專利名稱：一種甄別李斯特菌的實時熒光pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甄別李斯特菌的實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
李斯特菌在微生物分類中歸革蘭氏陽性無芽孢桿菌中的位置不定屬，該屬內(nèi) 共有6種菌——單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、伊凡諾夫李斯特菌 (Listeria ivanovii)、無害李其jf特菌(Listeria innocua)、格氏李其jf特菌(Listeria grayi)、其jf 氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、威爾遜李斯特菌(Listeria welshimeri)。 以前的報道中指
出李斯特菌屬中僅單核細胞增生李斯特菌對人有致病性。單核細胞增生李斯特菌廣泛存 在于土壤、水、植物、人和動物的糞便中，中毒癥狀嚴重，除了常見的嘔吐、腹瀉等胃 腸道表現(xiàn)外，還可以侵蝕人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)(主要表現(xiàn)腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等疾病)， 對機體造成極大地傷害，并且死亡率極高，容易引起李斯特菌病的大暴發(fā)。畜禽產(chǎn)品、 蛋、乳制品、蔬菜及各種肉類食品是單增李斯特菌主要的污染源。該致病菌還被列為90 年代威脅食品安全的四大致病菌(單增李斯特菌，致病性大腸桿菌，肉毒梭菌，親水氣 單胞菌)之一。由于單增李斯特菌在4°C的環(huán)境中仍能正常生長繁殖，經(jīng)常污染冷凍食 品，因此也是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。但是隨著研究的不但深入，發(fā) 現(xiàn)該屬內(nèi)除了單核細胞增生李斯特菌對人致病以外，其他的細菌也對人體致病，其余的5 種致病菌均可導致李斯特菌病，同時產(chǎn)生其他臨床癥狀。目前常規(guī)鑒定的鑒定方法中，只有對單增李斯特菌有標準的鑒定方法，而且均 是以常規(guī)培養(yǎng)方法為主，根據(jù)生化特性、致病力及協(xié)同溶血試驗等進行鑒定，鑒定周期 需要5 10天，而屬內(nèi)其他致病菌均無標準鑒定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是根據(jù)ssrA基因設(shè)計引物，提供一種甄別六種李斯特菌的熒光檢測 試劑盒及其檢測方法，可實現(xiàn)對六種李斯特菌快速、準確、特異甄別，使用本發(fā)明所述 的引物及對應(yīng)反應(yīng)體系可以對每種李斯特菌的ssrA基因進行準確分析。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種甄別李斯特菌的實時熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引 物、Eva Green熒光染料、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征 在于所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5‘ -CGTGCATCGCCCATGTGC-3 ‘下游引物5'-ATCTACGAGCGTAGTCAC-3‘。本發(fā)明關(guān)鍵在于特異性引物的設(shè)計和檢測的方法，試劑盒中其他組成，可按本 領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，該試劑盒可用作李斯特菌的定性檢測，也可加入標準品進行定量檢 測。高分辨率熔解曲線技術(shù)(High Resolution Melting，HR )技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的高精度分析方法，利用熒光定量PCR技術(shù)生成溶解曲線，通過讀取其峰值可以將單個 堿基差別的序列進行特異性的鑒定。本發(fā)明選取李斯特菌屬特異性基因，可通過熒光定 量PCR和HRM技術(shù)對屬內(nèi)的六種致病菌進行準確區(qū)分。進一步，為達到定量檢測的效果，所述試劑盒內(nèi)還可包括6種李斯特菌的基因 標準品，所述標準品序列如下單核細胞增生李斯特菌標準品cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgggg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ccgatgttta tgcgaaatgc taatacggtg actacgctcg tagat ；伊凡諾夫李斯特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtc tggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat ；無害李其Jf 特菌標準品cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgagg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ctgatgttta tgcgaaatgc taatacggtg actacgctcg tagat ；格氏李斯特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactagtt aatctccgtc tgaggttaaa tagaagagct taatgagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat ；其j 氏李其j 特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggaaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtc tggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatactaata cggtgactac gctcgtagat ；威爾遜李其Jf 特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactggct aatctccgtc tgaggttagt tggaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggccgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat。本發(fā)明還涉及一種甄別李斯特菌的實時熒光PCR檢測方法，所述方法包括(1)提取待測樣品DNA ；(2)取特異性擴增引物、PCR緩沖液、Eva Green熒光染料、脫氧三磷酸核苷混 合物和DNA聚合酶，分別加入陰性對照品或待測樣品DNA配成PCR反應(yīng)體系，于同等 條件下進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進行熒光檢測；所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5‘ -CGTGCATCGCCCATGTGC-3 ‘下游引物5‘ -ATCTACGAGCGTAGTCAC-3 ‘所述陰性對照品可按本領(lǐng)域常規(guī)方法選擇，通?？蛇x擇副溶血性弧菌、志賀 菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌或空腸彎曲菌等。(3)選擇熒光檢測模式FAM熒光對應(yīng)波長，基線調(diào)整取3 15個循環(huán)的熒光信 號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超 過閾值線，并呈良好的對數(shù)增長，則判斷為李斯特菌陽性。為確定陽性菌株具體為哪一種李斯特菌，所述方法可進一步將樣品DNA的PCR 擴增產(chǎn)物從60°C逐步升溫到90°C，繪制溶解曲線(溶解曲線以溫度(°C)為橫坐標，以相 應(yīng)溫度下熒光強度的負導數(shù)(以10為底)值為縱坐標)，根據(jù)樣品DNA溶解曲線Tm值(指熒光突然急劇下降時的溫度)判斷待測樣品含有哪種李斯特菌Tm值在84.59士0.02 范圍內(nèi)，判斷為單核細胞增生李斯特菌；Tm值在83.67士0.02范圍內(nèi)，判斷為伊凡諾夫 李斯特菌；Tm值在83.55 士0.02范圍內(nèi)，判斷為無害李斯特菌；Tm值在86.10 士0.02范 圍內(nèi)，判斷為格氏李斯特菌；Tm值在85.55士0.02范圍內(nèi)，判斷為斯氏李斯特菌；Tm值 為85.05士0.03范圍內(nèi)，判斷為威爾遜李斯特菌。熔解曲線對PCR產(chǎn)物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈擴增產(chǎn)物逐漸解鏈，導 致熒光強度下降，到達某一溫度時，會導致大量的產(chǎn)物解鏈，熒光急劇下降。利用該 特點，由于不同PCR產(chǎn)物其Tm值的不同，因此使其熒光信號發(fā)生迅速下降的溫度也不 同，可通過此對PCR的特異性進行鑒定。為達到定量檢測的效果，所述方法可同時以梯度濃度的標準品DNA溶液在與樣 品DNA相同條件下進行PCR擴增反應(yīng)，以標準品DNA溶液拷貝濃度的對數(shù)值為橫坐 標、標準品Ct值為縱坐標繪制標準曲線；根據(jù)樣品DNA測得的Ct值，對照相應(yīng)菌株標 準品的標準曲線，獲得樣品DNA的拷貝濃度。所述PCR反應(yīng)條件可按參照本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR方法，具體的，本發(fā)明中 PCR反應(yīng)條件如下95°C變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒，進行40個循環(huán)擴增。PCR反應(yīng)液通常按如下組成配制(終濃度)IXPCR buffer、0.3 0.5μΜ的弓丨 物、1 XEva Green、1 5U的DNA聚合酶、0.2 0.4mM的dNTPs，通常取2 μ L的模 板，反應(yīng)總體積通常為20 50 μ L。本發(fā)明建立了利用染料熒光定量PCR結(jié)合高分辨率熔解曲線技術(shù)甄別六種李斯 特菌的方法，并經(jīng)檢測實際樣本，表明該方法切實可行。由于本方法采用了 PCR擴增和 高分辨率熔解曲線技術(shù)，使得六種李斯特菌甄別的靈敏度大大提高，而且由于高分辨率 熔解曲線技術(shù)的應(yīng)用，使得對含有極少數(shù)不同堿基差異的基因序列能夠準確鑒定，提高 了檢測的準確性。本發(fā)明采用了目前較先進的定量PCR結(jié)合高分辨率熔解曲線技術(shù)，通過一次 PCR反應(yīng)可以將六種李斯特菌進行準確甄別?；蛐蛄兄袎A基的差異可以反應(yīng)在Tm值 的不同上，Tm值的不同可以通過高分辨率熔解曲線技術(shù)進行鑒定。以前使用較多的染 料法使用的均是不飽和染料，同時一起的熔解曲線分辨率只能達到1.0°C，不能滿足單個 堿基差異的區(qū)分。目前，我們使用的染料為Eva Green屬于飽和染料，可以真實的反應(yīng) PCR片段的Tm值，而且目前所使用的熒光定量PCR儀器熔解曲線的精確度為Ο.ΟΙ ， 因此可以對單個堿基的變化進行甄別。使得對于多種同屬內(nèi)的致病菌通過一次PCR反應(yīng) 進行鑒定，節(jié)省了實驗的時間。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在能夠高靈敏度、高特異性、簡便的對六種李斯 特菌進行甄別；可實現(xiàn)對六種李斯特菌的快速、準確、特異檢測和分析，也可加入標準 品進行定量檢測。


圖1為威爾遜李斯特菌的實時熒光定量PCR標準品檢測選取威爾遜李斯特 菌作為檢測的靶細菌，從左至右分別為107、IO6、105、IO4、103、IO2、IO1CFUAnL標準品。
