肽的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括促進(jìn)未分化細(xì)胞分化為葉組織的試劑；和編碼多肽的核酸分子，所述核酸分子適用于導(dǎo)入到葉綠體中并在葉綠體中表達(dá)。本發(fā)明的再一個(gè)方面提供了捕獲二氧化碳的方法，所述方法包括進(jìn)行本發(fā)明的第一個(gè)方面所述的方法。純化樣品的方法包括將所純化的樣品暴露于得自本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法的葉生物質(zhì)。所述純化過程可以是去除一種或多種毒素。還提供了生產(chǎn)藥物組合物的方法，所述方法包括配制通過本發(fā)明的其他方面的方法獲得的成分和藥學(xué)上可接受的載體稀釋劑、賦形劑或載體。此外，提供了醫(yī)藥產(chǎn)品，所述醫(yī)藥產(chǎn)品包含通過本發(fā)明其他方面的方法獲得的成分和藥學(xué)上可接受的載體稀釋劑、賦形劑或載體。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了生產(chǎn)生物燃料的方法，該方法包括將通過本發(fā)明的其他方面的方法獲得的成分進(jìn)行發(fā)酵或酯基轉(zhuǎn)移。還提供了通過這種生產(chǎn)方法獲得的生物燃料。現(xiàn)參考以下的非限制性實(shí)施例和附圖來更詳細(xì)地描述本發(fā)明。圖1.轉(zhuǎn)質(zhì)體GFP-6系的DNA印跡分析(A)靶向的葉綠體區(qū)域中野生型煙草(Nicotianatabacum)品種petitHavana(fft-ptDNA)和轉(zhuǎn)化的(T_ptDNA)煙草原質(zhì)體系的物理圖譜。每個(gè)圖譜下的箭頭表示各自的基因組DNA經(jīng)BglII酶消化后預(yù)測的DNA片段大小。白色表示載體序列，而橙色為煙草原質(zhì)體系序列。(B)轉(zhuǎn)基因系GFP-6(GFP-6)和野生型煙草的全基因組DNA使用BglII消化后的DNA印跡分析。將消化的基因組DNA在0.7%(w/v)的瓊脂糖凝膠上跑膠，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并使用對應(yīng)于由引物PHK40-F和rpsl2-0Ut-R(黑色條)擴(kuò)增靶向區(qū)域的Dig-標(biāo)記的PCR片段進(jìn)行探測。圖2.在轉(zhuǎn)質(zhì)體GFP-6煙草系中GFP+的檢測。在GFP-6同型異源系(GFP-6)中在UV及可見光下可視化GFP表達(dá)(A)，對照為野生型(wt)煙草植株。(B)來自GFP-6和野生型系的可溶性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)電泳。將每種植物的5μg全可溶性蛋白提取物和預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)記物(NewEnglandBiolabs1UK)點(diǎn)樣于12.5%(w/v)SDS-PAGE凝膠上，通過銀染可視化蛋白質(zhì)分離。使用特異性抗GFP抗體，通過蛋白質(zhì)印跡特異性檢測GFP。也顯示了與染色的標(biāo)記的遷移。圖3.在不同轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草組織中GFP+的表達(dá)。生成了來自GFP-6和野生型煙草的愈傷組織、細(xì)胞懸浮液和葉的全部可溶性蛋白質(zhì)提取物。對于愈傷組織和細(xì)胞懸浮液，在12.5%(w/v)SDS-PAGE凝膠上，每個(gè)泳道點(diǎn)樣5yg全可溶性蛋白，然而對于葉提取物每個(gè)泳道只點(diǎn)樣lyg。(A)對應(yīng)于銀染凝膠，然而(B)代表使用GFP抗體的相應(yīng)蛋白質(zhì)印跡。GFP標(biāo)準(zhǔn)品購自RocheLifeScience，UK，而預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)記購自NewEnglandBiolabs，UK。標(biāo)記蛋白的梯狀大小以kDa計(jì)。Wt代表煙草(Nicotianatabacum)品種PetitHavana，而大腸桿菌(E.coli)對應(yīng)于從使用pFMGFP轉(zhuǎn)化的E.coliKRX菌株中提取的蛋白質(zhì)。圖4.在不同條件下GFP-6轉(zhuǎn)質(zhì)體愈傷組織的生長。在25°C下生長4周后拍攝同型異源愈傷組織GFP-6的照片。采用與煙草育苗相似的密度，以16/光照生長平板(A，B，C*D)和在黑暗中生長(E，F(xiàn)，G和H)。只有A、B、E和F的培養(yǎng)基中含有3%(w/v)的蔗糖。所有的培養(yǎng)基含有500mg/L的壯觀霉素和500mg/L的鏈霉素。在490nm下激發(fā)后，使用Axiovert200M倒置顯微鏡(CarlZeiss,Goettingen,Germany)以及Axiovision軟件(Version3·0)，在520nm下檢測熒光發(fā)射。對于A、D和E、H的熒光曝光分別是30ms、IOOms和600ms。在A、D、E和H中的顯微鏡放大倍數(shù)相同，為40X。圖5.在不同條件下生長的GFP-6愈傷組織中GFP+的檢測。從光(L)或黑暗(D)下生長的愈傷組織以及光和糖下生長的野生型(Wt)中提取全可溶性蛋白。培養(yǎng)基中蔗糖的存在以(+)表示，然而沒有蔗糖的培養(yǎng)基以(_)表示。將各個(gè)愈傷組織的5μg全可溶性蛋白點(diǎn)樣于12.5%(w/v)SDS-PAGE凝膠上(L_，L+,D+,D-,wt)，并通過銀染檢測全蛋白的含量(A)。M代表預(yù)染色的蛋白標(biāo)記(NewEnglandBiolabs1UK),并且在左側(cè)以kDa表示相應(yīng)的大小。(B)GFP+的存在使用抗GFP抗體進(jìn)行特異性檢測。將GFP標(biāo)準(zhǔn)品(Upstate,USA)按納克顯示的含量加入。圖6.在來自臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器的新形成的綠色生物質(zhì)中GFP+的表達(dá)。6周的孵育期后，將GFP-6系(A)的煙草生物質(zhì)從臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器中移去。使用丙酮提取方案從新形成的葉中提取全蛋白，并將全蛋白連同預(yù)染色的低范圍的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)品(Bio-fcidLaboratories,UK)點(diǎn)樣于10%(w/v)SDS_PAGE凝膠上。使用考馬斯亮藍(lán)染色，使來自野生型(wt)和GFP-6系(GFP-6)的蛋白可視化。將不同稀釋度的丙酮粉通過使用抗GFP抗體的免疫印跡分析(C)，并與已知含量的GFP蛋白(Upstate，USA)進(jìn)行比較。圖7.丙酮沉淀方案期間GFP的檢測。表示來自丙酮提取方案中不同步驟的幾個(gè)樣品中GFP存在的蛋白質(zhì)印跡。將沉淀直接重懸浮在上樣緩沖液中，然而在上樣緩沖液加入前將清洗物在speedvac(Savant，NY，USA)中干燥過夜。沉淀⑵樣品只點(diǎn)5μ1，然而來自清洗物(W)的所有上清液為1-4倍。圖8.煙草(Nicotianatabacum)品種PetitHavana細(xì)胞懸浮液的干重和鮮重。在18天的生長期間中每2天測定一次煙草野生型細(xì)胞的鮮重和干重。干重為將新鮮煙草細(xì)胞在80°C下放置24h后測量得到。測量重復(fù)進(jìn)行三次。棚列1側(cè)丨·糖隨十謝本搞終艦猶目胃0概要葉綠體轉(zhuǎn)化是用于植物重組蛋白的商業(yè)制備的有前途的方法。然而，對于本領(lǐng)域中大規(guī)模培養(yǎng)轉(zhuǎn)質(zhì)體植物仍舊存在基因約束的問題。這里，我們評價(jià)了使用煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞懸浮液在模型蛋白質(zhì)的完全約束制備中的潛力，所述模型蛋白質(zhì)為綠色熒光蛋白(GFP+)的修飾形式。轉(zhuǎn)質(zhì)體葉中，GFP+的表達(dá)達(dá)到全可溶性蛋白(TSP)的大約60%。