專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人胰島素原融合蛋白及人胰島素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人胰島素原融合蛋白及人胰島素的制備方法。
背景技術(shù)：
胰島素是一種非糖基化的由二硫鍵連接的異源多肽二聚體，共由51個(gè)氨基酸組成，分別是21個(gè)氨基酸的A肽和30個(gè)氨基酸的B肽，由A7-B7和A20-B19之間的兩對(duì)二硫鍵連接，另外在A肽還有一個(gè)A6-A11的鏈內(nèi)二硫鍵。(圖1)胰島素是由胰腺β細(xì)胞以胰島素原的形式合成，胰島素原中B肽的C端通過(guò)另外一條肽鏈C肽與A肽N連接為一條單鏈。C肽共含有35個(gè)氨基酸，其N(xiāo)端為Arg-Arg(RR) 而C端為L(zhǎng)ys-Arg(KR)。成熟的胰島素是由β細(xì)胞分泌的酶裂解而成，有三種酶參與這一過(guò)程PCl/3和PC2分別裂解B-C連接處和C-A連接處，將C肽首先裂解除去；而羧肽酶H 則負(fù)責(zé)裂解在PC1/3裂解時(shí)產(chǎn)生的B肽C端的多余Arg以形成成熟的胰島素。治療用胰島素的生產(chǎn)方法分為以下幾種1、從動(dòng)物胰臟提取，如豬胰島素，目前中國(guó)醫(yī)藥市場(chǎng)上動(dòng)物源的胰島素還占有很大的份額，為國(guó)家基本藥物目錄所列的品種；2、化學(xué)合成；3、半合成即將豬胰島素通過(guò)化學(xué)作用將其A肽末端的Ala轉(zhuǎn)化為Asn，形成人胰島素；4、重組蛋白發(fā)酵表達(dá)。人胰島素為FDA所批準(zhǔn)的第一種重組蛋白藥物，近年來(lái)，重組表達(dá)制備人胰島素已被成功應(yīng)用到各種不同的宿主中，包括細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞甚至植物。但是，其基本原理不外乎以下三種1、雙鏈法重組人胰島素最早由美國(guó)希望之城的科學(xué)家們于1978成功制備，而在1982年作為第一個(gè)基因重組蛋白藥物被FDA授予禮來(lái)公司。最初的方法為將A肽和B肽基因分別與 β-半乳糖甘酶(β-gal)基因拼接，融合基因轉(zhuǎn)化不同的大腸桿菌獨(dú)立發(fā)酵，所表達(dá)的兩個(gè)融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成的包涵體通過(guò)復(fù)性、氰化溴裂解、生成的A、B兩肽體外重組折疊以獲得成熟的人胰島素(Chance et al. , Diabetes Care，1981，4)。然而，β -半乳糖甘酶分子量較大( 1000氨基酸)，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物中的胰島素肽比例偏低，后期β-半乳糖甘酶被色氨酸操縱子的一個(gè)約190氨基酸的多肽(Trp-LE)取代，從而使得成熟胰島素產(chǎn)率大為提升。實(shí)際操作中，由于需要兩次不同的發(fā)酵過(guò)程，并且Trp-LE-Met-A融合肽和 Trp-LE-Met-B融合肽氰化溴裂解后的A、B兩肽需要進(jìn)行磺化保護(hù)，顯然提高了生產(chǎn)成本。 因此，現(xiàn)在這種方法已不再用于生產(chǎn)。2、胰島素原法(胞內(nèi)包涵體)另外一種方法是將胰島素原作為一條多肽表達(dá)，這一方法消除了雙鏈法里必須的兩次發(fā)酵。其基本實(shí)現(xiàn)方法為將一個(gè)引導(dǎo)肽(如Trp-LE-Met)融合在胰島素原N端進(jìn)行融合蛋白發(fā)酵表達(dá)。(Kroeff et al. ,J. Chromatogr. 1989,46)發(fā)酵產(chǎn)生的包涵體溶解后，首先由氰化溴切除引導(dǎo)肽，之后的胰島素原在磺化保護(hù)下復(fù)性折疊，正確折疊的產(chǎn)物可使用胰蛋白酶和羧肽酶B裂解并經(jīng)過(guò)多步層析獲得胰島素終產(chǎn)物。(Kemmler et al. , J. Biol. Chem. ，1971，246)Trp-LE-Met作為一個(gè)融合標(biāo)簽，其分子大小( 190氨基酸)與胰島素原(86氨基酸)相比仍舊較大，最終的胰島素氨基酸占比不到發(fā)酵產(chǎn)品的20%。與此同時(shí)，使用氰化溴的方式產(chǎn)生的有毒物質(zhì)的處理以及對(duì)氰化溴的管制更給上述方法增加了成本。因此， 更短的且具有蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的引導(dǎo)肽被相繼提出。比如美國(guó)專(zhuān)利5126249的Met-Tyr ； 5378613 的 Met-Arg 禾口 Chen et al.，(Appl. Biochem. Biotechnol. 1999, 55)描述的 Met-Lys 以及美國(guó)專(zhuān)利 5358857，韓國(guó)專(zhuān)利(Registration#1002(^9580000)，Tikhonov et al. (Prot. Exp. Purif.，2002，26)等描述了許多新型引導(dǎo)肽。含有這些引導(dǎo)肽的胰島素原表達(dá)載體多具有高表達(dá)量，但在后期酶裂解處理中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，使得下游的純化工作變得困難。中國(guó)專(zhuān)利98813941. 