專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種蝴蝶蘭查爾酮合酶基因,其編碼序列和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、分析化學(xué)以及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的査爾酮合酶(蝴蝶蘭査爾酮合酶5，chalconesynthase,EC.2.3.1.74，p力cM)的基因克隆，此克隆的序列分析結(jié)果，基因表達(dá)模式分析結(jié)果，轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)基因植株的獲得以及相應(yīng)的生理生化特性的鑒定。技術(shù)背景蝴蝶蘭作為一種重要的經(jīng)濟(jì)型花卉，其花卉品質(zhì)的優(yōu)劣直接關(guān)系到其觀賞價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值?；ɑ芷焚|(zhì)中尤為重要的是花色，隨著基因工程的發(fā)展，運(yùn)用分子生物學(xué)手段對(duì)花卉花色進(jìn)行遺傳改良成為研究熱點(diǎn)。植物花冠的顏色由色素種類(lèi)來(lái)決定，主要是黃酮類(lèi)色素。苯基苯乙烯酮合成酶，即查爾酮合酶(CHS,chalconesynthase,EC.2.3.1.74)，催化類(lèi)黃酮和花色素合成途徑的第一步反應(yīng)，是類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)生物合成途徑的限速酶。查爾酮合酶通常由植物中多基因家族編碼，査爾酮合酶能在花中特異性表達(dá)，它在植物中表達(dá)量的改變可能影響花的顏色。目前多采用反義RNA技術(shù)對(duì)花卉品質(zhì)進(jìn)行改良，荷蘭學(xué)者(1988)首先從矮牽牛中分離出CHS的cDNA，利用反義RNA技術(shù)，轉(zhuǎn)化矮牽?；ê螳@得轉(zhuǎn)基因植株?；ㄉ珡脑瓉?lái)的紫色變成粉紅色并有白色，有些植株花全呈白色，這樣矮牽?；ㄉ龆?，觀賞價(jià)值得以提高(Elomaa等，1993)。Johzuka-Hisatomi等(1999)也從(牽牛)morningglories中分離出查爾酮合酶基因，并以反義和正義方向?qū)肫渲?開(kāi)粉紅色花)品種，得到開(kāi)白花與淡粉色的轉(zhuǎn)基因植株。以后相繼報(bào)道了從多種植物中克隆了與花青素代謝有關(guān)的査爾酮合酶基因，并將它轉(zhuǎn)入矮牽牛，獲得的轉(zhuǎn)基因矮牽?；ㄉl(fā)生了改變，出現(xiàn)了自然界沒(méi)有的變異(Ryutaro等，2000a，200b)。本發(fā)明研究了一種從蝴蝶蘭中克隆催化生成査爾酮的査爾酮合酶(P力cAs5)，轉(zhuǎn)入矮牽牛后改變花色素苷含量的技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)對(duì)于改良蝴蝶蘭以及蘭科植物的花色品質(zhì)、增加其品種的多樣性具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種從蝴蝶蘭中克隆催化生成査爾酮的查爾酮合酶基因，其編碼序列和應(yīng)用。本發(fā)明的一方面提供了一種新的蝴蝶蘭基因P力cAs5，該基因是一個(gè)查爾酮合酶基因。p/c力s5包含1185bp的開(kāi)放閱讀框和一個(gè)159bp的內(nèi)含子(GeneBankaccessionnumber:DQ089652),其核酸序列為SEQIDNO.1所示。本發(fā)明的另一方面提供上述查爾酮合酶基因的蛋白質(zhì)分子，該蛋白質(zhì)分子具有SEQIDNO.2所示的氨基酸編碼序列。本發(fā)明還提供了用于調(diào)取獲得蝴蝶蘭樣品中査爾酮合酶基因的核苷酸引物序列，為根據(jù)上述査爾酮合酶基因家族保守區(qū)域設(shè)計(jì)的兼并引物，及用于進(jìn)一步擴(kuò)增Phchs5基因上下游序列的反式PCR引物，引物序列如SEQIDN0.3所示。本發(fā)明還提供一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有蝴蝶蘭査爾酮合酶活性的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入矮牽牛以改變花色素含量的方法，其步驟如下(1)將蝴蝶蘭p力Ws5基因的開(kāi)放讀框連于植物表達(dá)調(diào)控序列，形成含有蝴蝶蘭p力c力s5基因的植物表達(dá)載體；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌同矮牽牛葉片共培養(yǎng)，在22土2。