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中的表達(dá)少得多(1.5%的TSP)，但是每升液體培養(yǎng)物仍仍舊產(chǎn)生約7.2mgo我們進(jìn)一步研究了影響愈傷組織中GFP+制備的不同因素和強(qiáng)調(diào)了作為輸入的光的重要性。最后，我們描述了新蛋白質(zhì)的制備平臺(tái)的開發(fā)，在該平臺(tái)中，在噻苯隆的存在下，將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物置于臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器中，以開始苗的形成。GFP+的產(chǎn)量達(dá)到了可觀的每L的生物反應(yīng)器660mg。這個(gè)新的制備平臺(tái)與轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的快速生成和臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器的使用組合，是用于重組蛋白的完全約束的低成本制備的有前途的途徑。結(jié)果表達(dá)GFP+的同型異源性煙草苗的產(chǎn)生構(gòu)建用于表達(dá)煙草葉綠體中的GFP+的載體得自pJSTIO，所述pJSTIO用于表達(dá)煙草葉綠體中的TetC抗原(Tregoning等人，200。質(zhì)粒pJSTIO靶向煙草葉綠體基因rrnl6S和rpsl2/7之間的表達(dá)和選擇盒的插入(圖1A)。轟擊后，由10次獨(dú)立轟擊生成一些壯觀霉素抗性苗，并在分析的6個(gè)中的4個(gè)苗中通過PCR分析檢測gfp+整合(數(shù)據(jù)未顯示)。選擇GFP-6用于進(jìn)一步的試驗(yàn)，并在MS選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行了四輪繼代培養(yǎng)。為了證實(shí)將所有GFP-6系的葉綠體轉(zhuǎn)化，從該植物的葉子中提取全基因組DNA，用BglII消化，并進(jìn)行DNA印跡分析(圖1)。和預(yù)期的一樣，對應(yīng)于插入位點(diǎn)的探針與野生型煙草DNA中的4.5kb的單一條帶雜交。相反地，在GFP-6系中檢測到了7.Ikb條帶，該GFP-6系與gfp+基因和選擇性標(biāo)記的插入一致。GFP-6中4.5kb條帶的缺少也表明GFP-6是同型異源性的(圖IB)。GFP-6系中GFP+的表達(dá)將煙草GFP-6系在土壤中生長，并通過將植物暴露于UV/藍(lán)色光源來檢測GFP+的表達(dá)(圖2A)。強(qiáng)的綠色熒光可以在GFP-6中觀察到，但是在野生型中觀察不到，表明了GFP-6中GFP+的表達(dá)。為了證實(shí)GFP的累積，從GFP-6和野生型系中提取全可溶性蛋白，并在SDS-PAGE凝膠上將其分離(圖2B)。使用特異性抗GFP抗體的免疫印跡分析證實(shí)了GFP+的累積和顯著分解產(chǎn)物的缺乏。銀染(圖2B)和考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠(數(shù)據(jù)未顯示)顯示遷移至27kDa的GFP+高度表達(dá)，并且是可溶性提取物中的主要蛋白。GFP-6煙草系在葉子、愈傷組織和細(xì)胞懸浮液中表達(dá)水平的比較將從GFP-6系獲得的TO種子在MS平板上體外發(fā)芽，并且將得到的幼嫩葉子用于產(chǎn)生相應(yīng)的轉(zhuǎn)質(zhì)體愈傷組織和細(xì)胞懸浮液。在親本植物GFP-6的愈傷組織狀態(tài)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物和葉子中，通過SDS-PAGE(圖3A)和半定量免疫印跡分析(圖;3B)，使用已知量的在市場上可得到的GFP作為標(biāo)準(zhǔn)，來評價(jià)GFP+的表達(dá)。該對比的最明顯的結(jié)果是，與愈傷組織和細(xì)胞懸浮液相比，煙草葉子中極高水平的GFP+表達(dá)(圖3A)。免疫印跡表明，葉子中GFP+的表達(dá)是TSP的約60%，其等于按鮮重計(jì)約5mg/g，然而在愈傷組織和細(xì)胞懸浮液中的表達(dá)為TSP的約1.5%(圖;3B)?？紤]到細(xì)胞懸浮液的生長(補(bǔ)充的圖8)，將轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞懸浮液中GFP+生產(chǎn)的速率估計(jì)為大約0.4mg/L/天。光和糖對愈傷組織中GFP表達(dá)的影響為了評估光和外源蔗糖對GFP+表達(dá)的重要性，將來自GFP-6系的轉(zhuǎn)質(zhì)體愈傷組織在使用或不使用光和使用或不使用蔗糖(圖4)，但是在用于維持選擇的500mg/L壯觀霉素的存在下，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長大約一個(gè)月。如圖4所示，通過添加蔗糖，愈傷組織生長得到顯著促進(jìn)，其與光的強(qiáng)度無關(guān)。當(dāng)將光和糖兩者都用于轉(zhuǎn)質(zhì)體愈傷組織時(shí)，可以鑒定到大量的表達(dá)GFP+的小葉綠體/質(zhì)體，所述小葉綠體/質(zhì)體分散在胞質(zhì)溶膠中(圖4A)。如果沒有為愈傷組織提供光和糖，則GFP熒光減少和葉綠體/質(zhì)體的量降低并分布于細(xì)胞中心(圖4D和4E)。在缺乏光和糖下生長的愈傷組織中沒有檢測到GFP表達(dá)(圖4H)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明，在完全黑暗中生長的細(xì)胞表達(dá)的GFP很少或幾乎不表達(dá)，然而在有光下，不考慮蔗糖的存在與否，表達(dá)均升高(圖5)。當(dāng)在光和蔗糖(L+)存在下生長時(shí)，通過免疫印跡估計(jì)GFP+表達(dá)的水平為TSP的約4%(圖5)。當(dāng)正常化到愈傷組織的鮮重和干重時(shí)，該估計(jì)值分別相當(dāng)于高達(dá)48μg/gf.w.(鮮重)或約lmg/gd.w.(干重)的GFP+表達(dá)水平。用于轉(zhuǎn)質(zhì)體生物質(zhì)的制備的臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器的使用考慮到葉組織中轉(zhuǎn)質(zhì)體基因的表達(dá)似乎是最高的，我們尋求開發(fā)用于從愈傷組織/細(xì)胞懸浮液中快速制備葉組織的方法。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)已知促進(jìn)煙草中體細(xì)胞胚生長的噻苯隆(TDZ)的添加，能夠誘導(dǎo)由在固體MS培養(yǎng)基上生長的GFP-6愈傷組織形成苗(數(shù)據(jù)未顯示)。為了擴(kuò)大生產(chǎn)能力，將來自煙草GFP-6系的轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞懸浮液裝載于2L的生物反應(yīng)器中，并臨時(shí)浸入到補(bǔ)加了0.1μΜTDZ的MS培養(yǎng)基中。約6周后，產(chǎn)生了大量的苗(圖6Α)。在第一個(gè)14天期間，沒有檢測到生長，并且苗僅在這個(gè)期間后才開始生長。可能該停滯期與細(xì)胞從愈傷組織再分化為煙草葉組織需要的時(shí)間有關(guān)，所述細(xì)胞再分化與在擬南芥中觀察到的愈傷組織和分生組織間的轉(zhuǎn)換方式相似(Gordon等人，2007)。40天后，將全部生物質(zhì)從生物反應(yīng)器中移除用于分析。植物材料的檢查揭示存在的主要為健康葉片，少量為玻璃化的。2L的生物反應(yīng)器中產(chǎn)生總量為鮮重約470g的生物質(zhì)。為了估計(jì)在該生物質(zhì)中產(chǎn)生的GFP+的量，基于丙酮中的蛋白質(zhì)沉淀開發(fā)了蛋白質(zhì)沉淀方案。使用該方法生產(chǎn)了粉末，稱重后，將其點(diǎn)樣于SDS-PAGE凝膠上以檢測生成的GFP+(圖6B)。檢測到約27kDa大小的清晰條帶，而野生型中沒有。