3描述了以人生長(zhǎng)激素作為引導(dǎo)肽，并經(jīng)由Arg或Lys與胰島素原相連形成的表達(dá)載體，但其胰島素氨基酸數(shù)占比不高，且酶裂解效率較低，復(fù)性過(guò)程需要消耗大量的脲，生產(chǎn)成本增高。3、胰島素原法(分泌可溶)雙鏈法和包涵體胰島素原法的一個(gè)共同點(diǎn)是融合蛋白發(fā)酵產(chǎn)物以包涵體形式存在。包涵體是一種非正常折疊的聚集體，其產(chǎn)生是由于大腸桿菌核糖體翻譯速度較快而導(dǎo)致外源蛋白的表達(dá)速度過(guò)高不能及時(shí)的折疊。包涵體一般不可溶，需要使用高濃度變性劑復(fù)溶后進(jìn)行復(fù)性工作，純化工藝較復(fù)雜。對(duì)于胰島素，由于其具有3對(duì)二硫鍵，在相對(duì)還原環(huán)境的大腸桿菌胞內(nèi)無(wú)法形成正確配對(duì)的二硫鍵，更加劇了包涵體的形成。因此，胰島素在大腸桿菌的可溶性表達(dá)一般均以分泌到細(xì)胞周質(zhì)進(jìn)行。同時(shí)由于獨(dú)立表達(dá)的胰島素原在細(xì)胞周質(zhì)的半衰期極短(Chan et al.，PNAS，1981，78)，因此一般可溶表達(dá)都是以融合蛋白形式進(jìn)行。(Malik et al. , Prot. Exp. Puri. ,2007,55 ；Winteret al., J.Biotech. ,2000,84 ；Kang and Yoon, J. Biotech, 1994, 36) 0然而，大腸桿菌周質(zhì)空間較小，所表達(dá)出的融合胰島素量與胞內(nèi)表達(dá)的包涵體相差甚遠(yuǎn)，限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。實(shí)際生產(chǎn)中則是以啤酒酵母(Saccharomyces cereviseae)為宿主細(xì)胞(Thim et al.，PNAS，1986,83.)，將正確復(fù)性胰島素原分泌到培養(yǎng)基中。分泌所得含有正確配對(duì)的二硫鍵的胰島素原經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)肽和胰蛋白酶裂解后，經(jīng)層析后獲得終產(chǎn)物。但酵母表達(dá)系統(tǒng)下游后加工雖然比細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單，但其缺點(diǎn)是生長(zhǎng)慢，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，產(chǎn)量較低、成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題現(xiàn)有技術(shù)中存在的Arg-AO胰島素副產(chǎn)物以及復(fù)性等問(wèn)題。為此，本發(fā)明公開(kāi)了一種人胰島素原融合蛋白，從N端至C端由X-B-C-A四段肽鏈組成，其中所述X肽鏈為無(wú)或引導(dǎo)肽，所述B-C-A肽鏈為其氨基酸序列如SEQ ID N0. 3所示或?yàn)橹辽倥cSEQ ID N0. 3所示的氨基酸序列90%同源性且其成熟體具有降糖活性的突變體，其特征在于所述C肽C端的Lys64殘基由非堿性氨基酸取代。所述非堿性氨基酸為 Ser、Gly 或 Val。
在該人胰島素原融合蛋白的一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述C肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4 所示。在該人胰島素原融合蛋白的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述C肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示。在該人胰島素原融合蛋白的又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述C肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6 所示。在該人胰島素原融合蛋白的再一優(yōu)選的的實(shí)施方案中，所述引導(dǎo)肽從N端到C端包含第一肽段由甲硫氨酸緊隨6-10個(gè)組氨酸；第二肽段為1-3個(gè)甘氨酸-絲氨酸重復(fù)緊隨一個(gè)賴(lài)氨酸或者精氨酸。在該人胰島素原融合蛋白的又再一優(yōu)選的的實(shí)施方案中，所述第一肽段氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。在該人胰島素原融合蛋白的另再一優(yōu)選的的實(shí)施方案中，所述第二肽段氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。在該人胰島素原融合蛋白的再再一最優(yōu)選的的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 14所示。在該人胰島素原融合蛋白的再再一最優(yōu)選的的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 15所示。在該人胰島素原融合蛋白的再再一最為優(yōu)選的的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 16所示。