專利名稱：香雪蘭查爾酮合酶的cDNA及DNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從紅花香雪蘭花瓣中克隆編碼查爾酮合酶 (CHS)的 cDNA 和 DNA。
背景技術(shù)：
查爾酮合酶(chalcone synthase, CHS)是花色素合成途徑中的關(guān)鍵酶，它在植物中的表達(dá)量直接影響到花色的變化。該酶是類黃酮物質(zhì)生物合成途徑的限速酶，催化類黃酮和花色素合成途徑的第一步反應(yīng)，即催化三分子的丙二酰-CoAOiialonyl-CoA)和1分子的對香豆酰-CoA (p-coumaryl-CoA)結(jié)合形成1個具有C15架的黃酮類化合物一柚皮素查爾酮(naringenin chalcone)。該產(chǎn)物的異構(gòu)化和功能基團(tuán)的進(jìn)一步取代都能導(dǎo)致黃酮、異黃酮和花色素苷的合成。這些化合物為自然界提供了顏色，并參與了植物的多種生理過程， 包括防紫外線輻射、抗病、生長素運輸、花粉的育性等。在大多數(shù)物種中，查爾酮合酶基因以多基因家族形式存在，其表達(dá)受環(huán)境和發(fā)育的調(diào)控。自20世紀(jì)70年代中期以來，查爾酮合酶基因一直是研究基因進(jìn)化與表達(dá)調(diào)控的模式系統(tǒng)。1983年，查爾酮合酶基因首次從歐芹懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中分離得到。到目前為止，已從多種雙子葉、單子葉和裸子植物中克隆到了查爾酮合酶基因，例如， 玉米(P.Franken etal. EMB0J. 10(1991)2605-2612),高粱(C. Lo etal. Physiol. Mol. Plant Pathol. 61 (2002) 179—188)、蘭花(C. F. Liew etal. Plant Physiol. Biochem. 9(1998)647-656)、矮牽牛(Τ. A. Holton et al. Plant J. 4 (1993) 1003-1010)、擬南芥(D. Ε· Saslowsky et al. Gene 225 (2000) 127-138)、金魚草(H. Sommer，H. Saedler. Mol.Gen.Genet. 202(1986)429-434)禾口松樹(J.Schroder et al.Biochemistry 23(1998)8417-8425)等。所有報道的CHS基因都比較保守，并且絕大多數(shù)CHS基因都包含一個內(nèi)含子和兩個外顯子。雖然更多的查爾酮合酶基因序列陸續(xù)被公布出來，查爾酮合酶基因的結(jié)構(gòu)和功能研究也比較透徹，可是有關(guān)香雪蘭查爾酮合酶基因的cDNA和DNA序列信息、內(nèi)含子和外顯子的組成、基因拷貝數(shù)以及基因表達(dá)情況都不明確。本發(fā)明克隆得到的香雪蘭查爾酮合酶基因O^hOB)能編碼與植物次生代謝過程相關(guān)的CHS，具體說該基因是植物花色形成過程中的結(jié)構(gòu)基因之一，能催化類黃酮合成途徑的第一步縮合反應(yīng)，保證黃酮類化合物的合成，與植物花色形成和植物育性密切相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次從紅花香雪蘭中克隆得到查爾酮合酶(CHS)的新cDNA和DNA，確定了它們的核苷酸序列和由此推測出的氨基酸序列，并確定了 DNA序列中的外顯子和內(nèi)含子序列，另外，F(xiàn)hCHS基因在大腸桿菌細(xì)胞中成功的表達(dá)了所述的CHS蛋白。所以，本發(fā)明的目的是提供編碼查爾酮合酶(CHS)的新cDNA及DNA，和由此推斷的
氨基酸序列。
本發(fā)明首先對實驗室已建立的紅花香雪蘭花瓣的cDNA文庫進(jìn)行EST分析，分離得到55;3bp的cDNA片段，測序得到該片段的核苷酸序列。分析該序列顯示此片段所編碼的蛋白質(zhì)與德國鳶尾(Iris germanica)的查爾酮合酶同源性最高，達(dá)到91 %。另外，序列分析顯示該片段包含TAA終止密碼子。利用Clontech公司的RACE試劑盒(SMARTer RACE cDNA AmplificationKit)進(jìn)行5，RACE克隆該基因的5，端序列，得到1171bp的片段，測序得到該片段的核苷酸序列。分析該序列顯示此片段所編碼的蛋白質(zhì)與Iris germanica的查爾酮合酶同源性最高，達(dá)到92%。另外，序列分析顯示該片段包含ATG起始密碼子。