專利名稱：表達(dá)ctb和人胰島素融合蛋白的重組家蠶桿狀病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組昆蟲桿狀病毒、通過該重組病毒制備融合蛋白及其在制備抗I型糖尿病口服藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
I型糖尿病(胰島素依賴性糖尿病，IDDM)由胰島素分泌缺陷產(chǎn)生，它是一種針對胰島β細(xì)胞的自身免疫性疫病。雖然導(dǎo)致IDDM的自身抗原包括胰島素谷氨酸脫羧酶、胰島素、熱休克蛋白、羧基肽酶H等多種抗原，但是實(shí)驗(yàn)中僅給動(dòng)物口服一種自身抗原-胰島素，即誘導(dǎo)了免疫耐受，產(chǎn)生了保護(hù)作用(Science，1994，2651237)。這是由于口服抗原能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子，如TGF-β，對由相互間無關(guān)的各種抗原誘導(dǎo)的、但在同一特異器官發(fā)生的所有病理免疫反應(yīng)進(jìn)行抑制，即抗原驅(qū)動(dòng)旁觀者抑制(Antigen-drivenBystander Suppression)。旁觀者抑制的誘導(dǎo)是抗原特異性的，而效應(yīng)是非特異的，這為預(yù)防I型糖尿病等自身免疫疾病提供了一條新的途徑(ImmunolToday，1998，19173)。同時(shí)，研究表明霍亂毒素B亞基(CTB)可作為誘導(dǎo)口服耐受的強(qiáng)大粘膜運(yùn)載系統(tǒng)，并且CTB偶聯(lián)抗原可能涉及到與傳統(tǒng)大劑量口服自身抗原產(chǎn)生免疫耐受效應(yīng)明顯不同的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，可能涉及到發(fā)炎細(xì)胞的移動(dòng)行為的變化(Nat Biotechnol，1998，16，292)，暗示CTB偶聯(lián)自身抗原不僅使應(yīng)用口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疫病更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，而且還有潛在的治療前景(Proc Natl Acad Sci USA，1997，944610)。
目前表達(dá)融合蛋白主要是通過轉(zhuǎn)基因植物來進(jìn)行，其缺陷是表達(dá)量太低，只占可溶性蛋白含量的0.01-0.4％，產(chǎn)生的耐受效應(yīng)亦低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種CTB與人胰島素重組基因以及含有該重組基因的家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明的目的之二是提供一種CTB與人胰島素融合蛋白及其制備方法。
本發(fā)明的目的之三是提供一種用重組家蠶桿狀病毒感染的蠶幼蟲和蛹制備的抗I型糖尿病口服藥物及其制備方法。
本發(fā)明通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。
家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)是真核表達(dá)系統(tǒng)，該技術(shù)自1983年Smith等首創(chuàng)以來，已有百種外源基因在該系統(tǒng)表達(dá)(《昆蟲病毒分子生物學(xué)》，1998，547)。由于家蠶淋巴血本身的大量蛋白的保護(hù)作用和一些未知機(jī)理的作用，家蠶表達(dá)的蛋白可以生產(chǎn)口服藥物。本發(fā)明運(yùn)用分子克隆技術(shù)獲得CTB與人胰島素融合基因，采用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bombyxmori Nuclear polyhedrosis Virus)，并在家蠶幼蟲和蛹中表達(dá)該融合蛋白，經(jīng)分離純化，冷凍干燥，制成口服藥物。
具體的技術(shù)方案是(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pBac-INS根據(jù)人胰島素基因序列(Science 1980；20857)設(shè)計(jì)6條引物，具體序列見表1，其中F1、F2、F3為正向引物，R1、R2、R3反向引物，F(xiàn)1的5’端加有BamHI位點(diǎn)，R1的5’端加有EcoRI位點(diǎn)(黑體表示)。其中B鏈與A鏈之間的C肽被6個(gè)氨基酸RRGSKR取代，以便可以被蛋白酶酶解(Gene 1981；1663)。通過一次鏈延伸反應(yīng)和兩次PCR的方法獲得目的序列后將其連接在轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8上，獲得重組質(zhì)粒pBac-INS。
表1

*SINSEQ ID NO.