C條件下，暗培養(yǎng)3天后，通過(guò)抗生素篩選，植物組織再生，獲得蝴蝶蘭p力c力s5基因的轉(zhuǎn)基因植株。含有蝴蝶蘭；^cA^基因的轉(zhuǎn)基因植株的花色發(fā)生改變，花色素苷含量發(fā)生變化。本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)樣品中蝴蝶蘭查爾酮合酶基因拷貝數(shù)的方法，其步驟為首先提取蝴蝶蘭的基因組DNA。然后利用Dral和HindIII酶切。酶切后的DNA片段轉(zhuǎn)膜并與前面所述核苷酸序列SEQIDNO.l進(jìn)行Southern雜交，然后檢測(cè)目的片段的有無(wú)。在本發(fā)明中，還提供了一種對(duì)p力c力s5進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、進(jìn)化分析的方法，其步驟如下運(yùn)用ClustalXverl.8(Thompson等，1994)進(jìn)行序列的同源性比較。MEGA2(Kumar等，2001)用于進(jìn)化樹(shù)[鄰接法(Saitou和Nei，1987)]的構(gòu)建，同時(shí)用于估計(jì)同義突變頻率和反義突變頻率(Nei和Gojobori，1986)。以RRTree軟件(Robinson—Rechavii和Huchon，2000)進(jìn)行相對(duì)速率檢驗(yàn)(見(jiàn)圖2)。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)p力cA5mRNA表達(dá)模式的方法，其步驟如下(1)提取蝴蝶蘭根、葉以及處于不同發(fā)育階段的的各花器官的總RNA(Trizol，市售)。(2)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后根據(jù)/^cAs5的開(kāi)放讀框的第706-720，950-965的特異序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"蝴蝶蘭/^c力W基因的開(kāi)放閱讀框"指編碼完整的蝴蝶蘭蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO.1中第1-1855位的核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQIDNO.1中第1-1855位的核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQIDNO.1中第1-1855位的核苷酸序列同源性低至約85%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQIDNO.2所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更加的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO.l中從核苷酸第1-1855位的核苷酸序列的同源性至少85%,較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的蝴蝶蘭/^c力s5基因相同功能的蛋白的SEQIDNO.1中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限于)若干個(gè)(通常為1一90個(gè)，較佳地1一60個(gè)，更佳地1—20個(gè)，最佳地1一10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為IO個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。本發(fā)明的蝴蝶蘭P力c力^5蛋白的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的蝴蝶蘭cDNA或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的蝴蝶蘭cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得相關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行分步PCR擴(kuò)增，然后將各次擴(kuò)增出的片斷按正確次序拼接在一起。一旦獲得了目標(biāo)序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得本發(fā)明中的p力cAs5基因序列。