拼接上述兩次獲得的片段，即可得到查爾酮合酶基因全長cDNA序列信息，以此設(shè)計引物，提取紅花香雪蘭花瓣總RNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR，克隆得到1240bp的查爾酮合酶基因全長 cDNA，其中開放閱讀框架長1170bp，其編碼的蛋白質(zhì)序列長389個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量推測是42，581Da，等電點為5. 74。提取紅花香雪蘭花瓣基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR，克隆得到1369bp的查爾酮合酶基因全長DNA序列。在pET48a(+)原核表達(dá)載體中插入克隆得到的的查爾酮合酶全長cDNA，并且轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中，表達(dá)重組查爾酮合酶蛋白。進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測原核表達(dá)產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示在42kDa左右有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，特異性蛋白條帶大小與預(yù)測的CHS蛋白分子量符合，這說明從香雪蘭中克隆得到的查爾酮合酶基因全長cDNA的開放閱讀框正確，可以在大腸桿菌中正常表達(dá)蛋白。一、香雪蘭查爾酮合酶cDNA的特征如下其中1 香雪蘭查爾酮合酶cDNA 3，端序列(SEQ ID NO. 1)GAGGCGTTCMGCOGTTGGGGATCAamTATMCTCACIUTTCTGGATTGCGCAOOOGGGAGGAOOGGCMTACTTGAOCAGGTOGAGGCGMGATAGGACTGAMOCAGAGMGCTGAGAGCTACTAGGCAIUTTCTCAGCGMTATGGCMCATGTOGAGCGCCTGCGTGCTGTTCMTCTOGMGMATGAGGMAMGTOGGCGGAGGAGMGMOGGTAOGAOOGGAGMGGTCTAGAGTGGGGGGTGCTCTTOGGCTTOGGGCOGGGGCTCAOGGTGGAGACAGTGGTGCTACACAGTGTTGMGCT1TAA GTAGCACTACAGTTTGCTATCTTCTTCATACTCATTGAGGACTQXTATATATCMTQXMTACMTMCAGATTGGIUTTTCTCMGTTTGGCTTTGGCCTGTATCTTATGTTTMATMACTTACTTACTAGTGCTCMTATACAGATGATCATCATTTCTTTCTTCTGATGGAGMGMTTTGATGATGACAGACMTMTTTCTMATMAAAAAAAAAAAAAAAMCTC香雪蘭查爾酮合酶cDNA 3’端序列長為55;3bp，下劃線部分表示的是該序列的終止密碼子，終止密碼子以后的序列為3’端非編碼序列(3’ UTR)。其中2 =RACE法獲得香雪蘭查爾酮合酶cDNA 5，端序列(SEQ ID N0. 2) ACATGGGGATTCMMCATAGCMTAOCACTTAGCTMCTMGMGGMACTCATOGCCMMCTCTCTTTTGTTGCMGAAM ATG GTGMTGTGGAGGAMrTOGCMGGCACAGAGGGCGGMGGCOOGGCOGCCATCTTGGCCATOGGCAOOGCCACT00QXAMTGCCAT0GAGCAGAGCGAGTAT00GGACTACTACTTT0GAGTCA0CMCAGCGAGGATMGGT0GMCTCMGGAGMGTTCMGCGCATGTGCGMMGTOGATGATCMGMGAGGTACTTGTAOCTMOOGAGGACAnCTCMGGAMATOOGMTGTCTGCGCGTACATGGCCAOCTOOCTOGAOGCOOGTCAGGACATGGTOGTOGTTGAGCTTOOGMGCTOGGCAMGMGCTGCCAOGAGAGCCATCMGGMTGGGGGCAGQXMGTOGMGATMOOCAOCTTGTCTTCTGCACMOGAGCGGTGTOGACATGCOOGGGGCOGACTATCAGCTCACMMCTOCTOGGTCTOOGTQXTOGGTCMGCGCCTCATGATGTA0CAGCAGGGCTGCTTTGCGGGCGGCA00GTGCT00GCCTAGCCMGGA0CT0GCGGAGMCM00GCGGTGCT0GAGTOCTOGTOGTCIUrTOOGAGATCACTGCTGTCAOCTTOOGTGGAOOGTCAGAGTCTCATCTOGACAGTCTOGTAGGCCAGGCCnurTOGGTGATGGCGCTGCOGCACTCATOGTAGCTTCTGATGCTATOGAGGGMTOGAGAGAOOGATCTTOGAGAT
