專利名稱：一種提高米根霉產(chǎn)酸能力的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種提高米根霉(lihizopus oryzae)產(chǎn)酸能力的方法，特別是一種通 過降低無機離子的濃度來調節(jié)R. oryzae菌體菌落形態(tài)，從而提高產(chǎn)酸的方法，屬于發(fā)酵工 程領域。
背景技術：
R. oryzae在分類上屬于毛霉目，根霉屬；廣泛運用于有機酸、酶、抗體、低膽固醇 的生產(chǎn)過程中。R. oryzae在深層發(fā)酵過程中主要呈現(xiàn)三種菌落形態(tài)絲狀、團狀及顆粒狀。 由于R. oryzae菌絲體之間的引力作用，菌絲間相互纏繞，最終菌落形態(tài)由絲狀變成團狀。 而團狀的R. oryzae在發(fā)酵過程中，影響物質和氧的傳遞。以顆粒狀存在的R. oryzae菌落 形態(tài)穩(wěn)定，可從發(fā)酵液中輕松分離得到，并能重復利用進行菌體發(fā)酵。此外，顆粒狀存在的 R. oryzae有助于發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質和氧的傳遞。Zn2\ Mg2+及K+等金屬離子，作為菌體生長過程中所需酶的輔基，具有促進菌體生 長的作用，而過度生長的菌絲體相互纏繞，容易形成菌絲團。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種提高米根霉(lihizopus oryzae)產(chǎn)酸能力 的方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案控制培養(yǎng)基中其它成分的濃度不變，降 低金屬離子Zn2+、Mg2+及K+的濃度，使R. oryzae菌落呈現(xiàn)顆粒狀。發(fā)酵用米根霉(R. oryzae)購買于美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(Agricultural Research ServiceCulture Collection, NRRL 3563)。發(fā)酵產(chǎn)酸條件將30°C條件下培養(yǎng)7d的孢子斜面用無菌水洗下，以4%的種量接 種種子培養(yǎng)基(50πι ν250πιυ三角瓶，30°C、200r/min培養(yǎng)30h，定時取樣觀察菌落形態(tài)，然 后以10 %的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵72h，結束發(fā)酵，取樣測定產(chǎn)酸量。涉及的培養(yǎng)基產(chǎn)孢子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖4.0，乳糖6.0，甘油10.0，玉米漿1.0，尿素0.6，蛋白 胨 1. 6，MgSO4 · 7H20 0. 3，ZnSO4 · 7H20 0. 088，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 25，硫酸銅 0· 005，KH2PO4O. 4， MnSO4 · 4H20 0. 05，KCl 0. 4，NaCl 40，瓊脂 20。種子培養(yǎng)基(g/L)種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨6，CaC036。優(yōu)選種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，大豆蛋白胨6，CaC036, KH2PO4O. 3， MgSO4 · 7Η200· 125，ZnSO4 · /H2O 0. 044。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖100，(NH4) 2S042，KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4， ZnSO4 · 7H20 0. 044，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 01，CaC0380,甲醇 15。所有的培養(yǎng)基由去離子水配制后，12rC，15min滅菌。菌落形態(tài)鑒定將培養(yǎng)到一定時期的R. oryzae菌體倒在培養(yǎng)皿上，Sony相機拍照，觀察菌落形態(tài)。延胡索酸含量的測定采用高效液相色譜(HPLC)測定。色譜柱=Aminex HPX-87H(Bio-Rad)，流動相0. 005M H2SO4,流速0. 5mL/min,柱溫;35°C，進樣量5 μ L，檢 測器示差折光檢測器。發(fā)明原理從蛋白質水平講，Si2+參與了碳酸酐酶、DNA聚合酶、堿性磷酸酶、乳酸 脫氫酶等酶類的合成；Mg2+為磷酸基轉移酶、ATP水解酶的輔助因子。從核酸水平講，Zn2+參 與核酸的合成；Mg2+為核苷酸切除修復所有基本步驟的必需輔助因子。從細胞水平講，Mg2+ 能與膜磷脂靜電性結合改變其局部區(qū)域的結構從而穩(wěn)定和保護生物膜；K+對維持細胞內外 的滲透壓平衡及膜電位梯度具有重要的作用，K+通道轉運活性降低會嚴重影響細胞的正常 生命活動。因此，當這三種離子存在時，菌絲體過度生長、相互纏繞，容易形成菌絲團。降低 離子濃度可以改變菌株形態(tài)。


圖1對照實施例下R. oryzae菌落形態(tài)圖2實施例1下R. oryzae菌落形態(tài)圖3實施例2下R. oryzae菌落形態(tài)圖4不同R. oryzae菌落形態(tài)的產(chǎn)酸量a:對照，b:顆粒狀形態(tài)，c:半顆粒狀
具體實施例方式對照實施例本發(fā)明所用的菌種為米根霉(R. oryzae)。先將產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)7d的米 根霉(R. oryzae)孢子用無菌水洗下，以10%的接種量接種種子培養(yǎng)基，30°C、200r/min下 培養(yǎng)30h，將菌體倒在9cm的培養(yǎng)皿上，Sony相機拍照，記錄米根霉的菌落形態(tài)，呈團狀(圖 1)。以10 %的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵72h，結束發(fā)酵，富馬酸產(chǎn)量為39. 93g/L (圖4)。種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，大豆蛋白胨 6，KH2PO4O. 6，MgSO4 · 7H20 0. 25， ZnSO4 · 7H20 0. 088，CaC036。