另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了一種編碼上述人胰島素原融合蛋白的核酸序列。在該核酸序列的一最優(yōu)選的的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 14所示。在該核酸序列的另一最優(yōu)選的的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 15所示。在該核酸序列的另一最為優(yōu)選的的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 16所示。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種含有編碼上述人胰島素原融合蛋白核酸序列的重組載體。在該重組載體的一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0. 14 所示。在該重組載體的另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 15所示。在該重組載體的另一最為優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 16所示。在該重組載體的另一最為優(yōu)選的的實(shí)施方案中，所述重組載體為pCRT7NT質(zhì)粒。另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了一種含有編碼上述人胰島素原融合蛋白核酸序列的重組載體的轉(zhuǎn)化體。在該轉(zhuǎn)化體的一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0. 14 所示。
在該轉(zhuǎn)化體的另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 14 所示。在該轉(zhuǎn)化體的又一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 15 所示。在該轉(zhuǎn)化體的再一最為優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人胰島素原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種人胰島素的制備方法，包括下列步驟a)構(gòu)建含有編碼上述人胰島素原融合蛋白核酸序列的重組載體；b)獲得轉(zhuǎn)化體；c)發(fā)酵；d)收獲含人胰島素原融合蛋白的發(fā)酵產(chǎn)物部分；e)復(fù)性；f)純化蛋白；g)胰蛋白酶裂解通過(guò)5KD超濾，ρΗΙΟ-11，保持純化蛋白濃度在8_12mg/ml，以 1 1000加入胰蛋白酶，37°C裂解3-4小時(shí)，加入磷酸至pH-3. 5終止反應(yīng)，除去胰蛋白酶；h)羧肽酶B裂解通過(guò)5KD超濾，pH8. 0，加入1 1000的羧肽酶B裂解2小時(shí)， 加入磷酸至PH 3. 5終止反應(yīng)，除去羧肽酶B ；i)蛋白重結(jié)晶，即獲得人胰島素。在上述制備方法的一些實(shí)施例中，所述步驟e中復(fù)性為變性的人胰島素原融合蛋白與含硫醇、氧化型硫醇二聚體和變性劑溶液接觸。所述人胰島素原融合蛋白濃度在0. 3-2mg/ml ；所述變性劑選自脲或/和鹽酸胍， 其中優(yōu)選為脲，脲濃度為0. 5-1. 5M。所述步驟e中復(fù)性的pH為9-11，其中優(yōu)選pH值范圍為10.5-11.0。硫醇及氧化型硫醇二聚體的比例為1 1-1 10，硫醇的選擇為半胱氨酸，氧化型硫醇二聚體為胱氨酸，其中半胱氨酸與胱氨酸的比例為1 5-1 7。本發(fā)明所述人胰島素原融合蛋白避免了 Arg-AO胰島素副產(chǎn)物的產(chǎn)生，其中C肽能夠促進(jìn)胰島素原的復(fù)性。所述方法所需步驟較少，產(chǎn)生副產(chǎn)物較少，獲得較高產(chǎn)量的胰島
ο


圖1、二硫鍵配對(duì)正確的人胰島素結(jié)構(gòu)。圖2、His-K64S胰島素原表達(dá)載體(V3phi)示意圖譜。圖3、突變型以及野生型賴(lài)輔胰島素原表達(dá)模式泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為未誘導(dǎo)對(duì)照，泳道3為K64S突變型，泳道4為K64G突變型，泳道5為K64V突變型， 泳道6為野生型，泳道7為胰島素原復(fù)性產(chǎn)物。圖4、His-K64S胰島素原復(fù)性后酶切產(chǎn)物的HPLC分析，峰6. 7,8. 2,9. 3,9. 8分鐘對(duì)應(yīng)的為胰蛋白酶單酶切產(chǎn)物各峰，峰10. 0分鐘對(duì)應(yīng)為純化后胰島素。使用流動(dòng)相為A相 0. 1% TFA，10%乙腈；B相0. 1% TFA，100%乙腈。梯度時(shí)間10分鐘。圖5、生物活性研究，曲線(xiàn)示為分別注射生理鹽水(■)、科新賴(lài)脯胰島素(·)和禮來(lái)優(yōu)泌樂(lè)(▲)后兔血糖濃度隨時(shí)間變化。