為了定量轉(zhuǎn)質(zhì)體生物質(zhì)中GFP+的產(chǎn)量，將幾個(gè)量的丙酮粉末點(diǎn)樣，并通過免疫印跡將1μg這種粉末估計(jì)為含有大約150ngGFP+(圖6C)。這表明表達(dá)水平達(dá)到了約2.8mg/g鮮重。在該生物反應(yīng)器中，在40天生長時(shí)間內(nèi)，在近似速率17mg/L/天的GFP下，總的GFP產(chǎn)量達(dá)到了約660mg/L。這個(gè)值比0.%ig/L/天的細(xì)胞懸浮液可潛在達(dá)到的速率高約42倍。討論煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物到目前為止，在葉綠體轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中大部分工作集中在用于表達(dá)數(shù)個(gè)目的基因的葉片上。已經(jīng)對轉(zhuǎn)質(zhì)體馬鈴薯塊(Sidorov等人，1999)和轉(zhuǎn)質(zhì)體番茄果實(shí)(Ruf等人，2001)中的表達(dá)進(jìn)行了一些工作，但是表達(dá)量相對很少(分別為TSP的0.05%和0.5%)。然而，種植轉(zhuǎn)基因植物，即使它們是轉(zhuǎn)質(zhì)體的，但大量公眾仍然領(lǐng)會(huì)到嚴(yán)重性并且可能的環(huán)境問題可以對任何未來的發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重影響。此外各個(gè)新的轉(zhuǎn)質(zhì)體領(lǐng)域的獲準(zhǔn)有非常顯著的監(jiān)管費(fèi)用。在基于約束轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞的培養(yǎng)物中制備重組蛋白將克服許多這樣的問題并且由于這種新制備體系的高度約束本性能顯著降低調(diào)節(jié)費(fèi)用。為了對比不同類型的表達(dá)系統(tǒng)，我們首次創(chuàng)建了煙草的同型異源性系，該同型異源性系表達(dá)綠色熒光蛋白變體(GFP+)的變體。先前已經(jīng)顯示，GFP在包括煙草(Khan和Maliga,1999；Newell等人，2003)、馬鈴薯(Sidorov等人，1999)和萵苣(Kanamoto等人，2006)在內(nèi)的一系列不同植物的葉綠體中能夠高度表達(dá)。此處描述的GFP表達(dá)的水平在葉中TSP的大約60%，處于表達(dá)的高端，并且與萵苣中觀察到的GFP表達(dá)的值相似，在萵苣中GFP實(shí)現(xiàn)了TSP的36%(Kanamoto等人，2006)。我們的結(jié)果清楚地顯示，與葉中的在TSP的1.5到4%變化的水平(圖3和5)相比，愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中GFP+表達(dá)的水平較低，所述葉的GFP+表達(dá)水平與臨時(shí)轉(zhuǎn)質(zhì)體萵苣愈傷組織中GFP的表達(dá)為TSP的1%相似(Lelivelt等人，2005)。轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞懸浮液中GFP+的表達(dá)達(dá)到TSP的約1.5%，其對應(yīng)于7.2mg/L,生產(chǎn)速率為O.^ig/L/天(圖5)。該表達(dá)水平可能通過優(yōu)化培養(yǎng)基，例如通過添加聚乙烯吡咯烷酮和/或明膠來提高，該提高有助于改進(jìn)在核轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的量(Kwon等人，2003;Lee等人，2002)。我們也顯示當(dāng)光和糖的量更好地優(yōu)化時(shí)，GFP+水平可提高至約TSP的4%(圖5)。如果該結(jié)果外推至細(xì)胞懸浮液生長期，GFP的產(chǎn)量可以潛在地達(dá)到約lmg/L/天。影響轉(zhuǎn)質(zhì)體愈傷組織中GFP+產(chǎn)量的因子轉(zhuǎn)質(zhì)體愈傷組織和細(xì)胞懸浮液中通常較低的表達(dá)水平可以直接通過葉綠體轉(zhuǎn)化載體的選擇和特別地通過驅(qū)動(dòng)GFP+表達(dá)的各個(gè)啟動(dòng)子來解釋。pFMGFP中使用的RNA16S基因的啟動(dòng)子，Prrn，與來自水稻的RNA16S啟動(dòng)子相似，所述RNA16S啟動(dòng)子在水稻胚胎發(fā)生細(xì)胞中的活性與其在葉子中的活性相比降低了7倍(Silhavy和Malign1998)。由于細(xì)胞懸浮液質(zhì)體相對于葉片葉綠體分化較少，此處可能發(fā)生了相同的現(xiàn)象。然而，進(jìn)一步的工作將必須評估葉和愈傷組織兩者中GFPmRNA的水平從而能夠區(qū)分mRNA水平的降低或可能的葉綠體數(shù)目改變。光對于顯著GFP+表達(dá)似乎是明顯必需的(圖5)，然而蔗糖表現(xiàn)為與增加的細(xì)胞生長更為相關(guān)。然而，這些結(jié)果可能是有偏見的，由于盡管在黑暗中一個(gè)月的培養(yǎng)期，GFP+非常穩(wěn)定并且在黑暗下的補(bǔ)充蔗糖的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織中檢測到的表達(dá)可以相當(dāng)于在將其轉(zhuǎn)移到黑暗中前，來自煙草細(xì)胞的殘留GFP+的量。事實(shí)上，在馬鈴薯微管中由相同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP的表達(dá)只達(dá)到TSP的0.05%(Sidorov等人，1999)，其可能表明在prrn啟動(dòng)下GFP的表達(dá)的真實(shí)基線遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此處觀察到的基線。在我們的實(shí)驗(yàn)中，可注意的到，愈傷組織和細(xì)胞懸浮液保持綠色，并且具有大量的葉綠體廣泛散布在細(xì)胞各處(圖4A)。在這些細(xì)胞中GFP+達(dá)到約TSP的4%，并且此種高的水平可能表明這些細(xì)胞實(shí)際上是臨時(shí)的細(xì)胞懸浮液，所述臨時(shí)的細(xì)胞不能完全去分化，并且在這些細(xì)胞中，質(zhì)體仍與功能性葉綠體相似。臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)質(zhì)體生物質(zhì)的生產(chǎn)葉中GFP+產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于未分化細(xì)胞中的GFP+產(chǎn)量(圖3)，因此嘗試促進(jìn)從轉(zhuǎn)質(zhì)體愈傷組織的誘導(dǎo)苗。向固體培養(yǎng)基中添加噻苯隆(TDZ)，6周后能夠誘導(dǎo)苗由愈傷組織的形成(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣地，在洋紅色盒子中觀察到的生長不是線性的，并且在前二周內(nèi)沒有檢測到特別的生長。然而，當(dāng)將轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞懸浮液置于臨時(shí)浸漬條件下時(shí)，“葉”材料的制備是有效和顯著的，并且最終生物質(zhì)的生成非常豐富，在所述條件下使用臨時(shí)浸漬類型生物反應(yīng)器將細(xì)胞材料偶爾浸入液體中，僅持續(xù)短的時(shí)間(圖6A)。在基于固體培養(yǎng)基的誘導(dǎo)和基于臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器的誘導(dǎo)兩者中都觀察到生物質(zhì)生長中相似的停滯期，在所述臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器中，在最初的2周內(nèi)沒有檢測到生長。所述材料主要由健康小葉組成并且估計(jì)所述GFP+的含量達(dá)到約0.66g/L(圖6C)。這些值稍微低于在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(Wilke和Katzek，2003)中觀察到的產(chǎn)量，但卻是基于植物的系統(tǒng)中獲得的最高產(chǎn)量之一。