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖100，(NH4) 2S042, KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4， ZnSO4 · 7Η200· 044，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0· 01，CaC0380,甲醇 15。實施例1先將產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)7d的米根霉(R. oryzae)孢子用無菌水洗下，以 10%的接種量接種種子培養(yǎng)基，30°C、200r/min下培養(yǎng)30h，將菌體倒在9cm的培養(yǎng)皿上， Sony相機拍照，記錄米根霉的菌落形態(tài)，呈顆粒狀(圖幻。以10%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng) 基，發(fā)酵72h，結束發(fā)酵，富馬酸產(chǎn)量為46. 87g/L (圖4)。種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，大豆蛋白胨6，CaC036。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖100，(NH4) 2S042, KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4， ZnSO4 · 7Η200· 044，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0· 01，CaC0380,甲醇 15。實施例2先將產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)7d的孢子用無菌水洗下，以10%的接種量接種種子培養(yǎng)基，30°C,200r/min下培養(yǎng)30h，將菌體倒在9cm的培養(yǎng)皿上，Sony相機拍照，記錄米 根霉的菌落形態(tài)，呈半顆粒狀(圖幻。以10 %的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵72h，結束發(fā) 酵，富馬酸產(chǎn)量為41.86g/L (圖4)。種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，大豆蛋白胨 6，CaC036，KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 125，ZnSO4 · 7H20 0. 044。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖100，(NH4) 2S042, KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4， ZnSO4 · 7Η200· 044，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0· 01，CaC0380,甲醇 15。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
權利要求
1.一種提高米根霉(Miizopus oryzae)產(chǎn)酸能力的方法，其特征在于先將米根霉接種 于產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上產(chǎn)孢子，然后用流體洗下米根霉孢子，以10%的接種量接種種子于低無 機離子種子培養(yǎng)基，最后將培養(yǎng)好的種子以10%的接種量接種與發(fā)酵培養(yǎng)基。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于所述低無機離子種子培養(yǎng)基為(g/L)葡萄糖 20，大豆蛋白胨6，CaC036。
3.權利要求1或2任一所述的方法，其特征在于所述低無機離子種子培養(yǎng)基為(g/L) 葡萄糖 20，大豆蛋白胨 6，CaC036, KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 125，ZnSO4 · 7H20 0. 044。
4.權利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖100，(NH4)2S042, KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4，ZnSO4 · 7H20 0. 044，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 01，CaC0380,甲醇 15。
5.權利要求1或2任一所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)孢子的條件為30°C培養(yǎng)7天。
6.權利要求1或4任一所述的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)的條件為30°C、200r/ min 培養(yǎng) 30ho
7.權利要求1所述的方法，其特征在于所述10%接種量中IO5個/mL的孢子。
8.權利要求1所述的方法，其特征在于所述流體為無菌水或種子培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高米根霉(Rhizopus oryzae)產(chǎn)酸能力的方法，屬于發(fā)酵工程領域。本發(fā)明通過降低R.oryzae深層發(fā)酵時微生物生長環(huán)境中的微量金屬離子濃度，改變R.oryzae的菌落形態(tài)，進而提高菌體產(chǎn)酸能力。正常生長條件下(Zn2+、Mg2+及K+的濃度不為0)時，菌落形態(tài)成絲狀或團狀，發(fā)酵結束后，富馬酸產(chǎn)量達到39.93g/L。當種子培養(yǎng)基中Zn2+、Mg2+及K+的濃度均為0時，R.oryzae的菌落形態(tài)成顆粒狀，發(fā)酵結束后，富馬酸產(chǎn)量達到46.87g/L，產(chǎn)酸率提高了17.4％，具有很好的應用前景。
文檔編號C12N1/14GK102120961SQ20101058205
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權日2010年12月10日
發(fā)明者周景文, 周正雄, 堵國成, 陳堅 申請人:江南大學