(2)構(gòu)建融合基因CTB-INS設(shè)計(jì)3條引物，具體序列見表2。引物Pct和P1用來去除CTB基因的終止子并在其3’端加上連接頭的序列；引物P2和R1用來去除人胰島素基因的起始密碼子并在其5’端加上連接頭的序列(黑體表示)。以pBac-CTB質(zhì)粒(該質(zhì)粒已經(jīng)由中國01144502.5專利申請“霍亂毒素B亞基的制法”公開，并且在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，保藏編號為CGMCC No.0594)為模板、Pctb和P1為引物進(jìn)行擴(kuò)增，使CTB基因與人胰島素基因之間以柔性四肽(GPGP)連接，獲得片段CTB-GPGP。以pBac-INS質(zhì)粒為模板、P2和R1為引物，通過擴(kuò)增獲得INS-GPGP。以CTB-GPGP和INS-GPGP互為引物和模板進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)，得到產(chǎn)物記為S1，再以S1為模板、Pctb和R1為引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大小約為560bp左右的融合基因CTB-INS。融合基因序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
表2

(3)構(gòu)建含有融合基因的昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-CTB-INS將PCR獲得的目的片段(CTB-INS)經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后，連接在同樣被BamHI和EcoRI雙酶切的轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8上，構(gòu)建含CTB與人胰島素融合基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-CTB-INS，其構(gòu)造見圖1；(4)含CTB與人胰島素融合基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacCTBINS的獲得將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-CTB-INS與家蠶核型多角體病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染家蠶(Bombyxmori)細(xì)胞BmN，進(jìn)行10輪空斑和Southern點(diǎn)雜交篩選，篩選出含CTB與人胰島素融合基因的重組昆蟲桿狀病毒BmBacCTBINS。該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，保藏日期為2003年11月7日，保藏編號為CGMCC No.1033；(5)表達(dá)CTB與人胰島素融合蛋白將重組桿狀病毒BmBacCTBINS感染BmN家蠶細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增后的重組桿狀病毒BmBacCTBINS注射至家蠶幼蟲和蛹體內(nèi)，分別取家蠶幼蟲和蛹淋巴血，經(jīng)5000rpm 5分鐘離心后取上清，稀釋10倍后加等體積的2×蛋白上樣緩沖液，進(jìn)行12％的SDS-PAGE分析。用考馬斯亮藍(lán)R250染色，結(jié)果見圖2。從SDS-PAGE和Wersten印跡(圖3)結(jié)果可以看出，CTB與人胰島素融合基因在家蠶幼蟲和蛹中的表達(dá)產(chǎn)物為21kD左右，與預(yù)測大小一致。對CTB與人胰島素融合的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫活性鑒定，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物具有很強(qiáng)的免疫活性，通過CTB標(biāo)準(zhǔn)品可以計(jì)算得出在幼蟲和蛹體中的表達(dá)量分別達(dá)到500μg/ml和600μg/ml，大大高于在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。
在家蠶幼蟲和蛹體表達(dá)出來的CTB與人胰島素融合蛋白，經(jīng)過過濾、離心、冷凍干燥后，以家蠶幼蟲和家蠶蛹為填充料配制成口服藥物。
本發(fā)明的有益效果是用蠶高效表達(dá)CTB與人胰島素融合蛋白，比直接從原核生物中表達(dá)的融合蛋白活性高，比通過轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的產(chǎn)率高；家蠶是可以無菌大規(guī)模飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)昆蟲，可以低成本地大規(guī)模飼養(yǎng)，而且不會(huì)造成公害；蠶體中有多種天然蛋白質(zhì)保護(hù)劑，對表達(dá)產(chǎn)物有保護(hù)作用，使基因表達(dá)產(chǎn)物十分穩(wěn)定家蠶生產(chǎn)的融合蛋白可以作為口服藥物，為患者解除了注射的痛苦和被感染的威脅。


圖1是含CTB與人胰島素融合基因的昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-CTB-INS(圖注說明AcMNPV/AcNPV苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒多角體啟動(dòng)子5’端/3’端旁側(cè)序列；P苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒多角體啟動(dòng)子；A(Polyhedin Poly A+signal)多角體蛋白基因聚腺苷酸化信號；M13 oriM13噬菌體復(fù)制起始點(diǎn)；Amp氨芐青霉素基因；oripUC復(fù)制起始點(diǎn))圖2是家蠶表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖譜，其中M、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)記；1、BmCTBINS感染的家蠶血淋巴；2、野生病毒感染的家蠶血淋巴。
圖3是家蠶表達(dá)產(chǎn)物的Western分析，其中M、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)記；1、BmCTBINS感染的家蠶血淋巴；2、野生病毒感染的家蠶血淋巴。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