GGTCTOOGCTGCGCMAOGATACTOOOOGATAGCGMGGGGCGATOGAOGGCCAOCTTAGGGMGTAGGCCnMTOCATCTGCTCMGGATGTGCOOGGMTCATATOCMGMCATOGMMGAGCCTOGAGGAGGCGTTCMGCOGTTGGGGATCAamTATMCTCACIUrTCTGGATTGCGCAOOOGGGAGGAOOGGCMTACTTGAOCAGGTOGAGGCGMGATAGGACTGMAOCAGAGMGCTGAGAGCTACTAGGCAIUrTCTCAGCGMTATGGCMCATGTOGAGCGCCTGCGTGCTGTTCATTCTCGAAGAAATGAGGAAAAAGTCGGCGGAGGAGAAGAACGGTACGACCGGAG香雪蘭查爾酮合酶cDNA 5’端序列長為1171bp，下劃線部分表示的是該序列的起始密碼子，起始密碼子以前的序列為5’端非編碼序列(5’ UTR)。其中3 香雪蘭查爾酮合酶全長cDNA序列(SEQ ID N0. 3)GCAAGAAAA ATG GTGAATGTGGAGGAAATTCGCAAGGCACAGAGGGCGGAAGGCCCGGCCGCCATCTT GGCCATCGGCACCGCCACTCCCCCAAATGCCATCGAGCAGAGCGAGTATCCGGACTACTACTTTCGAGTCACCAACAGCGA GGATAAGGTCGAACTCAAGGAGAAGTTCAAGCGCATGTGCGAAAAGTCGATGATCAAGAAGAGGTACTTGTACCTAACCG AGGACATTCTCAAGGAAAATCCGAATGTCTGCGCGTACATGGCCACCTCCCTCGACGCCCGTCAGGACATGGTCGTCGTT GAGGTTCCGAAGCTCGGCAAAGAAGCTGCCACGAGAGCCATCAAGGAATGGGGGCAGCCCAAGTCGAAGATAACCCACCT TGTCTTCTGCACAACGAGCGGTGTCGACATGCCCGGGGCCGACTATCAGCTCACAAAACTCCTCGGTCTCCGTCCCTCGG TCAAGCGCCTCATGATGTACCAGCAGGGCTGCTTTGCGGGCGGCACCGTGCTCCGCCTAGCCAAGGACCTCGCGGAGAAC AACCGCGGTGCTCGAGTCCTCGTCGTCTGTTCCGAGATCACTGCTGTCACCTTCCGTGGACCGTCAGAGTCTCATCTCGA CAGTCTCGTAGGCCAGGCCTTGTTCGGTGATGGCGCTGCCGCACTCATCGTAGGTTCTGATGCTATCGAGGGAATCGAGA GACCGATCTTCGAGATGGTCTCCGCTGCGCAAACGATACTCCCCGATAGCGAAGGGGCGATCGACGGTCACCTTAGGGAA GTAGGCCTTACATTCCATCTGCTCAAGGATGTGCCCGGAATCATATCCAAGAACATCGAAAAGAGCCTCGAGGAGGCGTT CAAGCCGTTGGGGATCACCGATTATAACTCACTGTTCTGGATTGCGCACCCGGGAGGACCGGCAATACTTGACCAGGTCG AGGCGAAGATAGGACTGAAACCAGAGAAGCTGAGAGCTACTAGGCATGTTCTCAGCGAATATGGCAACATGTCGAGCGCC TGCGTGCTGTTCATTCTCGAAGAAATGAGGAAAAAGTCGGCGGAGGAGAAGAACGGTACGACCGGAGAAGGTCTAGAGTG GGGGGTGCTCTTCGGGTTCGGGCCGGGGCTCACGGTGGAGACAGTGGTGCTACACAGTGTTGAAGCT TAA^ GTAGCACTACAGTTTGCTATCTTCTTCATACTCATTGAGGACTCCCTATATATCATTCCCA