另外，該表達(dá)水平是在沒有任何優(yōu)化的情況下獲得的，并且將來的發(fā)展應(yīng)該改進(jìn)工藝的產(chǎn)量和可擴(kuò)展性。例如，以玻璃瓶換成一次性袋子使得采用臨時(shí)浸漬生成的咖啡體細(xì)胞胚的量幾乎翻倍(Ducos等人，2008)，這可能是由于更好地光透過和再分配。如果將相似的系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草苗，產(chǎn)量可以達(dá)到超過lg/L。這里描述的適當(dāng)規(guī)模的系統(tǒng)應(yīng)比溫室中制備整個(gè)植株所花費(fèi)的勞動(dòng)強(qiáng)度少很多，并且也不需要溫室防護(hù)設(shè)施。其也可以為來自轉(zhuǎn)化組織的靶蛋白的制備提供潛在更快的途徑，因?yàn)椴恍枰煞N子。實(shí)際上，一旦鑒定了同型異源性煙草系，則要獲得適于臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物只需要一個(gè)月，然而，如果需要生成種子，則約3個(gè)月是必需的(Molina等人，2004)。因而，轉(zhuǎn)質(zhì)體苗的臨時(shí)浸漬生長與最近描述的一次性生物反應(yīng)器(Terrier等人2007;Ducos等人，2008)的組合是植物中生物藥物的低成本制備的有希望的途徑。實(shí)驗(yàn)過程煙草苗、愈傷組織和細(xì)胞懸浮液的生成在25°C下，將煙草品種PetitHavana(煙草)幼苗、愈傷組織和細(xì)胞懸浮液在30%濕度的Fi-iTotron600H培養(yǎng)箱(Sanyo,Watford,UK)中，在16小時(shí)光周期(約100μmol/m2/s)下生長。將煙草幼苗在MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)上萌發(fā)，并通過將葉的小碎片置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(CIM)上來生成愈傷組織，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為補(bǔ)加了lmg/L的1-萘乙酸(NAA)和0.lmg/L激動(dòng)素(K)的MS培養(yǎng)基。細(xì)胞懸浮液通過將大量的愈傷組織在缺少瓊脂的CIM培養(yǎng)基中，于140rpm的恒速攪拌下孵育產(chǎn)生。所有的植物激素和培養(yǎng)基均購自Sigma,StLouis,MO,USA。葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建通過使用Ndel和^Cbal限制性位點(diǎn)雙酶切先前表征的煙草葉綠體載體PJSTlO(Tregoning等人，2003)，將TeTC基因用gfp+基因Gcholz等人，2000)替代來創(chuàng)建葉綠體轉(zhuǎn)化載體pFMGFP。轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草植物的生成使用具有IlOOpsi的爆破片的PDS1000/He(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)基因槍設(shè)備，在其組成以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的RMOP培養(yǎng)基(Svab等人，1990)上用煙草葉綠體轉(zhuǎn)化載體pFMGFP對6周齡野生型煙草葉進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，所述MS培養(yǎng)基補(bǔ)加有l(wèi)mg/L的硫胺素、100mg/L的肌醇、lmg/LN6-芐基腺苷(BAP)和0.lmg/L的萘乙酸(NAA)。根據(jù)生產(chǎn)商的建議，將pFMGFP載體包被于550nm的金粒子(SeaShell1LaJolla1CA,USA)上。轟擊之后，將葉片在黑暗中保持48小時(shí)，然后在將植物材料切成小碎片(5mmχ5mm)并置于補(bǔ)加有500mg/L鹽酸壯觀霉素的RMOP培養(yǎng)基中。將壯觀霉素抗性苗在相同的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4代。DNA印跡分析整合到煙草原質(zhì)體系的載體使用在gfp+開始處退火的一個(gè)引物，和另一個(gè)位于煙草基因組載體pFMGFP的同源區(qū)域之外的引物通過PCR進(jìn)行評價(jià)(數(shù)據(jù)未顯示)，并且選擇了轉(zhuǎn)質(zhì)體GFP-6系用于所有進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。通過來自野生型和轉(zhuǎn)質(zhì)體GFP-6系兩者的經(jīng)酶切的全基因組DNA的DNA雜交來評價(jià)同型異源性狀態(tài)。用BglII酶切約7μg的基因組DNA，并在0.7%(w/v)的瓊脂糖凝膠上跑膠。通過毛細(xì)作用將DNA凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，在20χSSC緩沖液中過夜。MDIGHighPrimeDNALabellingandDetectionStarterKitII(RocheAppliedkience，UK)，在37°C下將探針進(jìn)行DIG標(biāo)記過夜。通過PCR獲得與靶區(qū)域同源的31Λ探針，所述PCR使用引物pJSTlO-F5’AATTCACCGCCGTATGGCTGACCGGCGA3’和Rps12-0UT-R5‘TTCATGTTCCAATTGAACACTGTCCATT3，，并用煙草基因組DNA作為模板。按照生產(chǎn)商的推薦以最終濃度為25ng/ml，進(jìn)行探針標(biāo)記和雜交。按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)，通過X射線膠片(Amersham，UppsalEi，Sweden)檢測具有給定的CSPD的特異性信號檢測。在通過DNA印跡分析證實(shí)同型異源性后，將GFP-6小植株轉(zhuǎn)移到土壤中，并使其產(chǎn)生種子。將該Ttl種子在補(bǔ)加有500mg/L壯觀霉素的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，并將幼嫩的Ttl葉子用于愈傷組織和細(xì)胞懸浮液的生成。蛋白質(zhì)提取首先，根據(jù)(Kanamoto等人，2006)進(jìn)行總可溶性蛋白質(zhì)的提取。將植物材料(葉片、愈傷組織、細(xì)胞懸浮液)使用液氮研磨成細(xì)粉末，并與總可溶性提取緩沖液混合(50mMHEPESpH7.6、lmMDTTUmMEDTA,2%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮和一片完全蛋白酶抑制劑不含EDTA的混合物(completeproteaseinhibitorsEDTA-freecocktail)(RocheProductsLtd,WelwynGardenCity,UK))。將植物混合物渦旋混合1分鐘，并在4°C下，以13，OOOrpm旋轉(zhuǎn)30分鐘。將上清液等分并儲(chǔ)存在-20°C下，直至進(jìn)一步使用。第二種方法是以總蛋白提取方案為基礎(chǔ)的丙酮沉淀法。將植物材料在液氮中研磨成細(xì)粉。將30ml提取緩沖液(80%(ν/ν)丙酮，5mM抗壞血酸鹽)加入到2g植物細(xì)粉或葉等同物中，并將該混合物使用Ultra-Turrax(IKA,Heidelberg,Germany)在冰上均質(zhì)15s。通過在4°C下，以5000g離心5分鐘來沉淀蛋白質(zhì)。棄去上清液，將沉淀用相同的提取緩沖液和相同的離心條件洗滌4次。然后，將沉淀重新懸浮在純丙酮中，并再次均質(zhì)。將所述蛋白在4°C下，以10，00(^旋轉(zhuǎn)一次以上，每次5!^11。棄去上清液，并將沉淀用純丙酮洗滌3次以上。在最后一次洗滌中，將該緩沖液等分，并使用Speed-Vac(Savant,Holbrook,NY,USA)干燥，并且將殘留的粉末稱為丙酮粉末。