〔實(shí)施例1〕CTB與人胰島素融合基因的構(gòu)建首先，根據(jù)已發(fā)表的人胰島素基因序列設(shè)計(jì)6條引物(Science 1980；20857)，其中B鏈與A鏈之間的C肽被6個(gè)氨基酸的“mini-C”肽(RRGSKR)取代(Gene 1981；1663)其中F1、F2、F3為正向引物，R1、R2、R3反向引物(表1)，F(xiàn)1的5’端加有BamHI位點(diǎn)，R1的5’端加有EcoRI位點(diǎn)(黑體表示)。
通過一次鏈延伸反應(yīng)和兩次PCR的方法獲得人胰島素(1)鏈延伸反應(yīng)體系含有引物F3和R3，5單位的Taq酶和其他常規(guī)PCR試劑(上海生工公司)；反應(yīng)條件為94℃變性10分鐘，55℃退火5分鐘后讓F3和R3互為引物和模板在72℃延伸5分鐘，得到產(chǎn)物記為SegI；(2)第一次PCR以SegI為模板，F(xiàn)2和R2為引物，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘，擴(kuò)增時(shí)94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫5分鐘，此時(shí)產(chǎn)物記為SegII，并用DNA清潔試劑盒(杭州維特潔生物技術(shù)公司)純化該產(chǎn)物；(3)第2次PCR以純化的SegII為模板，F(xiàn)1和R1為引物，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘，擴(kuò)增時(shí)94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，最后得到PCR產(chǎn)物記為SegIII。再次純化該目的片段后，用BamHI和EcoRI雙酶切低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收基因片段，與同樣經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切的pBacPAK8載體片段連接，經(jīng)過酶切和PCR鑒定獲得重組質(zhì)粒pBac-INS，通過測序證明人胰島素基因的核苷酸序列完全正確。
為構(gòu)建融合基因，再設(shè)計(jì)3條引物Pctb、P1和P2，使CTB基因與人胰島素基因之間以柔性四肽(GPGP)連接。以pBac-CTB質(zhì)粒為模板，Pctb和P1為引物，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘，擴(kuò)增時(shí)94℃1分鐘，59℃1分鐘，72℃1分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，獲得片段記為CTB-GPGP；同樣以pBac-INS質(zhì)粒為模板，P2和R1為引物，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘，擴(kuò)增時(shí)94℃1分鐘，57℃1分鐘，72℃1分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，獲得片段記為GPGP-INS。最后以片段CTB-GPGP和GPGP-INS構(gòu)建融合基因，首先進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)反應(yīng)體系中純化過的CTB-GPGP和GPGP-INS互為引物和模板，反應(yīng)條件為94℃變性10分鐘，59℃退火5分鐘，72℃延伸5分鐘，得到產(chǎn)物記為S1。再以S1為模板，Pctb和R1為引物，擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘，擴(kuò)增時(shí)94℃1分鐘，59℃1分鐘，72℃1分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，獲得大小約為560bp左右的目的融合基因CTB-INS。
〔實(shí)施例2〕CTB與人胰島素融合基因的昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建將上述目的融合基因進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切后連在同樣被BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8(CLONTECH公司)上，構(gòu)建含CTB與人胰島素基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-CTB-INS，經(jīng)酶切分析和PCR鑒定基因正確插入后，經(jīng)過自動(dòng)序列測定表明構(gòu)建的融合基因序列完全正確，融合基因序列及其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
〔實(shí)施例3〕CTB與人胰島素融合基因的重組桿狀病毒的獲得取5ul含CTB與人胰島素融合基因的昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-CTB-INS和6ul野生家蠶核型多角體病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。取6ul Lipofectin(GIBCOBRL公司)加入100ul無血清的TC-100培養(yǎng)基混均。將事先培養(yǎng)在35mm Dish中的BmN細(xì)胞用無血清的TC-100(GIBCOBRL公司)培養(yǎng)基洗滌兩次，并逐滴加入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和Lipofectin混合物，27℃培養(yǎng)4-5天，收取上清進(jìn)行第一輪空斑篩選。取5ul上清感染35mm Dish中的BmN細(xì)胞，1小時(shí)后棄去上清加入等量混合的TC-100培養(yǎng)基和低熔點(diǎn)瓊脂糖。4-5天后挑取空斑，感染Bm N細(xì)胞3-4天，保存上清，細(xì)胞用NaOH裂解用于Southern雜交，取陽性克隆的上清進(jìn)行第10輪空斑篩選。取陽性克隆的上清感染Bm N細(xì)胞擴(kuò)增。即可得到大量的含CTB與人胰島素融合基因的重組桿狀病毒，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2003年11月7日，保藏編號為CGMCC No.1033。
〔實(shí)施例4〕CTB與人胰島素融合基因在家蠶幼蟲和蛹中的表達(dá)取擴(kuò)增的含CTB與人胰島素融合基因的重組桿狀病毒注射到五齡家蠶(Bombyx mori)幼蟲和蛹中，每頭注射2ul左右(滴度為1×107/ml)，分別取24、48、72、96、120和144小時(shí)表達(dá)的家蠶淋巴和蛹血，5000rpm 5min離心后取上清，用PBS pH7.4稀釋10倍后，加入等體積的2×蛋白質(zhì)上樣緩沖液(100MmTris.HCl，4％SDS，0.1％溴酚藍(lán)，10％甘油)，取20ul進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，CTB與人胰島素融合蛋白在家蠶和蛹中獲得高效表達(dá)，經(jīng)Western雜交表明表達(dá)產(chǎn)物分子量為21kD。