具體實(shí)施例方式融合蛋白的表達(dá)在本文，本發(fā)明所公開(kāi)的融合蛋白可以通過(guò)多種方式獲取，比如化學(xué)合成或者在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。編碼本發(fā)明公開(kāi)的融合蛋白的基因可以通過(guò)不同方法克隆到適合不同細(xì)胞的載體中，包括但不局限于pUC、pBlueScript、pBR322、pMD等?；蚩寺】梢酝ㄟ^(guò)使用常規(guī)克隆方法實(shí)現(xiàn)，比如利用限制性?xún)?nèi)切酶剪切連接到具有相同酶切位點(diǎn)的載體中，或者通過(guò)PCR產(chǎn)物插入到線(xiàn)性化載體中，以及使用T-A克隆方法插入到T載體中。本發(fā)明的所述融合蛋白是人胰島素原及其突變體；其功能性活性片段或其類(lèi)似物；具有高度同源性的同系物以及編碼包含SEQ ID NO. 3描述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的載體例如DNA載體(質(zhì)粒或病毒)。功能性活性片段或類(lèi)似物可通過(guò)添加、插入、修飾、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多個(gè)氨基酸殘基而形成。術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”也包括嵌合蛋白質(zhì)、融合蛋白、抗獨(dú)特型抗體、上述化合物的前體和其它功能等效物或模擬物。也包括模擬IL-IRa結(jié)合蛋白活性的合成體。術(shù)語(yǔ)“突變體”是指氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所述人胰島素原的突變體。相比于天然的人胰島素原，該突變體與它們野生型相比，具有增強(qiáng)的活性和/或改變了的立體專(zhuān)一性。天然蛋白的氨基酸序列突變體可通過(guò)向本發(fā)明的核苷酸中引入適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓?或通過(guò)體外合成所需多肽來(lái)制備。這些突變體包括，例如缺失、插入或替換該氨基酸序列中的殘基?？梢酝ㄟ^(guò)缺失、插入和替換的組合以得到最終的構(gòu)建體，提供最終的蛋白產(chǎn)品。編碼本發(fā)明公布的新型C肽的核酸可由定點(diǎn)突變生成，定點(diǎn)突變的方法有多種， 包括mega primer法，inverse PCR法等，可由商業(yè)購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)試劑盒(如Mratagene Quik Change)或者使用高保真DNA聚合酶進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“成熟體”是指人胰島素原及其突變體經(jīng)酶切或修飾或構(gòu)象變化后的具有生物活性的蛋白，本發(fā)明尤指人胰島素及其突變體。蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和mmsh，1970)分析(GCG程序)確定，其 rPgap creation penalty = 5, gap extension penalty = 0. 30 ^^Ι/τWii^1JixiS 至少為15個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為15個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為50個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為50個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為100個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為100個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為250個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為250個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。甚至更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為500個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為500個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。本發(fā)明涉及的方面還包括人胰島素原類(lèi)似物，在它們合成期間或合成后進(jìn)行了不同的修飾，例如，通過(guò)生物素化、芐基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、由已知保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生作用、蛋白水解的切割作用、連接到抗體分子或其它細(xì)胞配體上等。這些修飾可以用來(lái)增加本發(fā)明人胰島素原的穩(wěn)定性和/或生物活性。本發(fā)明包括編碼本發(fā)明的人胰島素原的DNA以及含有這些DNA的載體、轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明中，使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”(transformant)，即帶有異源DNA分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過(guò)合成和重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明所述蛋白的方法。