香雪蘭查爾酮合酶全長cDNA序列長為IMObp，開放閱讀框架長1170bp，下劃線部分表示的是該序列的起始密碼子和終止密碼子。其中4:由香雪蘭查爾酮合酶全長cDNA序列推測得到的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO. 4)MVNVEEIRKAQRAEGPAAILAIGTATPPNAIEQSEYPDYYFRVTNSEDKVELKEKFKRMCEKSMIKKRY LYLTEDILKENPNVCAYMATSLDARQDMVVVEVPKLGKEAATRAIKEWGQPKSKITHLVFCTTSGVDMPGADYQLTKLLG LRPSVKRLMMYQQGCFAGGTVLRLAKDLAENNRGARVLVVCSEITAVTFRGPSESHLDSLVGQALF⑶GAAALIVGSDAI EGIERPIFEMVSAAQTILPDSEGAIDGHLREVGLTFHLLKDVPGIISKNIEKSLEEAFKPLGITDYNSLFWIAHPGGPAI LDQVEAKIGLKPEKLRATRHVLSEYG 匪 SSACVLFILEEMRKKSAEEKNGTTGEGLEWGVLFGFGPGLTVETWLHSVEA香雪蘭查爾酮合酶全長cDNA編碼的蛋白序列長389個氨基酸，推測蛋白質(zhì)的分子量是42，581Da，等電點為5. 74。二、香雪蘭查爾酮合酶DNA的特征如下香雪蘭查爾酮合酶DNA序列(SEQ ID NO. 5)GCAAGAAAAATGGTGAATGTGGAGGAAATTCGCAAGGCACAGAGGGCGGAAGGCCCGGCCGCCATCTTG GCCATCGGCACCGCCACTCCCCCAAATGCCATCGAGCAGAGCGAGTATCCGGACTACTACTTTCGAGTCACCAACAGCGA GGATAAGGTCGAACTCAAGGAGAAGTTCAAGCGCATGTgtaagattaattatattaaaaaaatactacttcatatatgtt ggaatgtataaaaactataatttttattttgagttttggtgcaatggcagagactttaactgattatatatgtacgatgc tatgtagGCGAAAAGTCGATGATCAAGAAGAGGTACTTGTACCTAACCGAGGACATTCTCAAGGAAAATCCGAATGTCTG CGCGTACATGGCCACCTCCCTCGACGCCCGTCAGGACATGGTCGTCGTTGAGGTTCCGAAGCTCGGCAAAGAAGCTGCCA CGAGAGCCATCAAGGAATGGGGGCAGCCCAAGTCGAAGATAACCCACCTTGTCTTCTGCACAACGAGCGGTGTCGACATG CCCGGGGCCGACTATCAGCTCACAAAACTCCTCGGTCTCCGTCCCTCGGTCAAGCGCCTCATGATGTACCAGCAGGGCTG CTTTGCGGGCGGCACCGTGCTCCGCCTAGCCAAGGACCTCGCGGAGAACAACCGCGGTGCTCGAGTCCTCGTCGTCTGTT CCGAGATCACTGCTGTCACCTTCCGTGGACCGTCAGAGTCTCATCTCGACAGTCTCGTAGGCCAGGCCTTGTTCGGTGAT GGCGCTGCCGCACTCATCGTAGGTTCTGATGCTATCGAGGGAATCGAGAGACCGATCTTCGAGATGGTCTCCGCTGCGCA AACGATACTCC
CCGATAGCGAAGGGGCGATCGACGGTCACCTTAGGGAAGTAGGCCTTACATTCCATCTGCTCAAGGATG TGCCCGGAATCATATCCAAGAACATCGAAAAGAGCCTCGAGGAGGCGTTCAAGCCGTTGGGGATCACCGATTATAACTCA CTGTTCTGGATTGCGCACCCGGGAGGACCGGCAATACTTGACCAGGTCGAGGCGAAGATAGGACTGAAACCAGAGAAGCT GAGAGCTACTAGGCATGTTCTCAGCGAATATGGCAACATGTCGAGCGCCTGCGTGCTGTTCATTCTCGAAGAAATGAGGA AAAAGTCGGCGGAGGAGAAGAACGGTACGACCGGAGAAGGTCTAGAGTGGGGGGTGCTCTTCGGGTTCGGGCCGGGGCTC ACGGTGGAGACAGTGGTGCTACACAGTGTTGAAGCTTAAGTAGCACTACAGTTTGCTATCTTCTTCATACTCATTGAGGA CTCCCTATATATCATTCCCA香雪蘭查爾酮合酶DNA序列長為1369bp，下劃線部分為外顯子序列，小寫字母部分為內(nèi)含子序列(129bp)。查爾酮合酶是植物體內(nèi)類黃酮和花色素合成途徑的第一個關(guān)鍵酶，本發(fā)明提供的香雪蘭查爾酮合成酶cDNA和DNA為基因工程改良植物體內(nèi)黃酮類化合物的合成提供了一種有效的技術(shù)手段，這在轉(zhuǎn)基因植物花卉的花色修飾和育性方面的研究具有極大的應(yīng)用價值。