〔實(shí)施例5〕蠶表達(dá)的CTB與人胰島素融合蛋白的免疫活性測定將家蠶幼蟲和蛹體含有表達(dá)的CTB與人胰島素融合蛋白的血淋巴，高速冷凍離心，取上清。稀釋1000倍后包被酶標(biāo)板，同時(shí)以CTB為標(biāo)準(zhǔn)品，按照常規(guī)的ELISA步驟操作，其中兔抗CT一抗(購自SIGMA公司)稀釋5000倍，山羊抗兔二抗(購自華美生物工程公司)稀釋1000倍，用OPD(購自上海化學(xué)試劑公司)顯色，于492nm處測定OD值，結(jié)果表明幼蟲和蛹體表達(dá)的目的蛋白有很強(qiáng)的免疫活性，表達(dá)量分別達(dá)到500μg/ml和600μg/ml。
〔實(shí)施例6〕在家蠶幼蟲和蛹中的表達(dá)的CTB與人胰島素融合蛋白口服藥物的制備用重組病毒BmBacCTBINS穿刺接種五齡家蠶幼蟲和蛹體(申請人自行飼養(yǎng))，收集表達(dá)第5天的蠶淋巴血和蛹體，12000rmp高速離心，取上清用于活性測定。上清經(jīng)過過濾(100KD超濾)，12000rmp高速離心，再經(jīng)35000rmp離心后取上清冷凍干燥后，以家蠶蛹為填充料配制成口服藥物。
〔實(shí)施例7〕家蠶幼蟲蠶蛹表達(dá)的CTB與人胰島素融合蛋白進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)將4周齡雌NOD小鼠隨機(jī)分成4組，前兩組每組5只，做病理學(xué)分析，后兩組每組10只，做糖尿病監(jiān)測。從第5周開始口服給藥，劑量為100μg/鼠，每周給藥2次。做病理分析的，連續(xù)喂5周，糖尿病監(jiān)測的連續(xù)喂25周。前后兩組中均有一組為陰性對照，口服給正常蠶血淋巴。病理學(xué)分析第10周處死小鼠，取其尾靜脈血作抗體滴度測定，測定口服后小鼠產(chǎn)生的胰島素抗體水平；并取小鼠胰島作組織切片，觀察胰島炎發(fā)生情況，并作相應(yīng)評分。糖尿病檢測從第10周起，檢測NOD小鼠尿液的尿糖情況，陽性者繼續(xù)測血糖，如果連續(xù)兩周血糖含量大于或等于16.7mmol/L，則判定為該小鼠患糖尿病。分別對兩組中小鼠患病率進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)分析。小鼠胰島作組織切片結(jié)果表明給藥組胰島炎顯著低于對照NOD小鼠；25周后陰性90％對照NOD小鼠已患糖尿病，而給藥組則只有20％NOD小鼠已患糖尿病。
序列表<110>浙江大學(xué)<120>表達(dá)CTB和人胰島素融合蛋白的重組家蠶桿狀病毒及其在制備抗I型糖尿病口服藥物中的應(yīng)用<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>558<212>DNA<213>Artificial<400>1atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt acagttttac tatcttcagc atatgcacat 60ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatacatacg120ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatt180attactttta agaatggtgc aacttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat240tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa300gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt360agtatggcaa atggccccgg cccctttgtg aaccaacacc tgtgcggctc acacctggtg420gaagctctct acctagtgtg cggggaacga ggcttcttct acacacccaa gacccgccgg480ggctccaagc gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct ctaccagctg540gagaactact gcaactaa 558
<211>185<212>PRT<213>Artificial<400>2Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser Ser1 5 10 15Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu20 25 30Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr35 40 45Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys50 55 60Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp65 70 75 80Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala85 90 95Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys100 105 110Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Ash Gly Pro Gly Pro115 120 125Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr130 135 140Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg145 150 155 160Gly Ser Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser165 170 175Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn180 185<210>3<211>40
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權(quán)利要求
1.一種融合基因，其特征在于由人胰島素基因和CTB基因重組而成，具有SEQ ID NO.1所示的堿基序列。
2.一種重組家蠶桿狀病毒，其特征在于包含有SEQ ID NO.1所示堿基序列的融合基因，保藏編號為CGMCC No.1033。
