專利名稱：一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可溶性蛋白，它是由人SIRP α的配體⑶47的胞外段，和氨基末端 融合的iTrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成的一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-h⑶47，屬于醫(yī) 藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
CD47又叫整合素相關(guān)蛋白(integrin-associated protein, IAP)，最初從人胎盤 與整合素α νβ 3共純化及從血小板與β 3整合素共免疫沉淀而為人們所認(rèn)識，其功能與整 合素相關(guān)，因此稱其為IAP[1]。CD47是一種廣泛表達(dá)的抗原，存在于所有組織的不同細(xì)胞 上。它是一個50kD的膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白(Ig)超家族的成員。其胞外段即N端為 以IgV樣結(jié)構(gòu)域，之后為高度疏水的五次跨膜區(qū)，胞漿區(qū)即C端為3 36氨基酸長度的四 種不同的剪切體。CD47最初是作為整合素依賴的白細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)蛋白反應(yīng)的調(diào)節(jié)分子 來發(fā)揮作用的，但除此之外，CD47還有許多其他的重要功能。紅細(xì)胞及機體其他正常細(xì)胞 上的⑶47與巨噬細(xì)胞上的SIRPa結(jié)合可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的靶向清除作用，從而組織巨噬細(xì) 胞對正常細(xì)胞的吞噬作用。⑶47與血小板上的αΙΛβ或α νβ 3，黑素瘤細(xì)胞和卵巢腫瘤 細(xì)胞上的α νβ 3平滑肌細(xì)胞和血小板上的α 2 β 1之間存在相對穩(wěn)定的交互作用，促進(jìn)血 小板活化、聚集，腫瘤細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的趨化與擴(kuò)散。CD47同時也是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白血 小板反應(yīng)素(thrombospondin，TSP)的受體，CD47與單克隆抗體及血小板反映素的結(jié)合可 誘導(dǎo)半胱天冬酶依賴的凋亡作用。CD47是T細(xì)胞活化的共刺激因子，活化凋亡過程，誘導(dǎo)T 細(xì)胞無反應(yīng)性。CD47作為SIRP α的胞外配體，在巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的清除過程中發(fā)揮這 重要作用。信號調(diào)節(jié)蛋白α (SIRPa)是免疫球蛋白超家族成員，胞外區(qū)為三個免疫球蛋白 樣結(jié)構(gòu)域；胞漿區(qū)是酪氨酸磷酸化結(jié)合位點。⑶47通過與巨噬細(xì)胞上SIRP-a的相互作用， 使SIRPa上的ITIM基序磷酸化，募集包含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶至胞膜，抑制細(xì) 胞表面肌球蛋白的聚集，從而抑制吞噬作用。包含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶包括 SHP-I和SHP-2，均是非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，SHP-I主要表達(dá)在造血細(xì)胞上，逆向調(diào)節(jié)許 多細(xì)胞功能；SHP-2表達(dá)廣泛，調(diào)節(jié)小GTP結(jié)合蛋白Ras，Rho的功能，正向調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。 最早確定CD47在調(diào)節(jié)吞噬中的作用的證據(jù)是來源于CD47缺陷的小鼠的RBC移植入野生鼠 體內(nèi)后被迅速清除，RBC表面的CD47與巨噬細(xì)胞表面的SIRP-a結(jié)合，傳遞抑制信號，與巨 噬細(xì)胞表面受體與吞噬性配體結(jié)合產(chǎn)生的吞噬性信號相沖突，使紅細(xì)胞不被吞噬。有研究表明，對于白血病來說，巨噬細(xì)胞的吞噬作用是腫瘤免疫監(jiān)視的重要調(diào)節(jié) 因素，髓系，淋巴系白血病細(xì)胞及白血病干細(xì)胞上⑶47表達(dá)上調(diào)，可通過與SIRPa間的相互 作用，阻止白血病細(xì)胞被宿主的先天免疫系統(tǒng)清除。這也是白血病耐藥、復(fù)發(fā)的重要原因之 一。通過單克隆抗體阻斷⑶47/SIRPa間的作用，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞對白血病細(xì)胞及白血 病干細(xì)胞的吞噬作用，對于白血病的治療有著重要的治療意義。本發(fā)明基于⑶47在調(diào)節(jié)吞噬中的重要作用，表達(dá)了可溶性的⑶47的胞外段蛋白，與白血病細(xì)胞上⑶47競爭結(jié)合巨噬細(xì)胞上的SIRP α，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞 噬作用