圖1為FhCHS基因的cDNA和DNA電泳圖；其中M :DL 2000 ； 1 陰性對照；2 以RNA為模板擴(kuò)增得到的cDNA片段；3 以基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的DNA片段圖2為重組原核表達(dá)載體(pET-FhCHS)的酶切鑒定電泳圖；其中M :DL 2000 ；1 :pET_28a(+)質(zhì)粒；2-5 重組質(zhì)粒酶切(BamH I 和 Sac I 雙酶切)圖3為!^hCHS基因原核表達(dá)的SDS-PAGE蛋白電泳圖。其中M 蛋白分子量 Marker ；1 :BL21(DE3)(未加 IPTG 誘導(dǎo))；2 :pET_28a(+)空載體菌株(未加IPTG誘導(dǎo))；3 :PET-28a(+)空載體菌株(加IPTG誘導(dǎo))；4 :pET_FhCHS菌株 (未加IPTG誘導(dǎo))；5 :pET-FhCHS菌株(加IPTG誘導(dǎo))
具體實施例方式在下面的具體實施例中進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1 FhCHS基因cDNA的克隆UFhCHS基因3’序列的獲得利用本實驗室已建立的紅花香雪蘭花瓣cDNA文庫， 隨機(jī)挑選單克隆進(jìn)行測序，序列如SEQ ID NO. 1所示。根據(jù)測序得到的序列信息，進(jìn)行生物信息學(xué)分析(blast比對，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析等)，分析結(jié)果表明從cDNA文庫中篩選出的一條序列為I^hCHS基因3’序列。
2、FhCHS基因5’序列的獲得根據(jù)得到的!^hCHS基因3’序列信息，設(shè)計特異的下游引物，即 5，-CTC CGG TCG TAC CGT TCT TCT CCT-3，(SEQ ID NO. 6)。用 CTAB 法提取紅花香雪蘭花瓣的總RNA，隨后利用Clontech公司的RACE試劑盒(SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA的第一條鏈，以此作為模板，用RACE試劑盒提供的上游引物和特異的下游引物進(jìn)行5，RACE，得到!^hCHS基因5，序列，結(jié)果如SEQ ID NO. 2 所示。3、FhCHS基因全長cDNA序列的獲得拼接上述兩次測序得到的結(jié)果，得到了全長 cDNA序列的信息，以此設(shè)計特異的引物，即5，-GCA AGA AAA ATG GTG AAT G_3，(SEQ ID NO. 7)的上游引物和 5，-TGG GAA TGA TAT ATA GGG AGT C_3，(SEQ ID NO. 8)的下游引物。 以利用RACE試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA的第一條鏈作為模板，進(jìn)行PCR，得到!^hCHS基因全長 cDNA序列，結(jié)果如SEQ ID N0. 3所示。實施例2 FhCHS基因DNA的克隆用CTAB法提取紅花香雪蘭花瓣的基因組DNA，并以此為模板，以5，-GCA AGA AAA ATG GTGAAT G_3，(SEQ ID NO. 7)禾口 5，-TGG GAA TGA TAT ATA GGG AGT C_3，(SEQ ID NO. 8)為引物，進(jìn)行PCR，得到!^hCHS基因的DNA序列。Blastn比對顯示，該DNA序列與紅掌 (Anthuriumandraeanum)的查爾酮合酶基因同源性最高，達(dá)到80%。同時，比較!^hCHS基因的cDNA序列和DNA序列，發(fā)現(xiàn)在DNA序列中存在一個129bp的內(nèi)含子，并且該內(nèi)含子兩端的剪切位點符合GT-AG法則。結(jié)果如SEQ ID N0. 5所示。實施例3 FhCHS基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)為了表達(dá)!^hCHS蛋白，以克隆得到的!^hCHS基因全長cDNA作為模板，分別帶有 BamH I和McI酶切位點的引物進(jìn)行!^hCHS基因開放閱讀框的PCR擴(kuò)增。其中上游引物 5，-CGC GGA TCC GCAAGA AAA ATG GTG AAT G-3，(下劃線為 BamH I 酶切位點)(SEQ ID N0. 9)；下游引物 5，-TCC GAGCTC TGG GAA TGA TAT ATA GGG AGT C-3，(下劃線為 Sac I 酶切位點)(SEQ ID N0. 10)。利用BamH I和Mc I兩種限制性內(nèi)切酶消化上述擴(kuò)增得到的cDNA片段及pET-28a⑴質(zhì)粒，將酶切后的cDNA片段與pET_28a⑴質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET-FhCHS，利用雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所示。然后將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞中，培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化體，利用IPTG (Isopropyl β -D-1-Thiogalactopyranoside)誘導(dǎo)FhCHS蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。
權(quán)利要求
1.香雪蘭查爾酮合酶的cDNA，其特征如下 其中(1)香雪蘭查爾酮合酶cDNA 3’端序列為GAGGCGTTCMGCOGTTGGGGATCACOGATTATMCTCACTGTTCTGGATTGCGCACCOGGGAGGACOGGCMTACTTGA CCAGGTOGAGGCGMGATAGGACTGMACCAGAGMGCTGAGAGCTACTAGGCATGTTCTCAGCGMTATGGCMCATGT OGAGCGCCTGCGTGCTGTTCATTCTOGMGMATGAGGMMAGTOGGCGGAGGAGMGMOGGTAOGACOGGAGMGGT CTAGAGTGGGGGGTGCTCTTOGGGTTOGGGCOGGGGCTCAOGGTGGAGACAGTGGTGCTACACAGTGTTGMGCT TAA- GT Aa^ACTACAGTTTOTATCTTCTTCATACTCATTGAGGACTCCCTATATATCATTCCCATTACMTMCAGATTGGTGTT TCTCMGTTTGGCTTTGGCCTGTATCTTATGTTTMATMACTTACTTACTAGTGCTCMTATACAGATGATCATCATTT CTTTCTTCTGATGGAGAAGAATTTGATGATGACAGACAATAATTTCTAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTC 香雪蘭查爾酮合酶cDNA 3’端序列長為55;3bp，下劃線部分表示的是該序列的終止密碼子，終止密碼子以后的序列為3’端非編碼序列(3’ UTR)；其中(2) RACE法獲得香雪蘭查爾酮合酶cDNA 5，端序列(SEQ ID NO. 2)ACATGGGGATTCAMACATAGCMTACCACTTAGCTMCTMGMGGMACTCATOGCCAMACTCTCTTTTGTTGCMGAAAA ATG GTGMTGTGGAGGMATTOGCMGGCACAGAGGGCGGMGGCCOGGCOGCCATCTTGGCCATOGGCACOGCCACTCCCCCMATGCCATOGAGCAGAGCGAGTATCOGGACTACTACTTTOGAGTCACCMCAGCGAGGATMGGTOGMCTCMGGAGMGTTCMGCGCATGTGCGAMAGTOGATGATCMGMGAGGTACTTGTACCTMCOGAGGACATTCTCMGGAMATCOGMTGTCTGCGCGTACATGGCCACCTCCCTOGAOGCCOGTCAGGACATGGTCGTOGTTGAGGTTCOGMGCTOGGCMAGMGCTGCCAOGAGAGCCATCMGGMTGGGGGCAGCCCMGTOGMGATMCCCACCTTGTCTTCTGCACMOGAGCGGTGTOGACATGCCOGGGGCOGACTATCAGCTCACAMACTCCTOGGTCTCOGTCCCTOGGTCMGCGCCTCATGATGTACCAGCAGGGCTGCTTTGCGGGCGGCACOGTGCTCOGCCTAGCCMGGACCTOGCGGAGMCMCOGCGGTGCTOGAGTCCTOGTOGTCTGTTCOGAGATCACTGCTGTCACCTTCOGTGGACOGTCAGAGTCTCATCTOGACAGTCTOGTAGGCCAGGCCTTGTTOGGTGATGGCGCTGCOGCACTCATOGTAGGTTCTGATGCTATOGAGGGMTOGAGAGACOGATCTTOGAGATGGTCTCOGCTGCGCMAOGATACTCCCOGATAGCGMGGGGCGATOGAOGGCCACCTTAGGGMGTAGGCCTTACATTCCATCTGCTCMGGATGTGCCOGGMTCATATCCMGMCATOGAMAGAGCCTOGAGGAGGCGTTCMGCOGTTGGGGATCACOGATTATMCTCACTGTTCTGGATTGCGCACCOGGGAGGACOGGCMTACTTGACCAGGTOGAGGCGMGATAGGACTGMACCAGAGMGCTGAGAGCTACTAGGCATGTTCTCAGCGMTATGGCMCATGTOGAGCGCCTGCGTGCTGTTCATTCTCGAAGAAATGAGGAAAAAGTCGGCGGAGGAGAAGAACGGTACGACCGGAG香雪蘭查爾酮合酶cDNA 