專利名稱：降解苯胺菌株3^#的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降解苯胺微生物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
芳香族有機(jī)化合物對(duì)地表水和地下水的污染已成為人類面臨的最大的環(huán)境問(wèn)題之一。苯胺是最簡(jiǎn)單的一級(jí)芳香胺，也是最典型的芳香族化合物。在橡膠、除草劑、染料， 醫(yī)藥、有機(jī)樹(shù)脂、油漆、香水、制革、石油加工、塑料等化工行業(yè)廣泛被采用的原材料，是一種 “三致”物質(zhì)，1989年已被中國(guó)列為“環(huán)境優(yōu)先控制污染物”物質(zhì)之一。隨著工業(yè)化程度的加劇，全球?qū)Ρ桨返男枨笠苍诓粩嗌仙?，?jù)資料顯示，2003年全球苯胺的消費(fèi)量約為2900kt， 全世界以各種形式排入環(huán)境中的廢棄苯胺約為30kt。而苯胺廢水的生物方法以其運(yùn)行成本低利于管理而廣泛推行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株可處理含高濃度苯胺廢水的降解苯胺菌株3#的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的降解苯胺菌株3#，為綠膿桿菌3#(PSeud0m0naS aeruginosa) CCTCCNO :M2010304,已于2010年11月19日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱 CCTCC)，保藏號(hào)CCTCC NO :M2010304o降解苯胺菌株3#的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為綠膿桿菌3#(PSeUd0m0naS aeruginosa) CCTCC NO :M2010304應(yīng)用于含高濃度苯胺廢水的處理中。所述的綠膿桿菌3# (Pseudomonas aeruginosa) CCTCC NO :M2010304 應(yīng)用于含高濃度苯胺廢水的處理方法為挑取固體培養(yǎng)基上的綠膿桿菌3# (Pseudomonas aeruginosa) CCTCCNO :M2010304的單菌落,接種于20mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，25 !35°C、150rpm、pH為6. 0 7. 5的條件下?lián)u床振蕩3 4天，得到降解活性較強(qiáng)的菌濁液；按菌濁液含高濃度苯胺廢水的體積比為1 100，取菌濁液接種于含高濃度苯胺廢水中，25 35°C恒溫培養(yǎng)，PH值為
6.0 7. 5，反應(yīng)60-72小時(shí)。固體培養(yǎng)基牛肉膏0. 3g、蛋白胨1. 0g、氯化鈉0. 5g、瓊脂2g、自來(lái)水100mL、 ρΗ7· 0-7. 2。生長(zhǎng)培養(yǎng)基磷酸氫二鉀5. 17g/L，磷酸二氫鉀1. 70g/L,硫酸銨2. 63g/L，pH值
7.0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺 2000mg/L。所述含高濃度苯胺廢水是指含苯胺的濃度為1800_2200mg/L的廢水。本發(fā)明是從城市污水處理系統(tǒng)脫水活性污泥中馴化、分離、篩選得到的一株在高濃度的苯胺廢水中具有一定的生長(zhǎng)能力的新菌株。并對(duì)其降解苯胺的能力及影響其活性的因素做了研究，結(jié)果表明，該菌株在高濃度的苯胺廢水(即含高濃度苯胺廢水)中，可利用苯胺作為唯一的碳源、氮源、能源，以1800-2200mg/L的苯胺溶液(即苯胺廢水)為例，該菌株在72h內(nèi)將其(苯胺)降解85%以上，說(shuō)明該菌株可處理含高濃度苯胺廢水。本發(fā)明獲得的新菌株即可在高濃度的含苯胺廢液中生存，也可將苯胺作為唯一的碳氮能源加以降解利用。


圖1是降解苯胺菌株3#的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；圖2是降解苯胺菌株3#在苯胺初始濃度不同條件下，對(duì)苯胺的降解效率圖；圖3是降解苯胺菌株3#在培養(yǎng)液pH值不同條件下，對(duì)苯胺的降解效率圖；圖4是降解苯胺菌株3#在培養(yǎng)溫度不同條件下，對(duì)苯胺的降解效率圖；圖5是降解苯胺菌株3#在不同氮源供給條件下，對(duì)苯胺的降解能力特征圖。
具體實(shí)施例方式一、一株降解苯胺菌株3#的篩選方法(1)培養(yǎng)基1)固體培養(yǎng)基牛肉膏0. 3g、蛋白胨l.Og、氯化鈉0. 5g、瓊脂2g、自來(lái)水100mL、 ρΗ7· 0-7. 2。2)普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、自來(lái)水1000mL、 ρΗ7· 0-7. 2。3)馴化培養(yǎng)基牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，苯胺濃度逐漸增加至 2. 5g/L，營(yíng)養(yǎng)成分逐漸減少，pH值7. 0。4)分離培養(yǎng)基牛肉膏2g/L，蛋白胨4g/L，氯化鈉2g/L，苯胺lg/L，pH值7.0，苯胺 1.5g/L，瓊脂 15 20g/L。5)篩選培養(yǎng)基磷酸氫二鉀5. 17g/L，磷酸二氫鉀1. 70g/L,硫酸銨2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺一定濃度(1800_2200mg/L)。6)生長(zhǎng)培養(yǎng)基磷酸氫二鉀5. 17g/L，磷酸二氫鉀1. 70g/L,硫酸銨2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺 2000mg/L。7)無(wú)機(jī)鹽溶液磷酸氫二鉀5. 17g/L，磷酸二氫鉀1. 70g/L,硫酸銨2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量。8)苯胺無(wú)機(jī)鹽溶液磷酸氫二鉀5. 17g/L，磷酸二氫鉀1. 70g/L,硫酸銨2. 63g/L， pH 值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺 250_6000mg/L。以上培養(yǎng)基分別于121°C高壓滅菌30min后備用，需添加苯胺的，將高濃度的苯胺母液(10g/L)用無(wú)菌0. 45um濾膜過(guò)濾除菌后，按比例與已滅好菌的液體培養(yǎng)基混合。(2)實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備臺(tái)式高速離心機(jī)(安亭科學(xué)儀器廠TGL-16G)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用T6新世紀(jì))、手提式蒸汽消毒器(上海三申、光照培養(yǎng)箱(重慶華茂儀器有限公司SHH150G)、光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯ΒΧ40型)、超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司 SW-CJ-10)、菌落計(jì)數(shù)器(上海宏匯電器廠QL-901)、臺(tái)式恒溫?fù)u床(太倉(cāng)市華美生化儀器廠 TH2-C)、電泳儀及電泳槽等。(3)菌株的分離與篩選1)活化菌種來(lái)源于污水處理廠濃縮污泥樣品，取污泥樣品按水泥比100 1分散于水體中，在30°C，150r/min的條件下培養(yǎng)12小時(shí)后備用；