通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測沉淀和不同的洗滌液中GFP的存在(補(bǔ)充的圖7)。電泳和蛋白質(zhì)印跡分析將來自轉(zhuǎn)質(zhì)體和野生型樣品的蛋白質(zhì)連同蛋白質(zhì)標(biāo)記和可商購獲得的重組,MA,USA)用12.5%(w/v)SDS-PAGE凝膠再溶，用于定量目的。將蛋白凝膠直接用考馬斯亮藍(lán)或銀染染色。電泳后，根據(jù)生產(chǎn)商的建議，使用miniTrans-Blotsystem(Bio-Rad,Hercules,CA,USA),或通過使用iBlot干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Invitrogen，UK),將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.2μπι的硝酸纖維膜(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上。轉(zhuǎn)移之后，通過使用以120，000稀釋的第一兔多克隆抗GFP抗體(由ProfNixon，ImperialCollegeLondon,M提供)進(jìn)行GFP特異性檢測，而將第二抗體(辣根過氧化物酶綴合的羊抗兔免疫球蛋白G,Amersham,Uppsala,Sweden)稀釋為110，000。使用ECLSuperSignalWestPicoChemiluminescenceSubstrate試劑盒(PierceBiotechnologyInc.，UK)進(jìn)行生物化學(xué)檢測。臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器通過將大約7克的煙草品種PetitHavana細(xì)胞懸浮液置于2L的臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器中生成煙草生物質(zhì)(Ducos等人，2007)。在40天的時(shí)間內(nèi)，每三小時(shí)使用IL補(bǔ)加有0.1μM噻苯隆(TDZ,Sigma,UK)的MS培養(yǎng)基浸漬5分鐘。此外，所述培養(yǎng)基包含100mg/L的壯觀霉素來防止污染和選擇轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞。據(jù)雀巢公司的研究人員估計(jì)，基于培養(yǎng)皿中愈傷組織固體誘導(dǎo)，MS培養(yǎng)基中TDZ(噻苯隆)的濃度最優(yōu)為0.1μM(數(shù)據(jù)未顯示)。將培養(yǎng)基在3分鐘內(nèi)通過空氣泵推入2L的容器中，并使其通過重力在2分鐘以上退回到原始瓶中。光的條件和溫度與愈傷組織和細(xì)胞懸浮液的生長實(shí)驗(yàn)類似。熒光顯微鏡使用Axiovert200Μ倒置顯微鏡(CarlZeiss,Goettingen,Germany)和AxioVision軟件(3.O版)觀察表達(dá)GFP并來源于GFP-6系的轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草愈傷組織和細(xì)胞懸浮液。將對于GFP+檢測優(yōu)化的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設(shè)置在491nm和512nm(Scholz等人，2000)。曝光和放大倍數(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)改變，并將其顯示于每個(gè)圖。表Si.鮮重、干重和丙酮粉末之間的比率。計(jì)算這些比率以確定GFP的穩(wěn)健定量。對于鮮重(f.W.)、干重(d.w.)和丙酮粉末(粉末)，數(shù)值代表至少4次重復(fù)的平均值。在它們各自生長期的最后，收獲愈傷組織和懸浮液(細(xì)胞)，并對在2-3周幼嫩小植株(每株大約有4片葉子，與臨時(shí)浸漬生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的生物質(zhì)相似)進(jìn)行葉子的測量。組織粉末/d.w.(%)/葉6.6士0.928.3±1,1細(xì)胞4.4±0.314.1=1.4愈傷組織3.6二0.412.4=1.3參考文獻(xiàn)AzhagiriAKandMaligaP(2007)ExceptionalpaternalinheritanceofplastidsinArabidopsissuggeststhatlow-frequencyleakageofplastidsviapollenmaybeuniversalinplants.PlantJ52:817-823.BirchRG(1997)PLANTTRANSFORMATION=ProblemsandStrategiesforPracticalApplication.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol.48:297-326.22BrinkmannNandTebbeCC(2007)Leaf-feedinglarvaeofManducasexta(Insecta,Lepidoptera)drasticallyreducecopynumbersofaadAantibioticresistancegenesfromtransplastomictobaccobutmaintainintactaadAgenesintheirfeces.Environmentalbiosafettresearch6:121—133·DaniellH,LeeSB,PanchalTandWiebePO(2001)ExpressionofthenativecholeratoxinBsubunitgeneandassemblyasfunctionaloligomersintransgenictobaccochloroplasts.Journalofmolecuarrbiology311:1001-1009.DoranPM(2000)Foreignproteinproductioninplanttissuecultures.Currentopinioninbiotechnology11:199-204.DucosJ，LabbeG，LambotCandPetiardV(2007)Pilotscaleprocessfortheproductionofpre-germinatedsomaticembryosofselectedrobusta(Coffeacanephora)clones.InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant43:652-659.DucosJ，TerrierB，CourtoisDandPetiardV(2008)Improvementofplastic—baseddisposablebioreactorsforplantscienceneeds.PhytochemistryReviews7:607-613.FarranI,Rio-ManterolaF，IniguezM，GarateS，PrietoJandMingo-CastelAM(2008)High-densityseedlingexpressionsystemfortheproductionofbioactivehumancardiotrophin-1,apotentialtherapeuticcytokine,intransgenictobaccochloroplasts.Plantbiotechnologyjournal6:516-527.FischerR，EmansN，SchusterF，HellwigSandDrossardJ(1999)TowardsmoIecularfarminginthefuture:usingplant—eel1—suspensionculturesasbioreactors.Biotechnologyandappliedbiochemistry30(Pt2):109-112.FischerR，StogerE,SchillbergS,ChristouPandTwymanRM(2004)Plant-basedproductionofbiopharmaceuticals.Currentopinioninplantbiology7:152-158.FoxJL(2003)PuzzlingindustryresponsetoProdiGenefiasco.Naturebiotechnology21:3-4.GillRandSaxenaPK(1993)SomaticembryogenesisinNicotianatabacumL.:inductionbythidiazuronofdirectembryodifferentiationfromculturedleafdiscs.PlantCellReportsl2:154-159.GlebaY,KlimyukVandMarillonetS(2007)Viralvectorsfortheexpressionofproteinsinplants.CurrOpinBiotechnol.18:134-41.GordonSP,HeislerMG，ReddyGV,OhnoC，DasPandMeyerowitzEM(2007)PatternformationduringdenovoassemblyoftheArabidopsisshootmeristem.Development(Cambridge,England)134:3539-3548.HagemannR(2004)TheSexualInheritanceofPlantOrganelles,inMolecularBiologyandBiotechnologyofPlantOrganellespp93-113.HaliouaE(2006)Statusofbiomanufacturingintheworld.Eurobioconference2006.www.eurobio2006.com/DocBD/press/pdf/41.pdf(accessed3/3/09)HellwigS,DrossardJ,TwymanRMandFischerR(2004)Plantcellculturesfortheproductionofrecombinantproteins.Naturebiotechnology22:1415-1422.HuangCYiAyliffeMAandTimmisJN(2003)DirectmeasurementofthetransferrateofchloroplastDNAintothenucleus.Nature422:72-76.HuangJiSutliffTDiWuLiNandiSiBengeKiTerashimaMiRalstonAH,DrohanW，HuangNandRodriguezRL(2001)Expressionandpurificationoffunctionalhumanalpha-l-Antitrypsinfromculturedplantcells.Biotechnologyprogress17:126-133.KanamotoH，YamashitaA，AsaoH，OkumuraS，TakaseH，HattoriM，YokotaAandTomizawaK(2006)EfficientandstabletransformationofLactucasativaLev·Cisco(lettuce)ρlastids.Transgenicresearchl5:205-217.KangTJ，LocNH，JangMO,JangYS，KimYS，SeoJEandYangMS(2003)ExpressionoftheBsubunitofE.coliheat一labileenterotoxininthechloroplastsofplantsanditscharacterization.Transgenicresearchl2:683-691.KhanMSandMaligaP(1999)Fluorescentantibioticresistancemarkerfortrackingplastidtransformationinhigherplants.Naturebiotechnology17910-915.KwonTH,SeoJE,KimJ，LeeJH,JangYSandYangMS(2003)Expressionandsecretionoftheheterodimericproteininterleukin-12inplantcellsuspensionculture.Biotechnologyandbioengineering81:870-875.LangbeckerCL，YeGN，BroylesDL，DugganLL，XuCW,HajdukiewiczPT，ArmstrongCLandStaubJM(2004)High-frequencytransformationofundevelopedplastidsintobaccosuspensioncells.Plantphysiologyl35:39-46.LeeJH,KimNS,KwonTH,JangYSandYangMS(2002)Increasedproductionofhumangranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor(hGM-CSF)bytheadditionofstabilizingpolymerinplantsuspensioncultures.Journalofbiotechnology96:205-211.LeliveltCL,McCabeMS,NewellCA,DesnooCB,vanDunKM,Birch-MachinI，GrayJC,MillsKHandNugentJM(2005)Stableplastidtransformationinlettuce(LactucasativaL.).Plantmolecularbiology58:763-774.MaJK,DrakePMandChristouP(2003)Theproductionofrecombinantpharmaceuticalproteinsinplants.Naturereviews4:794—805·MaligaP(2004)Plastidtransformationinhigherplants.AnnuRevPlantBiol.55:289-313.MolinaA，Hervas-StubbsS，DaniellH，Mingo-CastelAMandVeramendiJ(2004)High-yieldexpressionofaviralpeptideanimalvaccineintransgenictobaccochloroplasts.Plantbiotechnologyjournal2:141—153·MonierJM,BernillonD，KayE，F(xiàn)augierA，Rybalka0，DessauxY，SimometPandVogelTM(2007)DetectionofpotentialtransgenicplantDNArecipientsamongsoilbacteria.Environmentalbiosafetyresearch6:71-83.MurashigeKandSkoogF(1962)ArevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithTobaccotissuecultures.PhysiologiaPlantarum15:473:497.NewellCA,Birch-MachinI,HibberdJMandGrayJC(2003)Expressionofgreenfluorescentproteinfrombacterialandplastidpromotersintobaccochloroplasts.Transgenicresearch12:631-634.RufS，HermannM，BergerIJ，CarrerHandBockR(2001)Stablegenetictransformationoftomatoplastidsandexpressionofaforeignproteininfruit.Naturebiotechnology19:870-875.RufS，KarcherDandBockR(2007)DeterminingthetransgenecontainmentIevelproyidedbychloroplasttransformation.