5’端序列長為1171bp，下劃線部分表示的是該序列的起始密碼子，起始密碼子以前的序列為5’端非編碼序列(5’ UTR)； 其中(3)香雪蘭查爾酮合酶全長cDNA序列(SEQ ID NO. 3)GCMGAMA 戲 GTGMTGTGGAGGMATTOGCMGGCACAGAGGGCGGMGGCCOGGCOGCCATCTTGGCCATOGGCAC OGCCACTCCCCCMATGCCATOGAGCAGAGCGAGTATCOGGACTACTACTTTOGAGTCACCMCAGCGAGGATMGGTOG MCTCMGGAGMGTTCMGCGCATGTGCGAMAGTOGATGATCMGMGAGGTACTTGTACCTMCOGAGGACATTCTC MGGAMATCOGMTGTCTGCGCGTACATGGCCACCTCCCTOGAOGCCOGTCAGGACATGGTOGTOGTTGAGGTTCOGM GCTOGGCMAGMGCTGCCAOGAGAGCCATCMGGMTGGGGGCAGCCCMGTOGMGATMCCCACCTTGTCTTCTGCA CMOGAGCGGTGTOGACATGCCOGGGGCOGACTATCAGCTCACAMACTCCTOGGTCTCOGTCCCTOGGTCMGCGCCTC ATGATGTACCAGCAGGGCTGCTTTGCGGGCGGCACOGTGCTCOGCCTAGCCMGGACCTOGCGGAGMCMCOGCGGTGC TOGAGTCCTOGTOGTCTGTTCOGAGATCACTGCTGTCACCTTCOGTGGACOGTCAGAGTCTCATCTOGACAGTCTOGTAG GCCAGGCCTTGTTOGGTGATGGCGCTGCOGCACTCATOGTAGGTTCTGATGCTATOGAGGGMTOGAGAGACOGATCTTCGAGATGGTCTCOGCTGCGCMAOGATACTCCCOGATAGCGMGGGGCGATOGAOGGTCACCTTAGGGMGTAGGCCTTAC ATTCCATCTGCTCMGGATGTGCCOGGMTCATATCCMGMCATOGAMAGAGCCTCGAGGAGGCGTTCMGCOGTTGG GGATCACOGATTATMCTCACTGTTCTGGATTGCGCACCOGGGAGGACOGGCMTACTTGACCAGGTOGAGGCGMGATA GGACTGMACCAGAGMGCTGAGAGCTACTAGGCATGTTCTCAGCGMTATGGCMCATGTOGAGCGCCTGCGTGCTGTT CATTCTOGMGMATGAGGMMAGTOGGCGGAGGAGMGMOGGTAOGACOGGAGMGGTCTAGAGTGGGGGGTGCTCT TCGGGTTCGGGCCGGGGCTCACGGTGGAGACAGTGGTGCTACACAGTGTTGAAGCT TAA GTAGCACTACAGTTTGCTATCTTCTTCATACTCATTGAGGACTCCCTATATATCATTCCCA香雪蘭查爾酮合酶全長cDNA序列長為IMObp，開放閱讀框架長1170bp，下劃線部分表示的是該序列的起始密碼子和終止密碼子；其中(4)由香雪蘭查爾酮合酶全長cDNA序列推測得到的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO. 4) MVNVEEIRKAQRAEGPMILAIGTATPPNAIEQSEYPDYYFRVTNSEDKVELKEKFKRMCEKSMIKKRYLYLTEDILKEN PNVCAYMATSLDARODMVWEVPKLGKEMTRAIKEWGOPKaamVFCTTSGVDMPGADYgLTKLLGLRPSVKRLMMY QQGCFAGGTVLRLAKDLAENNRGARVLWCSEITAVTFRGPSESffiDSLVGQALFGDGAMLIVGSDAIEGIERPIFEMV SMOTILPDSEGAIDGHLREVGLTFffiiiiDVPGnSKNIEKSLEEAFKPLGITDYNSLFWIAHPGGPAILDgVEAKIGLK PEKLRATRHVLSEYG匪SSACVLFILEEMRKKSAEEKNGTTGEGLEWGVLFGFGPGLTVETWLHSVEA 香雪蘭查爾酮合酶全長cDNA編碼的蛋白序列長389個氨基酸，推測蛋白質(zhì)的分子量是 42，581Da，等電點為 5. 74。