這通常是將其克隆入載體，在轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離到有關(guān)序列。表1為本發(fā)明的蝴蝶蘭P力cAs5與其他植物CHS的氨基酸含量相似度比較表。表2為轉(zhuǎn)基因矮牽牛的花色素苷和類(lèi)黃酮含量WT為野生型矮牽牛；EV為轉(zhuǎn)空載體的矮牽牛；Pl，P2，P3為正向轉(zhuǎn)入外源p力cA^的矮牽牛植株，每一樣品平行測(cè)定2-3次。圖1為蝴蝶蘭p力c/s5基因的Southernblot鑒定lane1Dral酶切，lane2為HindIII酶切。圖示結(jié)果說(shuō)明基因?yàn)槎嗫截?。圖2鄰接法進(jìn)行蝴蝶蘭和其它蘭科植物CHS基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析。圖3為RT-PCR鑒定/^c/^5^表達(dá)模式。1-5分別代表花發(fā)育的不同階段。T表示花被，P表示花瓣，L表示唇瓣。yel，wht，mau分別代表黃花紅唇，白花黃唇，紫紅品種三個(gè)品系。在紫紅品種的花被中，phchs5從階段l就有表達(dá)；而在"黃花紅唇"品系中，到階段3才能檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄物。白花品種出現(xiàn)表達(dá)的時(shí)間更晚。圖4為轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定EV為轉(zhuǎn)空載載體的矮牽牛；Pl，P2，P3為正向轉(zhuǎn)入外源；力c力s5的矮牽牛植株。圖5野生型較轉(zhuǎn)基因植表型對(duì)比Pl，P2，P3為正向轉(zhuǎn)入外源p力c力s5的矮牽牛植株。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborUbortaryPress,1989)中所敘述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1蝴蝶蘭p力c/s5基因的克隆1.將室溫(25°C)生長(zhǎng)的蝴蝶蘭花苞液氮中冷凍保存，應(yīng)該注意到本實(shí)驗(yàn)所選取的材料與選用的蝴蝶蘭品種沒(méi)有必然的聯(lián)系。2.DNA的提取。取部分組織，用研缽研碎，加入盛有預(yù)熱的裂解液的50ml離心管，65。C保溫40min，離心。上清中加入RNaseA(0.5ixg/ml)，65。C消化RNAlh;以等體積的酚/氯仿/異戊醇(25/24/l)抽一次蛋白，以乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌兩遍，最后用TE溶液溶解DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA的質(zhì)量。3.全長(zhǎng)基因的克隆。根據(jù)其他植物CHS同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物/^c/s5—F和/7力c力W一R，采用RT-PCR方法從蝴蝶蘭cDNA中擴(kuò)增出一條800bp左右的條帶。根據(jù)該800bp序列設(shè)計(jì)反式PCR引物5IN1-F，5IN1-R;5IN2-F，5IN2-R;5IN3-F，5IN3-R分別用于反式PCR的第一輪到第三輪擴(kuò)增。以BglII和HindIII酶切且環(huán)化的DNA片段為模板，進(jìn)行反式PCR，以便克隆該片段的上游和下游側(cè)翼序列。經(jīng)過(guò)三輪巢式反應(yīng)，序列拼接，得到全長(zhǎng)為1855bp的基因。將PCR產(chǎn)物回收，連接到T-載體上，用SP6和T7做為通用引物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)，BLAST結(jié)果表明該序列和其他物種中相應(yīng)的查爾酮合酶序列高度保守。上述各引物序列見(jiàn)SEQIDNO.3。實(shí)施例2蝴蝶蘭p力c力W基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的蝴蝶蘭P力c力s5基因的長(zhǎng)度為1855bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQIDNO.1。該基因編碼的多肽由384個(gè)氨基酸殘基組成。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQIDNO.2。