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica104:6998-7002.SaxbyS(1999)Commercialproductionofmonoclonalantibodies.InProceedingsoftheProductionofMonoclonalantibodiesWorkshop(Eds.McArdleJEandLundCJ).http://altweb.jhsph.edu/topics/mabs/ardf/saxby.htm(accessed3/2/09)Scholz0，ThielA，HillenWandNiederweisM(2000)Quantitativeanalysisofgeneexpressionwithanimprovedgreenfluorescentprotein.p6.Europeanjournalofbiochemistry/FEBS267:1565-1570.ScottSEandWilkinsonMJ(1999)Lowprobabilityofchloroplastmovementfromoilseedrape(Brassicanapus)intowildBrassicarapa.Naturebiotechnology17:390-392.SheppardAE,AyliffeMA,BlatchL,DayA，DelaneySK,Khairul-FahmyN，LiY，MadesisP，PryorAJandTimmisJN(2008)TransferofplastidDNAtothenucleusiselevatedduringmalegametogenesisintobacco.Plantphysiology148:328-336.SidorovVA，KastenDiPangSZ，HajdukiewiczPT，StaubJMandNehraNS(1999)TechnicalAdvance:Stablechloroplasttransformationinpotato:useofgreenfluorescentproteinasaplastidmarker.PlantJ19:209-216.SilhavyDandMaligaP(1998)Plastidpromoterutilizationinariceembryogeniccellculture.Currentgenetics34:67-70.SvabZ，HajdukiewiczPandMaligaP(1990)Stabletransformationofplastidsinhigherplants.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica87:8526-8530.SvabZandMaligaP(2007)Exceptionaltransmissionofplastidsandmitochondriafromthetransplastomicpollenparentanditsimpactontransgenecontainment.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica104:7003-7008.TerrierB，CourtoisD，HenaultN，CuvierA，BastinM，AkninA，DubreuilJandPetiardV(2007)Twonewdisposablebioreactorsforplantcellculture:Thewaveandundertowbioreactorandtheslugbubblebioreactor.Biotechnologyandbioengineering96:914-923.TregoningJS,NixonP，KurodaH，SvabZ，ClareS，BoweF，F(xiàn)airweatherN，YtterbergJ,vanWijkKJ，DouganGandMaligaP(2003)ExpressionoftetanustoxinFragmentCintobaccochloroplasts.Nucleicacidsresearch31:1174-1179.TwymanRM,StogerE,SchillbergS,ChristouPandFischerR(2003)Molecularfarminginplants:hostsystemsandexpressiontechnology.Trendsinbiotechnology21:570-578.VermaDandDaniellH(2007)Chloroplastvectorsystemsforbiotechnologyapplications.PlantPhysiology145:1129-1143.WangT，LiY，ShiY,ReboudX,DarmencyHandGresselJ(2004)Lowfrequencytransmissionofaρlastid-encodedtraitinSetariaitalica.Theoreticalandappliedgeneticsl08:315-320.WilkeDandKatzekJ(2003)Primaryproductionofbiopharmaceuticalsinρ1ants-Anecοηomica11yattractivechoice？InEuropeanBiopharmaceuticalReview(Autumn).www.biomitteldeutschland.de/files/pdf/Biopharmaceuticalsinplants.pdf(accessed3/2/09)ZhangQ，LiuYandSodmergen(2003)ExaminationoftheCytoplasmicDNAinMaleReproductiveCellstoDeterminethePotentialforCytoplasmicInheritancein295AngiospermSpecies，inPlantCellPhysiology44:941-951.權(quán)利要求1.ー種用于從未分化植物細(xì)胞制備葉生物質(zhì)的方法，所述方法包括提供未分化細(xì)胞；將所述未分化細(xì)胞與促進(jìn)細(xì)胞分化為葉組織的試劑接觸；和使細(xì)胞在臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)體系中生長。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述植物細(xì)胞是來自單子葉植物或雙子葉植物的細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述雙子葉植物是煙草、番茄、馬鈴薯、豆、大豆、胡蘿卜、木薯或擬南芥(Arabidopsis)中任意的。4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述單子葉植物是玉米(corn)、黒麥、燕麥、小米、甘蔗、高粱、玉米(maize)、小麥或水稻中任意的。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述植物細(xì)胞來自藥用植物，其中主要的藥用物質(zhì)在葉中產(chǎn)生。6.根據(jù)權(quán)利要求5方法，其中所述植物是顛茄屬(Atropasp)、莨菪屬(HyoscyamusSP)、曼陀羅屬(Daturasp)、罌粟屬(Papaversp)、賽莨菪屬(Scopoliasp)、毛地黃屬(Digitalissp)>M(Macuna(Taxussp)>^MM(Camptothecasp)、三尖杉屬(Cephalotaxussp)或者長春花ノ禺(Catharanthussp·)、尚屬(Artemisiasp)イ列如黃マ七尚(Artemisiaannuaノ中任為、的。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述植物是能源作物。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述植物是芒屬(Miscanthussp)、麻風(fēng)樹屬(Jatrophasp)、黍?qū)?I^anicumsp)、柳樹、棕櫚樹、玉米(maize)、木薯或楊樹中任意的。9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求中方法，其中所述促進(jìn)細(xì)胞分化為葉組織的試劑是植物激素，優(yōu)選是細(xì)胞分裂素。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞分裂素是屬于腺嘌呤型或苯脲型的天然或人工的細(xì)胞分裂素中任意的。