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法可以分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、轉(zhuǎn)化體和生物體。用于本發(fā)明的載體可以是如噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?？捎糜诳寺『?或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的載體是能在需復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的載體。一般說(shuō)來(lái)，多核苷酸和/或載體可用于任何真核或原核細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞)、大鼠、倉(cāng)鼠(如CH0、NS0和幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)或小鼠細(xì)胞(如L細(xì)胞))、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)。有關(guān)適用于多種類(lèi)型宿主細(xì)胞的適當(dāng)載體的例子可參見(jiàn)例如 F. Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992)禾口 Sambrook et al. (1989)?？梢允褂煤羞@些多核苷酸的宿主細(xì)胞來(lái)大量表達(dá)可用于例如藥物、診斷試劑、疫苗和治療劑的蛋白質(zhì)。已開(kāi)發(fā)出多種方法用于經(jīng)由互補(bǔ)的粘性末端使多核苷酸與載體可操作相連。例如，可在欲插入載體DNA內(nèi)的DNA區(qū)段添加互補(bǔ)的同聚體序列片段。然后通過(guò)互補(bǔ)同聚體尾之間的氫鍵連接載體和DNA區(qū)段以形成重組DNA分子。所需表達(dá)的重組DNA的插入可通過(guò)若干常規(guī)方法鑒定1)通過(guò)PCR鑒定重組菌株待插入?yún)^(qū)域的大小與無(wú)插入片段的空載體相應(yīng)區(qū)域大小比較；幻通過(guò)載體大小的變化；幻插入片段的表達(dá)。含有一或多種限制性位點(diǎn)的合成接頭提供了另一種連接DNA區(qū)段與載體的方法。 用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過(guò)內(nèi)切核酸酶限制性消化產(chǎn)生的 DNA區(qū)段，所述的兩種聚合酶用其3'，5’-核酸外切活性除去突出的Y-單鏈末端，并用其聚合活性補(bǔ)平3’-凹端。因此，這些活性的聯(lián)合產(chǎn)生了平端DNA區(qū)段。然后在能催化平端 DNA分子連接的酶，如噬菌體T4DNA連接酶的存在下將平端區(qū)段與摩爾過(guò)量的接頭分子一起保溫。因此，反應(yīng)產(chǎn)物是末端攜有聚合接頭序列的DNA區(qū)段。然后用適當(dāng)?shù)南拗菩悦噶呀膺@些DNA區(qū)段，并連接至已用酶裂解的表達(dá)載體中，所述酶能產(chǎn)生與所述DNA區(qū)段相容的末端。從多個(gè)商家可以買(mǎi)到含有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)的合成接頭。上述融合蛋白基因的表達(dá)需要亞克隆到具有轉(zhuǎn)錄翻譯及相應(yīng)操縱子元件的表達(dá)載體中，以便重組DNA在相應(yīng)宿主細(xì)胞中進(jìn)行可調(diào)控的表達(dá)。舉例來(lái)說(shuō)，可用來(lái)實(shí)現(xiàn)所公布融合蛋白高表達(dá)的系統(tǒng)包括，但不局限于基于T7聚合酶及其啟動(dòng)子的pET系統(tǒng)(Studier and Moffatt, J. Mol. Biol.，1986，199.)；基于 trp 啟動(dòng)子的 trp 系統(tǒng)(Yanofsky, Nature, 1981,298.)；基于 Iac 啟動(dòng)子的 Iac 系統(tǒng)(Villakamaroff, et al.，PNAS, 1978)；混合 trp % lac ^i)]^·^] tac>tic>trc (Brosius et al. J. Biol. Chem, 1985,6.)araBAD 啟動(dòng)子的pBAD系統(tǒng)(Guzman et al. J. Bateriol，1995，177)；基于PRPL啟動(dòng)子的熱誘導(dǎo)系統(tǒng)(Christopher et al.，Gene, 1990,87.)；基于 T5 啟動(dòng)子的 pQE 系統(tǒng)(Bujard et al.， Methods Enzymol.，1987，155)；以及基于 Cold Shock Protein 啟動(dòng)子的 pCold 系統(tǒng)等 (Qing et al.，Nat. Biotech，2004，22.)。如上所述，表達(dá)系統(tǒng)可包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記。