專利名稱：氧化葡糖桿菌吡咯喹啉醌合成蛋白系統(tǒng)及其編碼的基因簇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的吡咯喹啉醌合成基因簇及其編碼蛋白系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
維生素C(vatamin C，Vc)是一種水溶性維生素，又稱L-抗壞血酸(L-ascorbic acid)，能參與體內(nèi)多種羥化反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，是一種重要的細(xì)胞代謝氧化還原化合 物，在人體中起著必不可少的生理作用，在醫(yī)藥、化妝品、食品和飼料等諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。 隨著人們生活水平的提高和對(duì)維生素C用途的不斷開發(fā)，維生素C的市場(chǎng)需求日益增大。早期維生素C的生產(chǎn)主要采用“萊氏法”化學(xué)合成(Helvetica chimica Acta，第 17卷，311頁(yè)，1934年)。該法產(chǎn)品質(zhì)量好，轉(zhuǎn)化效率高，但工藝復(fù)雜，環(huán)境污染嚴(yán)重，已逐漸 被微生物轉(zhuǎn)化法取代。其中我國(guó)尹光琳等上世紀(jì)八十年代開發(fā)的“二步發(fā)酵法”是目前維 生素C工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的主要生產(chǎn)路線(美國(guó)專利4935359，1990年)。該法第一步利用 生黑醋桿菌將D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-山梨糖，第二步是在混合菌系的作用下將山梨糖轉(zhuǎn)化為 2-酮基-L-古龍酸。混合菌系包括兩種微生物，直接負(fù)責(zé)山梨糖生物氧化的微生物俗稱小 菌，原來命名為氧化葡糖桿菌(GluconcAacter oxydans)，2000年經(jīng)系統(tǒng)分類學(xué)鑒定重新命 名為普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare) (Urbance Jff et al. ,2001)；另一 種微生物俗稱大菌，生產(chǎn)中多采用芽孢桿菌，其自身不能轉(zhuǎn)化山梨糖，作為伴生菌起輔助小 菌生長(zhǎng)和產(chǎn)生的作用。小菌中山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸由山梨糖脫氫酶(sorbose dehydrogenase, SDH)負(fù)責(zé)，迄今為止已在小菌基因組中發(fā)現(xiàn)四種山梨糖脫氫酶基 因，其編碼的山梨糖脫氫酶均為定位于細(xì)菌周質(zhì)的脫氫酶，也都是依賴吡咯喹啉醌 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)作為輔酶的醌酶。小菌中將山梨酮糖轉(zhuǎn)化為酮古龍酸 的一種山梨酮脫氫酶(sorbsone dehydrogenase, SNDH)以及將山梨醇轉(zhuǎn)化為山梨糖的山梨 醇脫氫酶(sobitol dehydrogenase, SLDH)也都是以PQQ為輔酶。這些醌酶在小菌體內(nèi)催 化底物，發(fā)揮正常生理功能需要結(jié)合輔酶PQQ。PQQ的生物合成涉及4-7個(gè)基因(pqqA，B, C，D，Ε, F，G)，這些基因在染色體上一般 成簇排列。有的Pqq基因連續(xù)排列成1個(gè)基因簇，如肺炎克雷伯氏菌為pqqABCDEF ；而有的 則分布在2個(gè)基因簇中，如在扭脫甲基桿菌中有2個(gè)簇，一個(gè)為pqqAB⑶E，另一個(gè)為pqqFG。 有的pqq基因與依賴PQQ的脫氫酶基因相鄰。不同細(xì)菌的PQQ合成基因序列具有一定的保 守性。除了已經(jīng)確證pqqA編碼多肽為PQQ合成前體以及pqqC是催化PQQ合成反應(yīng)中最后 一步反應(yīng)的酶以外，其他基因的功能目前還不是很清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種吡咯喹啉醌合成的蛋白系統(tǒng)及其所編碼的基因簇和其 應(yīng)用。本發(fā)明所提供的吡咯喹啉醌合成基因，來源于氧化葡糖桿菌1. 110(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保存管理中心)，具有下述核苷酸序列SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，由3248個(gè)堿基組成。該序列包含5個(gè)PQQ合 成基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE，組成一個(gè)pqqABCDE基因簇。其中第1_93位堿基為 pqqA基因序列NO. 2，編碼蛋白序列為NO. 3。第253-1014位堿基為pqqB基因序列NO. 4，編 碼蛋白序列為NO. 5。第1011-1775位堿基為pqqC基因序列N0. 6，編碼蛋白序列為N0. 7。 第1775-2080位堿基為pqqD基因序列N0. 8，編碼蛋白序列為N0. 9。第2073-3248位堿基 為pqqE基因序列N0. 10，編碼蛋白序列為N0. 11。