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述細(xì)胞分裂素是腺嘌呤、激動(dòng)素、玉米素、6-芐氨基嘌呤、ニ苯脲、噻苯隆(TDZ)及其各自的具有細(xì)胞分裂素活性的衍生物中任意的。12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞分裂素是噻苯隆(TDZ)。13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中任ー項(xiàng)的方法，其中將所述試劑與另ー種植物激素，例如生長素聯(lián)合使用。14.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述試劑以0.01-100μΜ，優(yōu)選以0.1-10μM的濃度加入所述培養(yǎng)基中。15.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述試劑在臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)開始時(shí)或在臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)過程中加入。16.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述浸漬時(shí)間為每2-Μ小時(shí)浸漬1-30分鐘，優(yōu)選為每2-6小時(shí)浸漬1-10分鐘。17.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)物中液體的體積為1-10，000升，優(yōu)選為1-5，000升，更優(yōu)選為1-1，000升，最優(yōu)選為1-500升。18.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述包含臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)體系的容器為1-10，000升，優(yōu)選為1-5，000升，更優(yōu)選為1-1，000升，最優(yōu)選為1-500升。19.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述植物細(xì)胞不經(jīng)基因工程改造。20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任ー項(xiàng)的方法，其中所述植物細(xì)胞為經(jīng)基因工程改造的，例如用于表達(dá)多肽。21.ー種在體外植物細(xì)胞中制備多肽的方法，所述方法包括提供含有葉綠體的未分化植物細(xì)胞，所述葉綠體攜帯編碼多肽的轉(zhuǎn)基因核酸分子，其中所述植物細(xì)胞顯示同型異源性；和根據(jù)權(quán)利要求1的方法來増殖細(xì)胞，從而制備含有多肽的葉生物質(zhì)。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述提供未分化細(xì)胞的步驟包括將轉(zhuǎn)基因核酸分子導(dǎo)入植物細(xì)胞的葉綠體中；誘導(dǎo)含有轉(zhuǎn)基因核酸分子的植物細(xì)胞從而形成未分化細(xì)胞的愈傷組織；和將所述愈傷組織在有效實(shí)現(xiàn)同型異源性的條件下繁殖。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其中所述同型異源性使用抗生素選擇來實(shí)現(xiàn)，例如使用壯觀霉素、鏈霉素或卡那霉素選擇。24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中任ー項(xiàng)的方法，其中控制所述可利用光的量和/或可利用蔗糖的量，以優(yōu)化多肽的制備。25.根據(jù)權(quán)利要求21至M中任ー項(xiàng)的方法，所述方法還包括從葉生物質(zhì)中獲得多肽。26.根據(jù)權(quán)利要求21至25中任ー項(xiàng)的方法，其中所述多肽是治療性多肽、酶、生長因子、免疫球蛋白、激素、結(jié)構(gòu)蛋白、植物應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白、生物藥物或疫苗抗原中的任意一種。27.一種通過使用根據(jù)權(quán)利要求21至沈中任ー項(xiàng)的方法獲得的多肽或通過處理權(quán)利要求1至20中任ー項(xiàng)的方法獲得的葉生物質(zhì)后獲得的多肽。28.通過權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法獲得的葉生物質(zhì)。29.ー種用于獲得存在于葉生物質(zhì)中的成分的方法，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求1至20中任ー項(xiàng)的方法制備葉生物質(zhì)，和從所述葉生物質(zhì)中獲得所述成分。30.根據(jù)權(quán)利要求四的方法，其中所述成分通過葉生物質(zhì)的分泌或通過葉從葉生物質(zhì)中提取獲得，所述提取例如通過壓碎葉生物質(zhì)以釋放所述成分。31.根據(jù)權(quán)利要求四或30的方法，其中所述成分是藥用物質(zhì)、重組表達(dá)多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、油、揮發(fā)性芳香族化合物、抗氧化劑、色素、風(fēng)味劑或風(fēng)味劑前體；并且其中所述成分可以是內(nèi)源性的或外源性的。32.根據(jù)權(quán)利要求四至31中任ー項(xiàng)的方法，其中將所述成分加工成進(jìn)ー步產(chǎn)品，例如生物燃料、食品或藥用產(chǎn)品。33.一種用于在植物細(xì)胞中體外制備多肽的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括促進(jìn)未分化植物細(xì)胞分化為葉組織的試劑；和編碼多肽的核酸分子，所述核酸分子適用于導(dǎo)入到葉綠體中并在葉綠體中表達(dá)。34.一種捕獲ニ氧化碳的方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求1至20所述的方法。35.一種純化樣品的方法，所述方法包括將準(zhǔn)備純化的樣品暴露于得自權(quán)利要求1至20的葉生物質(zhì)中。36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述純化過程是去除ー種或多種毒素。37.一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括配制通過權(quán)利要求四至31所述的方法獲得的成分和藥學(xué)上可接受的載體稀釋劑、賦形劑或載體。38.ー種醫(yī)藥產(chǎn)品，其包含通過權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)所述的方法獲得的成分和藥學(xué)上可接受的載體稀釋劑、賦形劑或載體。39.一種制備生物燃料的方法，所述方法包括通過權(quán)利要求四至31所述方法獲得成分的發(fā)酵或酯基轉(zhuǎn)移。40.ー種通過權(quán)利要求39所述的方法獲得的生物燃料。全文摘要一種用于從未分化植物細(xì)胞制備葉生物質(zhì)的方法，所述方法包括提供未分化細(xì)胞；將它們與促進(jìn)細(xì)胞分化為葉組織的試劑接觸；和使細(xì)胞在臨時(shí)液體浸漬培養(yǎng)體系中生長。本發(fā)明的這種方法可以用于制備多肽和天然藥用物質(zhì)，并且可以用于捕獲二氧化碳。一種在體外植物細(xì)胞中制備多肽的方法，其包括提供含有葉綠體的未分化植物細(xì)胞，該葉綠體攜帶編碼多肽的轉(zhuǎn)基因核酸分子，其中所述植物細(xì)胞顯示同型異源性；和根據(jù)以上的方法使細(xì)胞增殖，從而制備含有多肽的葉生物質(zhì)。文檔編號C12N15/82GK102595876SQ201080051277公開日2012年7月18日申請日期2010年8月12日優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日發(fā)明者F·米舒克斯,J·G·麥卡錫,P·尼克松申請人:帝國創(chuàng)新有限公司