圖2為威爾遜李斯特菌的實時熒光定量PCR標準曲線。標準曲線為Y =-1.935X lgX+38.76 ； Y 對應(yīng)的CT值；X 威爾遜李斯特菌的CFU。 圖3為7例 威爾遜李斯特菌陽性實際樣本熒光定量PCR檢測結(jié)果，CT值分別為13.12、13.28、 13.62、15.03、15.24、15.19 禾口 15.93，細菌數(shù)為 1.67 X IO11CFUAnI^ 1.56 X IO11CFU/ mL、1.38X10nCFU/mL> 7.3 X 1010CFU/mL、6.72 X 1010CFU/mL、6.74X IO11CFUAnL 禾口 4.8X1010CFU/mL。圖4為李斯特菌屬6種細菌對應(yīng)的溶解曲線及Tm值，1、無害李斯特菌 83.56 ； 2、伊凡諾夫李斯特菌83.68 ； 3、單核細胞增生李斯特菌84.58 ； 4、威爾遜 李斯特菌85.07 ； 5、斯氏李斯特菌85.56 ； 6、格氏李斯特菌86.12。(以溫度(V ) 為橫坐標，以相應(yīng)溫度下熒光強度的負導數(shù)值為縱坐標)圖5為7例實際樣本檢測的熔解曲線結(jié)果，7例樣本對應(yīng)的Tm值分別為85.05、 85.07、85.02、85.04、85.06、85.07、85.03。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限 于此實施例1 特異性引物和標準品的獲得1、材料細菌基因組DNA提取試劑購自大連寶生物工程有限公司；PCR反應(yīng)體系和Taq DNA聚合酶購自寶生物(大連)有限公司，pGEM-T-Easy克隆系統(tǒng)、Eva Green染料購 自上海輝睿生物技術(shù)有限公司，377型測序儀、Bio-Radicycler PCR儀，480型定量PCR 儀為瑞士 Roche公司產(chǎn)品。2、引物合成以單核細胞增生李斯特菌ssrA基因序列(注冊號為AF440341)為模板，使用 Primer 5.0軟件分析引物，從中選擇最佳組合。檢測用PCR引物序列如下上游引物5‘ -CGTGCATCGCCCATGTGC-3 ‘下游引物5‘ -ATCTACGAGCGTAGTCAC-3 ‘均由大連寶生物工程有限公司合成。3、檢測標準品制備選取每種李斯特菌的標準菌株(單核細胞增生李斯特菌ATCC 54001、伊凡諾夫 李斯特菌ATCC 19119、無害李斯特菌ATCC 33090、格氏李斯特菌ATCC 25401、斯氏李 斯特菌ATCC 35967、威爾遜李斯特菌ATCC35897)以DNA提取試劑提取基因組DNA， 取1.0 μ 1 (50ng/ μ L)做PCR反應(yīng)模板，用前述上下游引物在Bio-Rad icycler PCR儀上進 行PCR擴增PCR反應(yīng)液組成如下2 X PCR buffer 10.0 μ L上游引物(10μ Μ) IuL下游引物(10μ Μ) IuLDNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.2 μ L
dNTPs (各 250mM) 1.60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1 1 1 1)模板DNA (50ng/ μ L) 1 μ L水補足至20 μ L。PCR條件為94°C 5分鐘變性，94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒進行35個循 環(huán)擴增，最后于72°C延伸5分鐘后置4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后即用克隆系統(tǒng)插入pGEM-T-Easy克隆載體，并將陽性克 隆經(jīng)測序驗證?；厥?66bp片段，即為標準品，測定濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。4、結(jié)果經(jīng)測序，上述設(shè)計標準品完全與預(yù)期相符，回收的標準品片段序列如下單核細胞增生李斯特菌cgtcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgggg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ccgatgttta tgcgaaatgc taatacggtg actacgctcg tagat。伊凡諾夫李其j 特菌cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtc tggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat。無害李其jf 特菌cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgagg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ctgatgttta tgcgaaatgc taatacggtg actacgctcg tagat 格氏李其j 特菌cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactagtt aatctccgtc tgaggttaaa tagaagagct taatgagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat。其j 氏李其j 特菌cgtgca tcgcccatgt gctacggaaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtc tggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgttaccgggctgat gtttatgcga aatactaata cggtgactac gctcgtagat。威爾遜李其j 特菌cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactggct aatctccgtc tgaggttagt tggaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggccgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat。實施例2 熒光定量PCR結(jié)合高分辨率熔解曲線法檢測李斯特菌1、樣本檢測7例實際標本，采用基因組DNA提取試劑提取基因組DNA，分別取l.OyL做模 板，用檢測用上下游引物在Roche公司480型定量PCR儀上進行PCR擴增。 PCR反應(yīng)液組成如下IXPCRbuffer 2μ LIXEvaGreen 2μ L上游引物(10μ Μ) IuL下游引物(10μ Μ) IuLDNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.2 μ LdNTPs (各 250mM) 1.60 μ L