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā) 明吡咯喹啉醌合成的蛋白系統(tǒng)還包括由SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 11所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有同等 活性的由 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11 所示的蛋 白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)組成。本發(fā)明提供的基因簇還包括編碼上述蛋白的核酸序列。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。 在pqqAB⑶E基因簇中，pqqA基因由單獨(dú)的啟動(dòng)子控制，pqqB⑶E組成一個(gè)操縱子。 pqqB和pqqC基因編碼區(qū)有4個(gè)堿基的重疊，pqqC和pqqD基因編碼區(qū)有1個(gè)堿基的重疊， pqqD和pqqE基因編碼區(qū)有8個(gè)堿基的重疊。所述的氧化葡糖桿菌1. 110PQQ合成基因簇與氧化葡糖桿菌621H的PQQ合成基因 簇排列方式相同，兩者的pqqABCDE基因序列核苷酸相同性為61.0%。其編碼蛋白氨基酸相 同性分別為 pqqA60. 7%，pqqB 49. 0%, pqqC 64. 2%, pqqD 35. 8%, pqqE 51. 0%。大腸桿菌DH5a自身不能合成PQQ，也沒有PQQ合成基因。通過PCR擴(kuò)增得到 氧化葡糖桿菌1. 110的PqqABCDE基因簇，將該基因簇連入載體，優(yōu)選的載體為本領(lǐng)域公 知的用于表達(dá)外源基因的低拷貝載體，最為優(yōu)選的是低拷貝載體p0K12(GenBank登錄號(hào) AF223639)，導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α中，表達(dá)得到吡咯喹啉醌合成相關(guān)蛋白，通過醌酶SDH活性 DCIP法檢測(cè)，能夠檢測(cè)到宿主菌PQQ的合成。本發(fā)明還提供含有的PQQ合成基因的載體、細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本發(fā)明的吡咯喹啉醌合成相關(guān)基因及其編碼蛋白將在研究PQQ生物合成、改良和 構(gòu)建PQQ生產(chǎn)菌株、提高小菌糖酸轉(zhuǎn)化效率以及構(gòu)建醇糖酸一步轉(zhuǎn)化工程菌中起到重要作用。


圖1為氧化葡糖桿菌1. 110基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳。M λ -HindIII分子量 標(biāo)準(zhǔn)；1 氧化葡糖桿菌1. 110基因組DNA。圖2為氧化葡糖桿菌1. 110基因組中PQQ合成相關(guān)基因圖3為pqqABCDE基因簇PCR擴(kuò)增。M :DL5000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1,2 :pqqABCDE擴(kuò)增產(chǎn) 物圖4為質(zhì)粒p0K12_pqqABCDE的酶切PCR鑒定。M λ -Hind III分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 質(zhì)粒p0K12_pqqABCDE的雙酶切。圖5 為 p0K12_pqqABCDE/DH5 α 的活性檢測(cè)。1 陰性對(duì)照 p0K12/DH5 α ；2 SDH+PQQ ；3 =SDH ；4 =PQQ ；5 SDH+pOK 12-pqqABCDE/DH5 α 裂解液；6 :SDH+p0K12_pqqABCDE/ DH5a 上清液；7 :p0K12-pqqABCDE/DH5 α 裂解液。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1氧化葡糖桿菌1. 110基因組DNA的提取挑取氧化葡糖桿菌1. 110單菌落，接種到5mL的HJY液體培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基含15g 山梨糖，:3g酵母膏，3g玉米漿，15g蛋白胨, 尿素，2g葡萄糖，0. 2g MgSO4-12H20,4g CaCO3, 5gKH2P04, pH 6.8)試管中，200r/min、30°C培養(yǎng)活化48h。按1 %的體積比例接種到500mL HJY培養(yǎng)基中，200r/min，3(TC培養(yǎng)48h。根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行微生物基因組提取(《精編分子生 物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》F.奧斯伯、R.布倫特、R.E.金斯頓著，顏?zhàn)訚}、王海林譯。2. 4(39 40))。 基因組DNA要求OD值在1.8 2.0之間；樣品濃度> lOOng/yL (圖1)。實(shí)施例2氧化葡糖桿菌1. 110基因組測(cè)序氧化葡糖桿菌1. 110經(jīng)SOLEXA測(cè)序，總讀長(zhǎng)221Mbp，基因組的覆蓋率達(dá)到了 67.2倍。氧化葡糖桿菌1.110基因組大小總計(jì)為3，觀8，40牝？，6+(含量為61.76%。使 用Glimmer 3. 0進(jìn)行細(xì)菌基因組的基因預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)有3359個(gè)編碼框，編碼區(qū)百分比為 91. 12%。基因組中發(fā)現(xiàn)有59個(gè)tRNA和5個(gè)rRNA操縱元。實(shí)施例3氧化葡糖桿菌1. 110基因組注釋中的PQQ合成基因根據(jù)氧化葡糖桿菌1. 110全基因組測(cè)定序列，經(jīng)Glimmer 3. 