2)馴化取活化菌濁液Iml接種于普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，梯度加入苯胺溶液，每 24小時(shí)取Iml菌液接種于馴化培養(yǎng)基中(苯胺溶液濃度梯度增加至約3g/L，苯胺濃度 1500mg/L后培養(yǎng)時(shí)間增至2天或以上)，備用；3)篩選取馴化后的菌濁液，無(wú)菌梯度稀釋至約2.0X106個(gè)/L涂布于分離培養(yǎng)基上，30°C下恒溫培養(yǎng)至菌落成熟，挑取菌落特征明顯的單菌落劃線與分離培養(yǎng)基上；4)純化待分離培養(yǎng)基上的單菌落成熟后，挑取單菌落至生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天， 取步驟1)中菌液接種于2000mg/L的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，兩天后劃線于1000mg/L的分離培養(yǎng)基，待菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落劃線于新的平板上，如此反復(fù)2-3次后，分離得純種菌，即一株降解苯胺菌株3#。二、降解苯胺微生物菌株鑒定1.對(duì)降解苯胺菌株3#的鑒定對(duì)降解苯胺菌株3#進(jìn)行了生理生化的鑒定以及16S rDNA分子的鑒定，從分子水平確定菌株的種屬。16S rDNA序列分析主要按照以下步驟①細(xì)菌核DNA的提取1)用高壓滅菌的牙簽挑單菌落(一株降解苯胺菌株3#)接種于普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，取1. 5ml菌液于Eppendorf管內(nèi)，8000rpm室溫離心5min，徹底除去上清；2)加STE緩沖液1. 5ml洗滌一次，離心棄上清，再加入0. 567mlTE (lOmmol/ LTris-HCl，lmmol/LEDTA, pH8. 0)溶液，重懸細(xì)菌；3)加 IOwt% SDS30ul 和 20mg/ml 的蛋白酶 K3ul，于 37°C水浴 Ih ；4)加入 5mol/L 氯化鈉溶液 IOul，CTAB/NaCl 80ul，于 65°C育溫 IOmin ；5)加入等積體酚氯仿/異戊醇04 1)混勻，4°C、12000g/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)入另一支Eppendorf管中；6)加入等體積的酚氯仿/異戊醇/(25 24 1)混勻，4°C、12000g/min離心 5min，提取上清液置于另一只管中，如此反復(fù)三次，直至看不到蛋白層為止；7)加入0. 6倍體積的異丙醇，輕柔混合，沉淀DNA，4°C、12000g/min離心5min，棄
上清液；8)用70wt%的乙醇洗滌lmin，離心，棄上清，自然涼干，并將DNA溶于100 μ 1 1/10的TE溶液中；9)加入終濃度為 50 μ g/ml 的 RNase，37°C，30min,去除 RNA，_20°C保存?zhèn)溆谩＂?6SrDNA基因的PCR擴(kuò)增為了進(jìn)一步確定篩選得到的降解苯胺菌株3#的種屬，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取， 采用的引物序列為P1正向引物(5 ‘ -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ‘)和P2反向引物 (5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ‘ )，PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海某生物技術(shù)有限公司完成，同源性檢索利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)比對(duì)相似序列，分析該菌與已知菌種同源性的高低，并作菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)照，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，進(jìn)而判斷兩菌種的菌屬。2、16S rDNA 序列測(cè)定本發(fā)明采用對(duì)16S rDNA序列測(cè)定和分析的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為HlObp的擴(kuò)增帶(用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè))，如圖1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，
測(cè)定其全序列如下。
ctacacatgcaagtcgagcggatgaagggagcttgctcctggattcagcggcggacgggt60
gagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgtccggaaacgggcgctaata120
ccgcatacgtcctgagggagaaagtgggggatcttcggacctcacgctatcagatgagcc180
taggtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccgtaactggt240
ctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcag300
cagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaaga360
aggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgc420
tgttttgacgttaccaacagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaat480
acgaagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcagc540
aagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcC CclclclclC actgagctag600
agtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaagg660
aacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtgg720
ggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgactagccgtt780
gggatccttgagatcttagtggcgcagctaacgcgataagtcgaccgcctggggagtacg840
gccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtgg900
tttatttcgaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgctgagaactttccaga960
gatggattggtgccttcgggaactcagacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtg1020
tcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttggtccttagttaccagca1080
CCtCgggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacg1140
tcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaag1200
ggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagt1260
ctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtg1320
aatacgttccCgggCCttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccaga1380
agtagctagt ctaaccgcaa gggggacggt1410
三、降解苯胺菌株3#的菌落形態(tài)、生理和生化特征見(jiàn)下表1所示。 表1，降解苯胺菌株3#的菌落形態(tài)特征以及主要的生理特征
權(quán)利要求
1.降解苯胺菌株3#的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為綠膿桿菌3#(pseud0m0nas aeruginosa) CCTCC NO :M2010304應(yīng)用于含高濃度苯胺廢水的處理中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解苯胺菌株3#的應(yīng)用，其特征在于所述的綠膿桿菌 3#(Pseudomonas aeruginosa) CCTCC NO :M2010304應(yīng)用于含高濃度苯胺廢水的處理方法為挑取固體培養(yǎng)基上的綠膿桿菌3# (Pseudomonas aeruginosa) CCTCC NO :M2010304的單菌落，接種于20mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，25 35°C、pH為6. O 7. 5的條件下?lián)u床振蕩3 4天， 得到菌濁液；按菌濁液含高濃度苯胺廢水的體積比為1 100，取菌濁液接種于含高濃度苯胺廢水中，25 35°C恒溫培養(yǎng)，pH值為6. O 7. 5，反應(yīng)60-72小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的降解苯胺菌株3#的應(yīng)用，其特征在于固體培養(yǎng)基牛肉膏 0. 3g、蛋白胨 1. Og、氯化鈉 0. 5g、瓊脂 2g、自來(lái)水 100mL、pH7. 0-7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的降解苯胺菌株3#的應(yīng)用，其特征在于生長(zhǎng)培養(yǎng)基磷酸氫二鉀 5. 17g/L，磷酸二氫鉀 1. 70g/L，硫酸銨 2. 63g/L，pH 值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺2000mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的降解苯胺菌株3#的應(yīng)用，其特征在于所述含高濃度苯胺廢水是指含苯胺的濃度為1500-2200mg/L的廢水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降解苯胺微生物的應(yīng)用。降解苯胺菌株3#的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為綠膿桿菌3#(Pseudomonas aerugmosa)CCTCC NOM2010304應(yīng)用于含高濃度苯胺廢水的處理中。該處理方法為挑取固體培養(yǎng)基上的綠膿桿菌3#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NOM2010304的單菌落，接種于20mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，25～35℃、pH為6.0～7.5的條件下?lián)u床振蕩3～4天，得到菌濁液；按菌濁液含高濃度苯胺廢水的體積比為1∶100，取菌濁液接種于含高濃度苯胺廢水中，25～35℃恒溫培養(yǎng)，pH值為6.0～7.5，反應(yīng)60-72小時(shí)。本發(fā)明可處理含高濃度苯胺廢水，該菌株在72h內(nèi)將苯胺降解85％以上。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102167448SQ201010570858
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者孫紅麗, 廉晶晶, 梁杏, 羅澤嬌, 靳孟貴 申請(qǐng)人:中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)