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1 1 1 1)模板DNA (50ng/ μ L) 1 μ L水補足至20 μ L。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒進行40個循環(huán)擴 增，60°C逐步升溫到90°C，形成熔解曲線。以副溶血性弧菌(ATCC 17802)為陰性對照于相同條件下進行PCR檢測，以閾值 線剛好超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線， 并呈良好的對數(shù)增長，則判斷為陽性，否則判斷為陰性結(jié)果。同時在相同條件下以不同濃度標準品進行檢測，并繪制標準曲線。與每種細菌對應(yīng)的Tm值確定檢測的樣本中含有的靶細菌類型。待測樣本的測定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標準曲線計算出檢測樣本中李斯特菌的數(shù) 量。按照上述方法，對志賀菌(ATCC 12022)、沙門菌(ATCC 50035)、金黃色葡萄 球菌(ATCC 25933)、空腸彎曲菌(ATCC 33560)等進行檢測，結(jié)果均呈陰性，說明本發(fā)
明方法特異性好。按照上述方法，對單核細胞增生李斯特菌ATCC 54001、伊凡諾夫李斯特菌 ATCC 19119、無害李斯特菌ATCC 33090、格氏李斯特菌ATCC 25401、斯氏李斯特菌 ATCC 35967、威爾遜李斯特菌ATCC 35897進行檢測，獲得熔解曲線見圖4。2、樣品檢測結(jié)果威爾遜李斯特菌(ATCC 35897)的標準品檢測結(jié)果參見圖1，標準曲線參見圖 2。7例樣本檢出含有威爾遜李斯特菌的不同菌數(shù)，檢測結(jié)果參見圖3 7例樣本熒 光定量PCR檢測結(jié)果，CT值分別為 13.12、13.28、13.62、15.03、15.24、15.19和 15.93， 細菌數(shù)為 lfTXlOnCFU/mL、1.56X 10nCFU/mL> 1.38X 10nCFU/mL> 7.3X IO10CFU/ mL、6.72X 1010CFU/mL、6.74 X IO11CFUAnL 和 4.8 X 1010CFU/mL。根據(jù)樣本的Tm值，確定7例樣本均含有威爾遜李斯特菌，7例樣本對應(yīng)的Tm 值分別為 85.05、85.07、85.02、85.04、85.06、85.07、85.03。本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利 要求書所限定的范圍。
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權(quán)利要求
1.一種甄別李斯特菌的實時熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引 物、Eva Green熒光染料、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征 在于所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5 ‘ -CGTGCATCGCCCATGTGC-3 ‘下游引物5' -ATCTACGAGCGTAGTCAC-3‘。
2.如權(quán)利要求1所述的實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒內(nèi)還包括6 種李斯特菌的基因標準品，所述標準品序列如下單核細胞增生李其J 特菌標準品cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgggg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ccgatgttta tgcgaaatgc taatacggtg actacgctcg tagat ；伊凡諾夫李其j 特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtc tggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat ；無害李其J 特菌標準品cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgagg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ctgatgttta tgcgaaatgc taatacggtg actacgctcg tagat ；格氏李其J 特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactagtt aatctccgtc tgaggttaaa tagaagagct taatgagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat ；其J 氏李其J 特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggaaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtc tggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatactaata cggtgactac gctcgtagat ；威爾遜李其Jf特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactggct aatctccgtc tgaggttagt tggaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggccgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat。