將蝴蝶蘭p力c/^5全長(zhǎng)基因的編碼區(qū)序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列用BLAST程序再Non—redundantGeneBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non—redundantGeneBankCDStranslations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上，它與其他植物的CHS基因存在很高的相似度(表l)。BLAST的結(jié)果表明從蝴蝶蘭中得到的基因可能為査爾酮合酶基因。已知的査爾酮合酶基因催化一分子的香豆酰CoA(CoumarylCoA)與三分子的丙二酰CoA(malonylCoA)縮合生成4，5，7三羥基黃烷酮(narigeninchalcone)(ControlofPlantGeneExpression.61993.)，可知此基因具有相同的功能。實(shí)施例3蝴蝶蘭p力c/^基因的拷貝數(shù)分析以CTAB方法大量抽提蝴蝶蘭基因組DNA，取10ugDNA分別用Dral和HindIII酶切，以0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行片段分離，將DNA轉(zhuǎn)到Hybond—N+尼龍膜上，固定；以蝴蝶蘭p力cAs5基因?yàn)樘结樳M(jìn)行Southern雜交，鑒定它在蝴蝶蘭中的拷貝數(shù)，結(jié)果表明，/力c力s基因是四到五個(gè)拷貝組成的多基因家族(見(jiàn)圖l)。實(shí)施例4蝴蝶蘭CHS序列置于來(lái)自蘭科和其它科屬的CHS基因的進(jìn)化分析數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得包括新的p力cAs5基因在內(nèi)的5個(gè)蝴蝶蘭CHS序列和來(lái)自幾個(gè)科、的CHS超家族成員序列。以鄰接法推斷蝴蝶蘭CHS基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，蝴蝶蘭CHS序列分布在較遙遠(yuǎn)的兩個(gè)支系中。所有鑒定的蘭科CHS基因形成兩個(gè)亞家族(見(jiàn)圖2)。以RRTree軟件(Robinson—Rechavii和Huchon，2000)進(jìn)行相對(duì)速率檢驗(yàn)。蝴蝶蘭phchsl，2，3，4亞家族的進(jìn)化速率是phchs5的1.5倍。序列分歧的時(shí)間用K/2r估計(jì)(K指突變頻率；r指序列的平均置換速率)。估計(jì)兩個(gè)CHS分支分歧發(fā)生在31500000年前。實(shí)施例5蝴蝶蘭p力c力s5表達(dá)模式分析用RT—PCR的方法檢測(cè)，提取不同品種蝴蝶蘭根、葉以及處于不同發(fā)育階段的的各花器官的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，然后根據(jù)p/cAs5的開(kāi)放讀框的第706-720，950-965的特異序列設(shè)計(jì)引物獲得DNA分子探針。結(jié)果表明該基因僅在花瓣和唇瓣中表達(dá)(唇瓣是花瓣的變形)。/7力cA5在花瓣中大量表達(dá)，其表達(dá)水平曲線與花色素合成速率的曲線明顯一致。比較p^力s5在蝴蝶蘭不同花色品種的花器官中的表達(dá)，其表達(dá)水平明顯與花色素在花器官中的積累水平一致。P力c力s5應(yīng)該是負(fù)責(zé)蝴蝶蘭花瓣中花色素合成的基因。對(duì)/^C力55兩個(gè)外顯子分別檢測(cè)，表明P力c/^5基因在各品系中都是是全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄的(見(jiàn)圖3)。實(shí)施例6蝴蝶蘭p/c力s5基因在矮牽牛中進(jìn)行真核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定1.含目的基因(蝴蝶蘭p/c力W基因)表達(dá)載體的構(gòu)建。擴(kuò)增出完整的編碼閱讀框.并在正反向引物上分別引入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將蝴蝶蘭p/7C力55基因正向克隆到雙元表達(dá)載體pCAMBIA2301中，在保證閱讀框架的前提下，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。利用葉圓盤(pán)法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物矮牽牛。