所述標(biāo)記包括對(duì)真核細(xì)胞培養(yǎng)物而言的二氫葉酸還原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大腸桿菌和其它細(xì)菌培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。適當(dāng)宿主的代表性例子包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)；昆蟲(chóng)細(xì)胞，如果蠅S2和夜蛾SF9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CH0，C0S，NS0，293 和Bowes黑素瘤細(xì)胞；和植物細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、 轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法，即可將本發(fā)明的核酸和核酸重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。所述方法描述于多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中，如Davis et al.，Basic Methods In Molecular Biology (1986)。編碼本發(fā)明的所述蛋白的多核苷酸可以與含有選擇標(biāo)記的載體連接以在宿主中增殖。一般說(shuō)來(lái)，可在沉淀物，如磷酸鈣沉淀物或其與帶電脂質(zhì)的復(fù)合物中導(dǎo)入質(zhì)粒載體。 如果載體是病毒，可使用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系在體外對(duì)其進(jìn)行包裝，再轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞。通過(guò)眾所周知的技術(shù)可以鑒定出被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明的DNA重組載體的細(xì)胞。例如，可培養(yǎng)導(dǎo)入表達(dá)重組載體所得的細(xì)胞以產(chǎn)生所需多肽。收集并裂解細(xì)胞， 使用如 Southern(1975) J. Mol. Biol. 95，503 或 Berent et al (1985) Biotech. 3，208 所述的方法，檢測(cè)其DNA內(nèi)容物中DNA的存在?；蛘?，使用抗體檢測(cè)上清液中蛋白質(zhì)的存在。而一旦表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功后，須根據(jù)所使用的表達(dá)載體選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，目前多數(shù)的載體均提供調(diào)控元件，在一定的誘導(dǎo)劑的存在下啟動(dòng)相應(yīng)的蛋白表達(dá)。通過(guò)眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的所述蛋白較為有禾U，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、 疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、疏水電荷作用層析和凝集素層析。在一些實(shí)施方案中，可使用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行純化。在一些實(shí)施方案中，可使用上述的一種或多種層析方法純化本發(fā)明的所述蛋白。 在其它實(shí)施方案中，可使用下述的一種或多種層析柱純化本發(fā)明的所述融合蛋白，所述層析柱有Q sepharose FF 柱、SP sepharose FF 柱、Qsepharose High Performance 柱、Blue sepharose FF 柱、Blue 柱、Phenyl SepharoseFF 柱、DEAE Sepharose FF> Ni-Chelating Sepharose FF 柱或 Methyl 柱等。為了有效地分離純化或分泌目標(biāo)蛋白，常常還可利用便于分離純化的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)、 六聚組氨酸肽(His. Tag)、蛋白質(zhì)A (protein Α)和纖維素結(jié)合位點(diǎn)(cellulose binding domain)等。通過(guò)特殊性蛋白或多肽與目標(biāo)蛋白構(gòu)成融合蛋白的形式，表達(dá)后利用所述的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽的特殊性質(zhì)可對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離和純化。如His. Tag與Ni-Chelating Sepharose柱特異性結(jié)合。所述的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽可以在純化后用位點(diǎn)特異性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、腸激酶和)(a因子等，以獲得目標(biāo)蛋白。另外，可使用國(guó)際
發(fā)明者傅海龍, 包駿, 孫祥明, 李忠秀 申請(qǐng)人:上海科新生物技術(shù)股份有限公司