2.香雪蘭查爾酮合酶的DNA，其特征如下 香雪蘭查爾酮合酶DNA序列(SEQ ID NO. 5)GCMGMMATGGTGMTGTGGAGGMATTOGCMGGCACAGAGGGOGGMGGCCOGGCOGCCATCTTGGCCATOGGCAC OGCCACTCCCCCMATGCCATOGAGCAGAGOGAGTATCOGGACTACTACTTTOGAGTCACCMCAGOGAGGATMGGTOG AACTCAAGGAGAAGTTCAAGOGCATGTgtaagattaattatattaaaaaaatactacttcatatatgttggaatgtataa aaactataatttttattttgagttttggtgcaatggcagagactttaactgattatatatgtacgatgctatgtagGCGA MAGTOGATGATCMGMGAGGTACTTGTACCTMCOGAGGACATTCTCMGGAMATCOGMTGTCTGOGOGTACATGG CCACCTCCCTOGAOGCCOGTCAGGACATGGTOGTOGTTGAGGTTCOGMGCTOGGCMAGMGCTGCCAOGAGAGCCATC MGGMTGGGGGCAGCCCMGTOGMGATMCCCACCTTGTCTTCTGCACMOGAGOGGTGTOGACATGCCOGGGGCOGA CTATCAGCTCACAMACTCCTOGGTCTCOGTCCCTOGGTCMGOGCCTCATGATGTACCAGCAGGGCTGCTTTGOGGGOG GCACOGTGCTCOGCCTAGCCMGGACCTOGOGGAGMCMCOGOGGTGCTOGAGTCCTOGTOGTCTGTTCOGAGATCACT GCTGTCACCTTCOGTGGACOGTCAGAGTCTCATCTOGACAGTCTOGTAGGCCAGGCCTTGTTOGGTGATGGOGCTGCOGC ACTCATOGTAGGTTCTGATGCTATOGAGGGMTOGAGAGACOGATCTTOGAGATGGTCTCOGCTGOGCMAOGATACTCC COGATAGOGMGGGGOGATOGAOGGTCACCTTAGGGMGTAGGCCTTACATTCCATCTGCTCMGGATGTGCCOGGMTC ATATCCMGMCATOGAMAGAGCCTOGAGGAGGOGTTCMGCOGTTGGGGATCACOGATTATMCTCACTGTTCTGGAT TGOGCACCOGGGAGGACOGGCMTACTTGACCAGGTOGAGGOGMGATAGGACTGMACCAGAGMGCTGAGAGCTACTA GGCATGTTCTCAGOGMTATGGCMCATGTOGAGOGCCTGOGTGCTGTTCATTCTOGMGMATGAGGMMAGTOGGOG GAGGAGMGMOGGTAOGACOGGAGMGGTCTAGAGTGGGGGGTGCTCTTOGGGTTOGGGCOGGGGCTCAOGGTGGAGAC AGTGGTGCTACACAGTGTTGMGCTTMGTAGCACTACAGTTTGCTATCTTCTTCATACTCATTGAGGACTCCCTATATA TCATTCCCA香雪蘭查爾酮合酶DNA序列長為1369bp，下劃線部分為外顯子序列，小寫字母部分為內(nèi)含子序列(129bp)。全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從紅花香雪蘭花瓣中分離編碼查爾酮合酶(CHS)的cDNA及DNA。香雪蘭CHS基因(FhCHS)cDNA的核苷酸序列分析顯示FhCHS基因的cDNA序列全長為1240bp，其中開放閱讀框長1170bp，其編碼的蛋白序列長389個氨基酸，推測蛋白質(zhì)的分子量是42,581Da，等電點為5.74。FhCHS DNA序列分析顯示FhCHS DNA序列長1369bp，序列中包含長為129bp的內(nèi)含子，該內(nèi)含子兩端的剪切位點符合GT-AG法則。將所述的FhCHS cDNA在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)重組的CHS蛋白，經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測。為FhCHS基因的真核表達(dá)及功能鑒定提供了前提條件，這在轉(zhuǎn)基因植物花卉的花色修飾和育性方面的研究具有極大的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/52GK102174537SQ20101058743
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者王麗, 胡海燕 申請人:東北師范大學(xué)