專利名稱：一株對(duì)芘具有降解功能的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株對(duì)芘具有降解功能的菌株。
背景技術(shù)：
^1^77 (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)
以上苯環(huán)，以線狀、角狀或簇狀排列的稠環(huán)型化合物，具有疏水性、低溶解度、低蒸汽壓、高熔點(diǎn)和沸點(diǎn)、辛醇-水分配系數(shù)高等特性。多環(huán)芳烴類化合物具有強(qiáng)烈的致癌作用、致畸作用和致突變作用，一般來(lái)說(shuō)，2 3環(huán)的低分子量PAHs具有顯著的急性毒性，而某些高分子量的PAHs具有潛在的致癌性。由于PAHs分子中存在共軛大π鍵電子體系，因此具有較高的穩(wěn)定性，其光解作用和生物降解作用緩慢，能夠通過(guò)各種環(huán)境介質(zhì)長(zhǎng)距離遷移并長(zhǎng)期存在于環(huán)境中，通過(guò)環(huán)境蓄積、生物蓄積、生物轉(zhuǎn)化或化學(xué)反應(yīng)等方式損害健康和環(huán)境，已引起各國(guó)環(huán)境科學(xué)家的高度重視。美國(guó)環(huán)保局早在80年代就已把16種未帶分支的PAHs確定為環(huán)境中的優(yōu)先污染物，我國(guó)也把PAHs列入環(huán)境污染的黑名單中。生物降解是實(shí)現(xiàn)恢復(fù)PAHs污染環(huán)境的最有效手段之一，常見(jiàn)的具有降解PAHs功能微生物有假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、拜葉林克氏菌屬(Bei jernckia)、棒狀桿菌屬(Corynebaeterium)、藍(lán)細(xì)菌 (Cyanobacteria)、微球菌屬(Micrococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)禾口弧菌屬(Vibrio)寸。然而由于缺少高效的多環(huán)芳烴降解菌，制約了多環(huán)芳烴污染土壤生物修復(fù)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。因此，需要從污染的環(huán)境中馴化篩選出對(duì)多環(huán)芳烴降解速率較快的微生物菌種，然后再把它們應(yīng)用于實(shí)際PAHs污染環(huán)境的生物治理，這對(duì)于治理和修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一株對(duì)芘具有降解功能的菌株。所用菌株經(jīng)鑒定為 Stenotrophomonasacidaminiphila, 2010年3月23日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，該中心位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為 CGMCC3683。將該菌株制成含菌量為1. 25X 108CFU/ml的菌懸液，可用于環(huán)境中芘的降解。從污染土壤中分離純化所述芘降解菌的步驟如下(1)選取受石油污染的土壤，將其通過(guò)直徑為2mm的網(wǎng)篩后立即放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)向體積為IOOOmL的開口玻璃瓶中加入25 30mL濃度為lg/L的芘的丙酮混合溶液，為除去丙酮將玻璃瓶開口放置2天。(3)向步驟O)中開口玻璃瓶中加入500 600mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下攪拌40 50min后加入步驟(1)中的土壤250g ；然后置于溫度為25 30°C的環(huán)境中在轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下攪拌富集馴化培養(yǎng)30d，在培養(yǎng)期間定期向玻璃瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基以維持玻璃瓶中泥漿系統(tǒng)的水土比例保持不變；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為 NH4Cl :1. 5g · ΙΛ KH2PO4 :1. 5g · Λ MgCl2 :0. 25g · Λ CaCl2 · 2Η20 :0. IOg · Γ1。(4)向體積為100 200mL的錐形瓶中加入IOmL濃度為lg/L的芘的丙酮混合溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天。(5)向步驟中的錐形瓶中入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0. 5mL微量金屬液和0. ImL維生素 c 溶液；其中微量金屬液的組成為=CoCl2 · 6H20 :35mg · L-1，CuCl2 :0. 20mg · L-1，H3BO3 6. Omg · ΙΛ MnCl2 · 4H20 :25mg ·廠1，Na2MoO4 · 2H20 :3. Omg · Λ NiCl2 · 2H20 :2. Omg · Λ ZnCl2 :2. 5mg · L-1。(6)向步驟(5)中的錐形瓶?jī)?nèi)接入步驟(3)馴化的土壤0.25g，然后置于溫度為 25 30°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天，每天打開瓶口一次以恢復(fù)錐形瓶?jī)?nèi)的溶解氧；按接種體積比為200 250 1的比例轉(zhuǎn)入另一按步驟(4)至( 處理后的錐形瓶?jī)?nèi)，當(dāng)轉(zhuǎn)接次數(shù)大于8之后即可獲得高效去除芘的好氧降解菌群。