0軟件基因預(yù)測(cè)，同 COG、KEGG、SWISSPROT、TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并進(jìn)行基因注釋，并進(jìn)行人工校正。發(fā)現(xiàn)氧化葡 糖桿菌1. 110基因組中PQQ合成基因pqqAB⑶E，成基因簇排列(圖2)。實(shí)施例4氧化葡糖桿菌1. 110基因組PQQ合成基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)氧化葡糖桿菌1. 110全基因組注釋的PQQ合成基因序列設(shè)計(jì)引物(PI :5’_CG GGATCC TGCATCGAACACCAGAACA-3，BamHI,P2 :5’ -GG CATATG CGCAAAAGCTGACCAACCT-3，Nde I)，以提取的氧化葡糖桿菌1. 110基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到了 PQQ合成基因序列 pqqABCDE (圖 3)。實(shí)施例5pqqAB⑶E基因簇導(dǎo)入大腸桿菌中指導(dǎo)PQQ合成PCR擴(kuò)增得到的pqqABCDE基因經(jīng)BamH I和Nde I雙酶切，插入載體p0K12對(duì) 應(yīng)酶切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得攜帶完整結(jié)構(gòu)基因的重組表達(dá)質(zhì)粒 p0K12-pqqAB⑶Ε。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定正確(圖4)。挑單菌落于LB液體培 養(yǎng)基，37°C、220r/min培養(yǎng)1 后，轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基；37°C、220r/min培養(yǎng)12h，收集 ImL菌體，重懸于600L 20mmol/L pH = 8. OTris-HCl緩沖液中，冰浴超聲處理，低溫離心， 上清液用于酶活性檢測(cè)。利用DCIP法檢測(cè)活性，取20L菌體超聲裂解液、IOL SDH(sorbose dehydrogenase,山梨糖脫氫酶)(60mg/L)、500L DCIP檢測(cè)液、混合后觀察顏色變化。上述 藥品可以市售獲得。結(jié)果如圖5所示，將p0K12-pqqAB⑶E/DH5 α菌體裂解后，檢測(cè)樣品的PQQ活性，出 現(xiàn)了特異性的檢測(cè)液褪色。陽(yáng)性對(duì)照及表達(dá)樣品加入檢測(cè)液后，檢測(cè)液立即由綠色變?yōu)辄S色，說明p0K12-pqqAB⑶E質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α后，能夠指導(dǎo)PQQ的合成，PQQ的合成量 為100μ g/mL左右。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.吡咯喹啉醌合成的蛋白系統(tǒng)，其由1)由SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 11 所示的蛋 白質(zhì)組成；或由2)在EQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11 所示的氨 基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì) 組成。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白系統(tǒng)的基因簇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因簇，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示，共有5個(gè)基因， 具體為pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的基因簇的細(xì)胞系。
5.含有權(quán)利要求2或3所述的基因簇的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求2或3所述基因簇在生產(chǎn)吡咯喹啉中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種吡咯喹啉醌合成基因簇及其編碼蛋白系統(tǒng)，其由1)由SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11所示的蛋白質(zhì)組成；或由2)在EQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)組成。本發(fā)明同時(shí)提供編碼上述蛋白系統(tǒng)的基因簇，其序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明提供的吡咯喹啉醌合成基因簇及其編碼蛋白系統(tǒng)將在PQQ生物合成、改良和構(gòu)建PQQ生產(chǎn)菌株、提高小菌糖酸轉(zhuǎn)化效率以及構(gòu)建醇糖酸一步轉(zhuǎn)化工程菌中起到重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102146123SQ201010588079
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者安佳佳, 張惟材, 智靜娟, 李淼鑫, 楊延新, 楊璐, 汪建華, 熊向華, 韋娜 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所