3.權(quán)利要求2所述的重組家蠶桿狀病毒的制備方法，包括如下步驟(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pBac-INS(a)以F3和R3互為引物和模板，延伸得到產(chǎn)物SegI(b)以SegI為模板，F(xiàn)2和R2為引物，擴(kuò)增得到產(chǎn)物SegII(c)以純化的SegII為模板，F(xiàn)1和R1為引物，擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物SegIII，再次純化該目的片段后，用BamHI和EcoRI雙酶切低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收基因片段，與同樣經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切的pBacPAK8載體片段連接，獲得重組質(zhì)粒pBac-INS；(2)構(gòu)建融合基因CTB-INS(a)以pBac-CTB質(zhì)粒為模板、Pctb和P1為引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得片段CTB-GPGP(b)以pBac-INS質(zhì)粒為模板、P2和R1為引物，通過擴(kuò)增獲得片段INS-GPGP(c)以CTB-GPGP和INS-GPGP互為引物和模板進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)，得到產(chǎn)物S1，再以S1為模板、Pctb和R1為引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得融合基因CTB-INS；(3)將上述融合基因進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切后連在同樣被BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8上，構(gòu)建含CTB與人胰島素基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-CTB-INS；(4)取含CTB與人胰島素融合基因的昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-CTB-INS和野生家蠶核型多角體病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染獲得含CTB與人胰島素融合基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacCTBINS；其中，引物F1序列為<SEQ ID NO.3>5’-GGGGATCCATGTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACA-3’引物F2序列為<SEQ ID NO.4>5’-CCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGG-3’引物F3序列為<SEQ ID NO.5>5’-CTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCC-3’引物R1序列為<SEQ ID NO.6>5’-GGGAATTCTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGAGG-3’引物R2序列為<SEQ ID NO.7>5’-TCCAGCTGGTAGAGGGAGCAGATGCTGGTACAGCATTGTTCCACAATGCC-3’引物R3序列為<SEQ ID NO.8>5’-TTGTTCCACAATGCCACGCTTGGAGCCCCGGCGGGTCTTGGGTGTGTAGA-3’引物Pctb序列為<SEQ ID NO.9>5’-CGGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’引物P1序列為<SEQ ID NO.10>5’-GGGGCCGGGGCCATTTGCCATACTAATTG-3’引物P2序列為<SEQ ID NO.11>5’-GGCCCCGGCCCCTTTGTGAACCAACACCT-3’。
4.一種融合蛋白，其特征在于由人胰島素和CTB重組而成，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4所述的融合蛋白的制備方法，包括如下步驟(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pBac-INS；(2)構(gòu)建融合基因CTB-INS；(3)構(gòu)建含有融合基因的昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-CTB-INS；(4)獲得含CTB與人胰島素融合基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacCTBINS；(5)表達(dá)CTB與人胰島素融合蛋白將重組桿狀病毒BmBacCTBINS感染BmN家蠶細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增后的重組桿狀病毒BmBacCTBINS注射至家蠶幼蟲和蛹體內(nèi)，表達(dá)出融合蛋白。
6.一種治療I型糖尿病的藥物，其特征在于包括如權(quán)利要求4所述的融合蛋白和家蠶填充劑。
7.權(quán)利要求6所述的治療I型糖尿病藥物的制備方法，其特征在于將表達(dá)CTB與人胰島素融合蛋白的家蠶幼蟲和蛹經(jīng)過濾、離心和冷凍干燥后制成。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工程中的基因工程生產(chǎn)多肽類藥物技術(shù)領(lǐng)域。通過家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)重組帶有CTB與人胰島素融合基因，獲得重組病毒，將該重組病毒接種家蠶幼蟲、蛹進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)冷凍干燥，制成口服藥物，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)，對小鼠具有明顯的降血糖和抑制糖尿病的作用，成為一種制備抗I型糖尿病的口服藥物的新型方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，原料易得，生產(chǎn)成本低，治療效果良好，具有十分重大的市場開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號A61P3/10GK1629288SQ20031012113
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者金勇豐, 張耀洲, 龔朝暉 申請人:浙江大學(xué)