(7)向體積為500mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入400mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1. OmL微量金屬液、0. ImL 維生素c溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用。(8)向體積為150mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入50mL按步驟(7)配制的液體培養(yǎng)基和0. 60g 瓊脂，然后在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65 70°C時(shí)，在超凈工作臺(tái)中將其倒入體積為160mL的培養(yǎng)皿中，為除去培養(yǎng)基表面多余的水分將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天。(9)在超凈工作臺(tái)中向步驟⑶中的培養(yǎng)皿中加入0. 5mL濃度為lg/L的芘丙酮溶液，來(lái)回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使芘的丙酮溶液均勻分布，為除去培養(yǎng)基表面的丙酮將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天。(10)向體積為25mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入IOmL按步驟(7)配制的液體培養(yǎng)基和0. 25g 瓊脂，在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在超凈工作臺(tái)中冷卻至38 40°C。(11)在超凈工作臺(tái)中向步驟(10)的錐形瓶中加入ImL步驟(6)得到的芘好氧降解菌群溶液，搖勻后吸取ImL慢慢加入步驟(9)中的培養(yǎng)皿中，來(lái)回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使接種有混合菌群的培養(yǎng)基溶液均勻分布。將培養(yǎng)皿放入溫度為25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，10 15天后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn)。(12)在超凈工作臺(tái)中挑取步驟(11)培養(yǎng)皿中的菌落，進(jìn)行重復(fù)分離，分離純化8 個(gè)周期以上即可得到能夠高效降解芘的純菌種。運(yùn)用上述方法能夠分離純化到對(duì)芘降解性能好的微生物菌種。
具體實(shí)施例方式向加入芘和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的開口玻璃瓶?jī)?nèi)加入受石油污染的土壤進(jìn)行芘降解微生物的富集與馴化，30d后向加入芘、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶?jī)?nèi)接入富集馴化的土壤。在溫度為25 30°C、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)5 7 天后，進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到高效去除芘的降解菌群。在超凈工作臺(tái)中制作以芘為唯一碳源和能源的瓊脂固體培養(yǎng)基底層平板，在底層平板上制作含有芘降解菌群的瓊脂固體培養(yǎng)基頂層平板，將制作好的培養(yǎng)基平板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 15天。 在超凈工作臺(tái)中向加入芘、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶?jī)?nèi)接入培養(yǎng)基平板中的菌落，在溫度為25 30°C、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天。 然后進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到能夠降解芘的純菌種。
運(yùn)用分離純化得至Ij的降解芘的菌種Stenotrophomonas acidaminiphila. 制成菌懸液，含菌量為1. 25 X 108CFU/ml，進(jìn)行降解芘的降解試驗(yàn)。結(jié)果表明菌株 Stenotrophomonasacidaminiphila.能夠?qū)胚M(jìn)行有效的降解，當(dāng)芘的初始濃度為 0. 13mg/L,0. 29mg/L、0. 58mg/L、l. 21mg/L 時(shí)，7 天后的降解去除率分別為96. 31 92. 55%,90. 17%,88. 48%。
權(quán)利要求
1. 一株對(duì)芘具有降解功能的菌株，其特征在于，所述菌株經(jīng)鑒定為 Stenotrophomonasacidaminiphila，菌禾中保藏號(hào)為 CGMCC3683。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一株對(duì)芘具有降解功能的菌株。芘降解菌經(jīng)鑒定為Stenotrophomonas acidaminiphila，菌種保藏號(hào)為CGMCC3683。將該菌株制成含菌量為1.25×108CFU/ml的菌懸液，對(duì)初始濃度分別為0.13mg/L、0.29mg/L、0.58mg/L、1.21mg/L的芘在7天后的降解去除率分別為96.31％、92.55％、90.17％、88.48％。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102559496SQ20101058491
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者丁愛(ài)中, 李帥冉, 杜勇超, 程莉蓉, 范福強(qiáng), 豆俊峰 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)