3.—種甄別李斯特菌的實時熒光PCR檢測方法，所述方法包括(1)提取待測樣品DNA；(2)取特異性擴增引物、PCR緩沖液、EvaGreen熒光染料、脫氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶，分別加入陰性對照品或待測樣品DNA配成PCR反應(yīng)體系，于同等條件 下進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進行熒光檢測；所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5 ‘ -CGTGCATCGCCCATGTGC-3 ‘下游引物5 ‘ -ATCTACGAGCGTAGTCAC-3 ‘(3)選擇熒光檢測模式FAM熒光對應(yīng)波長，基線調(diào)整取3 15個循環(huán)的熒光信號， 以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾 值線，并呈良好的對數(shù)增長，則判斷為李斯特菌陽性。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法進一步將樣品DNA的PCR擴增產(chǎn) 物從60°C逐步升溫到90°C，繪制溶解曲線，根據(jù)樣品DNA溶解曲線Tm值判斷待測樣品 含有哪種李斯特菌Tm值在84.59士0.02范圍內(nèi)，判斷為單核細胞增生李斯特菌；Tm值在83.67士0.02范圍內(nèi)，判斷為伊凡諾夫李斯特菌；Tm值在83.55士0.02范圍內(nèi)，判斷為 無害李斯特菌；Tm值在86.10士0.02范圍內(nèi)，判斷為格氏李斯特菌；Tm值在85.55士0.02 范圍內(nèi)，判斷為斯氏李斯特菌；Tm值為85.05士0.03范圍內(nèi)，判斷為威爾遜李斯特菌。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法同時以梯度濃度的標準品DNA溶 液在與樣品DNA相同條件下進行PCR擴增反應(yīng)，以標準品DNA溶液拷貝濃度的對數(shù)值 為橫坐標、標準品Ct值為縱坐標繪制標準曲線；根據(jù)樣品DNA測得的Ct值，對照相應(yīng) 菌株標準品的標準曲線，獲得樣品DNA的拷貝濃度；所述標準品序列如下單核細胞±曾生李其J 特菌標準品cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgggg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ccgatgttta tgcgaaatgc taatacggtg actacgctcg tagat ；伊凡諾夫李其j 特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtc tggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat ；無害李其J 特菌標準品cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgagg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ctgatgttta tgcgaaatgc taatacggtg actacgctcg tagat ；格氏李其J 特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactagtt aatctccgtc tgaggttaaa tagaagagct taatgagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat ；其J 氏李其J 特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggaaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtc tggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatactaata cggtgactac gctcgtagat ；威爾遜李其Jf特菌標準品cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactggct aatctccgtc tgaggttagt tggaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggccgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件如下95DC變性2分鐘，95°C15秒、60°C45秒，進行40個循環(huán)擴增。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種甄別李斯特菌的實時熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引物、Eva Green熒光染料、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5′-CGTGCATCGCCCATGTGC-3′下游引物5′-ATCTACGAGCGTAGTCAC-3′。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在能夠高靈敏度、高特異性、簡便的對六種李斯特菌進行甄別；可實現(xiàn)對六種李斯特菌的快速、準確、特異檢測和分析，也可加入標準品進行定量檢測。
文檔編號C12Q1/04GK102010913SQ201010573158
公開日2011年4月13日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者張政, 程蘇云, 羅蕓, 金大智 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心