方法
【專利說明】方法
[0001] 本公開文本涉及精油的脫色。
[0002]一些精油，特別是Chamomilla屬、母菊屬（Matricaria)、春黃菊屬（Anthemis)(甘 菊（chamomile))、蒿屬（Artemisia)(亞洲蒿、艾蒿、苦艾、蛔蒿等）和蓍屬（Achillea)(蓍 草）的那些是藍(lán)色的，范圍從藍(lán)-綠色至極深藍(lán)色。這是其中存在不同的甘菊環(huán)類、特別是 甘菊環(huán)、母菊蘭稀、二氫母菊蘭稀和愈創(chuàng)藍(lán)油徑（guiazulene)的結(jié)果（在本說明書中，術(shù)語 "甘菊環(huán)"用于涵蓋精油這種特征性顏色的所有甘菊環(huán)類）。這種顏色是不期望的，因?yàn)樗?限制了這些另外期望的油在香料中的有用性，但迄今為止難以將其除去或?qū)⑵涑ナ遣磺?實(shí)際的。
[0003] 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這樣的油基本上可以通過應(yīng)用簡(jiǎn)單技術(shù)被完全脫色。因此，公開了 從包含甘菊環(huán)的精油中除去藍(lán)色的方法，其包括將所述油添加到在pH3-7. 5緩沖的水中 且隨后用漆酶-介體系統(tǒng)處理它，所述漆酶選自衍生于栓菌屬（Trametessp.)和嗜熱毀絲 菌（Myceliophthorathermophila)的那些漆酶。
[0004] 許多漆酶是已知的且它們已經(jīng)用于各種目的，例如合成香料和香精領(lǐng)域中的期望 的分子。然而，在先尚不了解，衍生于栓菌屬和嗜熱毀絲菌的那些漆酶可以用于給精油脫 色。
[0005] 用于該方法的商購(gòu)漆酶的實(shí)例包括、但不限于漆酶C(ASA SpezialenzymeGmbH) 和漆酶NS 42035 (Novozymes A/S)〇
[0006] 介體的存在對(duì)于該方法是必需的。所謂"介體"是指低分子量有機(jī)化合物，其為漆 酶的底物并且介導(dǎo)漆酶與甘菊環(huán)的反應(yīng)。所謂"介導(dǎo)反應(yīng)"是指：(a)它被所述酶氧化；(b) 它進(jìn)而氧化甘菊環(huán)；和（c)它被所述酶再活化以便進(jìn)一步反應(yīng)。介體在漆酶系統(tǒng)中的應(yīng)用 是本領(lǐng)域眾所周知的且許多這樣的介體是已知的。例如，實(shí)例描述在Camarero等人（Appl EnvMicrobiol71，1775-1784,2005)、Fabbrini等人（JMolCatB:Enz16,231-240， 2002)、GonzalezArzola等人（ElectrochemicaActa54, 2621-2629, 2009)中。
[0007] -些非限制性具體實(shí)例包括芥子酸、丁香酸甲酯、熊果苷、1-羥基苯并三唑、 TEMPO、吩噻嗪、酚紅、4-羥基苯甲酸、對(duì)羥苯基乙醇、乙基香草醛和2, 4, 6-三甲基苯酚。此 外，存在商購(gòu)漆酶-介體系統(tǒng)，一種這樣的系統(tǒng)是Denilite?IIS，在這種情況中的介體是 丁香酸甲酯。
[0008] 盡管嗜熱毀絲菌-衍生的漆酶的應(yīng)用通常需要加入的介體以便有效地進(jìn)行脫色， 但是已經(jīng)注意到，栓菌屬的一些漆酶可以在沒有添加的介體的存在下給一些油脫色。這樣 的油的實(shí)例包括澳大利亞藍(lán)柏油（AustralianblueCypressoil)(澳洲藍(lán)柏（Callitris intratropica))、苦艾油（Artemisiaabsinthum)、藍(lán)洋甘菊油（Matricariachamomilla) 和千葉油（Artemisiaarborescens)。不以任何方式限定本公開文本，認(rèn)為在這些油中存 在能夠作為介體起作用的化合物，例如麝香草酷（在蒿屬（Artemisia)油中）。然而，對(duì)于 本公開文本的目的，栓菌屬-衍生的漆酶單獨(dú)應(yīng)用被視為屬于上文所定義的"漆酶-介體系 統(tǒng)"的范圍內(nèi)。