2.利用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化矮牽牛農(nóng)桿菌培養(yǎng)1)挑取菌落，lml農(nóng)桿菌培養(yǎng)基搖菌，200rpm，28°C。2)50ml培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，過(guò)夜。3)將上述菌落離心，3700rpm，6min;以3mlMS0重懸，每150mlMS0中加lml重懸液，200rpm，培養(yǎng)7h。矮牽牛轉(zhuǎn)化1)矮牽牛葉片切成0.8X0.8cm(lcm)方塊，放進(jìn)含農(nóng)桿菌的MSO液中，190rpm搖床，lOmin。2)取出葉片用濾紙吸干多余濾液(不能太干)。3)吸干葉片放在加蓋一層濾紙的MS1上，封口膜封好，22'C暗培養(yǎng)。材料培養(yǎng)3d,按以下步驟洗菌1)無(wú)菌水15minx2;2)無(wú)菌水+Cef50015minx2;3)MS0+Cef50020minx2;4)吸水紙吸干多余水分，轉(zhuǎn)移至MS2(葉片背面朝下)；5)25°C，16h光照培養(yǎng)715d，愈傷組織形成，20d分化芽；6)轉(zhuǎn)生根培養(yǎng)基，27d生根i昔養(yǎng)基。分子鑒定以CTAB方法小量抽提經(jīng)部分轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以轉(zhuǎn)pCAMBIA2301空載體的矮牽牛作為負(fù)對(duì)照，根據(jù)蝴蝶蘭；^c力s5基因和選擇標(biāo)記NPTII基因的特異序列分別設(shè)計(jì)引物CHS-XF和CHS-XR，進(jìn)行PCR(引物序列見(jiàn)SEQIDNO.3)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)化率高于50%(見(jiàn)圖4)。表型鑒定總共得到26棵轉(zhuǎn)基因植株，共有18個(gè)株系開(kāi)花共73朵。通過(guò)表型鑒定發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因矮牽牛的花均有花色變淡的現(xiàn)象，個(gè)別個(gè)體的花發(fā)育出現(xiàn)畸形。推測(cè)外源CHS5基因在宿主矮牽牛中實(shí)現(xiàn)了超量表達(dá)的同時(shí)，發(fā)生共抑制減少內(nèi)源矮牽牛中花色素苷和類(lèi)黃酮的含量。較野生型表型對(duì)比見(jiàn)圖5。試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例1中得到的蝴蝶蘭p力c力s5基因?yàn)橛泄δ艿幕颍梢杂糜诶棉D(zhuǎn)基因技術(shù)改良蝴蝶蘭花色的研究和產(chǎn)業(yè)化中。具體生理數(shù)據(jù)參見(jiàn)表2。8表lcAs基因家族氨基酸含量相似度分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>WT為野生型矮牽牛；EV為轉(zhuǎn)空載體的矮牽牛；Pl,P2，P3為正向轉(zhuǎn)入外源p/c力s5的矮牽牛植株序列表1.SEQIDNO.1的信息(i)序列特征長(zhǎng)1855bp，線性單鏈核苷酸(ii)分子類(lèi)型核酸(iii)序列及序列標(biāo)記-30AGCTTGTGAGAGACGACGGAGAGGGAGTTAATGGCGCCGGCGATGGAGGAGATCAGGCGA30GCTCAGAGAGCGGAGGGCCCGGCGGCGGTGCTCGCAATCGGCACCTCCACGCCGCCGAAC90GCTGTGTATCAAGCCGATTATCCCGATTATTACTTCAGAATCACCMCTGCGAGCATCTC150ACTGACCTCMGGAGAAGTTCMGCGAAT6T(5TA4ftT7^fi4C&UUUUU4C6T7T270^7T7T7T釘Cfc47T釘7K46^7TJ7KUUU4ir力7777777T330T55T7T7^6GCGAGAAATCCATGATAAAAAAACGGTACATGTATCTAACAGAAGMTTC390CTGAAAGAAMTCCCAATATCTGCGCATTCATGGCTCCTTCACTCGACGCTAGGCMGAC450ATAGTTGTCGCCGMGTCCCAMGCTCGCCAAAGAGGCCGCCGCGCGCGCCATCAAGGM510TGGGGACACCCCAMTCACGCATAACTCATCTCATCTTCTGCACCACCAGCGGCGTCGAC,5IN3-R570ATGCCCGGCGCCGACTACCMCTCACCCGCCTCCTCGGTCTCCGCCCCTCCGTC八ACCGA、IN2-R'5IN1-R630TTCATGCTCTACCAGCAGGGCTGCTTCGCCGGCGGCACCGTCCTCCGCCTCGCCAAGGAT690CTCGCCGAGMCAACGCTGGCGCCCGCGTGCTCGTCGTTTGCTCCGAAATCACCGCCGTC750ACTTTCCGTGGCCCGTCGGMTCCCATCTTGATTCCCTCGTTGGACAGGCGCTCTTCGGC810GACGGAGCCGCCGCTATCATTGTCGGATCCGATCCTGATTTAGCCACTGAGCGCCCTCTG870TTTCMCTAGTCTCTGCTTCCCAAACCATCCTTCCCGAATCAGAGGGCGCCATCGATGGC930CACCTTCGTGAAATCGGACTCACCTTCCACCTACTCMGGACGTCCCCGGCCTTATTTCT990AAAAACATTCAAAMTGTCTCCTTGAGGCCTTCMGCCACTCGGTGTGCTTGATTGGAAC5IN1-F一1050TCAATTTTTTGGATCGCCCACCCGGGCGGCCCGGCTATACTCGATCAAGTTGAGACCAAG1110CTCGGTCTGMGTCCGAGAAGCTCGCCGCGAGTAGAMTGTGCTCGCTGAGTACGGTAAC5IN2-F:1.170ATGTCGAGCGCATGCGTTCTTTTCATACTCGATGAGATGCGGAGGCGATCAGCAGAGGCC1230GGGCAGTCGACCACTGGCGAGGGTTTGGAGTGGGGAGTTCTATTTGGGTTCGGTCCGGGA5IN3-F1290CTTACGGTCGAGGCTGTTGTATTACGTAGCGTTCCAATTGGTGGCACCGAGTAAATGGGA1350CTGAGGAGTTAGGGTTTGATATTTTGTGGTTTTATTGGACTTGTTTGTGGTTAATTTGAA1410GGATTAGGGCCATATMGGGCTTGAGTTGGGTGGAGTTTTGAAGGGTGGCAGAGGTAAAA■1470AAAGAMAAGGGATGTTTATCMTTTGATGTTMAAGGTAATACTTTTTTCTTTTTGTGTPAsite1530TATCTACATGGCTATATTTGTAATMAAGMAGTTCTTATGAAAGTATTTATGACTTGGT1590TTGATGCAAMCATGTTTGAAATTATTTTTATTTATATGATTTTGCACTTATTAAAGAGA1650AACTAGCTATCTAAATGTGATGMTTTTATAACTTAMATMTG嵐TATTGTTATGCAA1710AATCAMAATTTAGGCGATATAMCATAMAAGCTAMCTTAATTTGTTAGATATGAAAA1770TACCTAGAAATCGMTGTTACCAGATATTCTTGATTGACTCCCCATGGCTTCCT注核苷酸序列位點(diǎn)在左側(cè)加以標(biāo)識(shí)，翻譯起始位點(diǎn)定為+1。(1)翻譯起始密碼ATG和中止密碼UAA加下劃線標(biāo)識(shí)。多聚腺苷酸位點(diǎn)(PAsite)以黑體標(biāo)識(shí)并在上方加以注釋。內(nèi)含子區(qū)域呈斜體。(2)查爾酮合酶活性位點(diǎn)以黑體標(biāo)識(shí)。它們是T132'S133，M135,C164，E192，T194，T197，F(xiàn)215'1255，G257,H304，N337,P376等(Ferreretal.，1999)。CHS家族標(biāo)簽(GVLFGFGPGLT)加下劃線標(biāo)識(shí)。5IN1-R,5IN2-R,5IN3-R,5IN1-F,5IN2-F,5IN3-F指反式PCR中用到的巢式引物(F-正向；R-反向)。2.SEQIDNO.2的信息(i)序列特征長(zhǎng)為384殘基的單鏈線性多肽(ii)分子類(lèi)型多肽(iii)序列及序列標(biāo)記AQRAEGPAAVLAIGTSTPPNAVYQADYPDYYFRITNCEHLTDLKEKFKRM51CEKSMIKKRYMYLTEEFLKENPNICAFMAPSLDARQDIVVAEVPKLAKEA101AARAIKEWGHPKSRITHLIFCTTSGVDMPGADYQLTRLLGLRPSVNRFML151YQQGCFAGGTVLRLAKDLAENNAGARVLVVCSEITAVTFRGPSESHLDSL201VGQALFGDGAAAIIVGSDPDLATERPLFQLVSASQTILPESEGAIDGHLR251EIGLTFHLLKDVPGLISKNIQKCLLEAFKPLGVLDWNSIFWIAHPGGPAI301L叫VETKLGLKSEKLAASRNVLAEYG醒SSACVLFILDEMRRRSAEAGQS351TTGEGLEWGVLFGFGPGLTVEAVVLRSVPIGGTE3.SEQIDNO.3的信息引物序列備注Wjc/w5—F5'CCKTCHYTGGAYGCNMGRCARGAC3'簡(jiǎn)并引物用于RT-PCR/Vicfo5—R5'GGBCCRAANARMACACC3'5IN1-F5'GCCACTCGGTGTGCTTGATTG3'用于反式PCR第一輪擴(kuò)增5IN1-R5'GTTGACGGAGGGGCGGAGA3'5IN2-F5'GAGTAGAAATGTGCTCGCTGA3'用于反式PCR第二輪擴(kuò)增5IN2-R5'CGGGTGAGTTGGTAGTCGG3';5IN3-F5'GGCGAGGGTTTGGAGT3'用于反式PCR第三輪擴(kuò)增5IN3-R5'TGAGTTATGCGTGATTTGG3'4SEQIDNO.4:CHS-XF:5，GCTCTAGAGGAGAGGGAGTTAATGGC3'CHS-XR:5，GCATTTTGTGGTTTTATTGGACT3，(上海生工合成)權(quán)利要求1.一種分離出的查爾酮合酶基因，其特征在于為一種特定序列的DNA分子，長(zhǎng)1855bp，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.—種如權(quán)利要求l所述的査爾酮合酶基因的蛋白質(zhì)分子，其特征在于具有SEQIDN0.2所示的氨基酸編碼序列。3.用于調(diào)取獲得蝴蝶蘭樣品中査爾酮合酶基因的核苷酸引物序列，其特征在于為如權(quán)利要求1所述査爾酮合酶基因的家族保守區(qū)域設(shè)計(jì)的兼并引物，及用于進(jìn)一步擴(kuò)增phchs5基因上下游序列的反式PCR引物，這些引物序列如SEQIDNO.3所示。4.一種將如權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭査爾酮合酶基因的核苷酸編碼序列SEQIDNO.l轉(zhuǎn)入矮牽牛，并改變其花色素苷含量的方法，具體步驟為；(1)將編碼具有蝴蝶蘭查爾酮合酶基因的開(kāi)放讀框可操作的連接于植物表達(dá)載體；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌與矮牽牛葉片共培養(yǎng)；(3)通過(guò)篩選，PCR鑒定，獲得再生轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植物的花色發(fā)生改變，花色素苷含量變化。5.—種用于檢測(cè)樣品中蝴蝶蘭查爾酮合酶基因拷貝數(shù)的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述査爾酮合酶基因核苷酸序列SEQIDNO.1對(duì)蝴蝶蘭基因組DNA樣品進(jìn)行southern雜交，然后檢測(cè)目的片段的有無(wú)；樣品為蝴蝶蘭的基因組DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的核苷酸片段。6.—種用于檢測(cè)樣品中是否存在如權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭査爾酮合酶基因的核苷酸序列SEQIDNO.1的方法，其特征在于使用SEQIDNO.4的核苷酸序列對(duì)轉(zhuǎn)基因樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后檢測(cè)目的片段有無(wú)，樣品為轉(zhuǎn)基因矮牽牛基因組DNA。全文摘要本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的查爾酮合酶(phchs5)的編碼序列，包含此基因序列的重組表達(dá)載體，及應(yīng)用此載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。應(yīng)用本發(fā)明所涉及基因并在植物中轉(zhuǎn)化表達(dá)，可對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的花色起到明顯的改變作用。文檔編號(hào)C12N9/00GK101260406SQ20071004651公開(kāi)日2008年9月10日申請(qǐng)日期2007年9月27日優(yōu)先權(quán)日2007年9月27日發(fā)明者劉啟昆,鳳明,李霄競(jìng),石金磊,韓穎穎申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)