[0009] 在任何情況下，觀察到添加介體顯著地增強(qiáng)栓菌屬-衍生的漆酶的脫色性能。 在一些情況中，例如，開普敦甘菊油（Capecamomileoil)(岬角甘菊（Eriocephalus punctulatus))和羅馬甘菊油（Romancamomileoil)(白花春黃菊（Anthemisnobilis))， 需要介體用于可接受的脫色。適合的介體/酶/油組合可以通過常規(guī)的非創(chuàng)造性的實(shí)驗(yàn)找 到。具體的漆酶-介體系統(tǒng)是栓菌屬-1-羥基苯并三唑。
[0010] 商購(gòu)漆酶制品一般作為具有特定活性的干粉提供。眾所周知這種活性隨時(shí)間降 低，有時(shí)在使用前相當(dāng)明顯（通常10倍以上），必需確定有多少活性漆酶保留在漆酶制品 中，以便可以使用適合的量。這對(duì)于任何使用酶操作的人而言是標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)踐。
[0011] 用于特定脫色所需的酶的量取決于漆酶的比活性。所謂"漆酶的比活性"是指活 性漆酶單位/mg漆酶制品的數(shù)量。根據(jù)眾所周知和通常使用的生化方法（從隨機(jī)選擇的量 的漆酶制品開始的試驗(yàn)和誤差的迭代循環(huán)）對(duì)漆酶制品中的比活性進(jìn)行測(cè)定（以漆酶單位 計(jì)）。
[0012] 典型實(shí)例描述在如下段落中。在這種情況下，丁香醛連氮（syringaldazine)作為 底物，且本說明書中的所有活性均涉及該標(biāo)準(zhǔn)。
[0013] 向在40mMMES緩沖液pH5. 3中的1ml反應(yīng)體系中加入等分的精確制備的漆酶制 品水溶液。通過從用乙醇制備的儲(chǔ)備溶液添加丁香醛連氮（SigmaS7896)至33yM終濃度 開始反應(yīng)。在22°C在525nm在CarylUV-VIS分光光度計(jì)（Varian)中記錄吸光度增加（粉 色形成）10min。對(duì)由MES緩沖液組成的空白進(jìn)行測(cè)定。用單位測(cè)定比活性，其中將1個(gè)單 位定義為在上述條件下每分鐘催化1納摩爾丁香醛連氮氧化的漆酶制品的量。
[0014] 所需的介體比例取決于油和介體的性質(zhì)，并且存在廣泛的可能性。典型地，介體濃 度為0. 05-100mM，不過，在該范圍之外的濃度實(shí)例可以提供可接受的結(jié)果。
[0015] 該方法典型地在持續(xù)攪拌下通過向緩沖至pH3-7. 5(特別是4. 5-5. 5)的水中 添加油來進(jìn)行。可以加入盡可能多的油（典型地高達(dá)50%重量；在一些情況中，更多是可 能的）。然后以液體或粉末形式添加漆酶-介體系統(tǒng)。該反應(yīng)在20°C-80°C、特別是在約 35°C-45°C下進(jìn)行。根據(jù)所使用的油和漆酶-介體系統(tǒng)，脫色通常在3. 5至7h內(nèi)完成，不 過，一些油可能需要高達(dá)24h。在一些情況下，添加更大量的漆酶-介體系統(tǒng)得到了更為快 速的脫色。然而，這種情況并非始終發(fā)生，但常規(guī)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛉菀椎貐^(qū)分什么地方其起到了作 用和未起到作用。
[0016] 可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如潷析和溶劑萃取回收脫色的油。
[0017] 結(jié)果是得到用于香料的無色油。因此，公開了包含脫色的甘菊環(huán)的精油，其可通過 上文所述的方法制備。
[0018] 本公開文本進(jìn)一步參照如下非限制性實(shí)施例描述。
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 將反應(yīng)體系（500微升終體積）設(shè)定如下：將補(bǔ)充0. 25%Tween? 80表面活性劑且 包含2. 2mg栓菌屬漆酶C(相當(dāng)于171個(gè)單位，如上所述的