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-h⑶47，該蛋白可 以結(jié)合于巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面，有效地增強巨噬細(xì)胞對白血病細(xì)胞及白血病干細(xì)胞的吞噬作用。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHi s-h⑶47，其特征 是它是由人⑶47蛋白胞外段和融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成；其中h⑶47蛋白胞外段是 h⑶47第1-142位氨基酸。所述的h⑶47第1-142位氨基酸包含負(fù)責(zé)與SIRP α受體結(jié)合的IgV樣結(jié)構(gòu)域； 所述的融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽是該可溶性蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol，并由 Νο2的核酸序列編碼所述的白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-h⑶47具有No3的氨基酸序列，并由 No4的核酸序列編碼所述氨基末端融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸 序列編碼所述白血病干細(xì)胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-h⑶47是在大腸桿菌BL21中用低 溫誘導(dǎo)方法實現(xiàn)可溶性表達(dá)，并用針對His標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純 的 TrxHis-hCD47 蛋白。本發(fā)明的特點是TrxHis-h⑶47在體外可以通過基因工程進(jìn)行大量生產(chǎn)，應(yīng)用 于體內(nèi)時可與巨噬細(xì)胞上的抑制性受體SIRP-α (signal regulatory protein alpha)結(jié) 合，阻止白血病細(xì)胞及白血病干細(xì)胞上的⑶47與SIRP-α結(jié)合，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對白血 病細(xì)胞及白血病干細(xì)胞的吞噬作用，對于白血病的治療有著重要意義。


圖l、hCD47胞外段蛋白的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建和作用模式圖2、目的基因(hCD47)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；
圖3、表達(dá)載體pET3^i-hCD47的結(jié)構(gòu)示意圖4、表達(dá)載體pET3h-hCD47的酶切鑒定圖5、TrxHis-hCD47融合蛋白表達(dá)的蛋白電泳圖6、TrxHis-hCD47融合蛋白的純化的電泳圖；Western blot定性檢測
圖7、TrxHis-hCD47融合蛋白的活性檢測圖8、熒光顯微鏡下計數(shù)吞入Jurkat細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)。
具體實施例方式以下通過附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明做詳盡的說明。1、構(gòu)建表達(dá)載體。圖1是融合蛋白的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建和作用模式圖。根據(jù)h⑶47的序 列設(shè)計引物 Pl :5，-GATATCATGTGGCCCCTGGTAGCGG-3‘ ；P2 :5，-GGATCCATTTTCATTTGGAGAAAACC-3’。以人淋巴結(jié)cDNA為模板，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增編碼hCD47胞外段氨基酸的多核苷酸序 列(圖2)，1. 5%瓊脂糖電泳回收后與pMDIS-T載體16°C連接2小時，熱休克轉(zhuǎn)化大腸桿菌 XL10，擴(kuò)增后將目的片段亞克隆至表達(dá)載體pET3h(+)，構(gòu)建pET3h-hCD47(圖3)，限制性 酶切(圖4)、測序鑒定。圖l、h⑶47胞外段蛋白的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建和作用模式圖。圖2、目的基因(h⑶47)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，1道(M)是分子量標(biāo) 志(DL2000)，箭頭所指為擴(kuò)增片段。圖3、表達(dá)載體pET3h_hCD47的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為表達(dá)載體pET3h_h⑶47的酶切鑒定圖；(質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶 EcoRV+BamHI雙酶切和EcoRI單酶切，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。M道是marker DL2000, 1-4道分別是不同克隆的酶切結(jié)果)2、誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。將表達(dá)載體pET3h(+)、pET3h-hCD47分別以熱休克法轉(zhuǎn) 化大腸桿菌BL21，涂布含100μ g/ml氨芐青霉素LB平板，37°C培養(yǎng)12小時后挑取單克隆 接種到含100 μ g/ml氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，200rpm，37°C培養(yǎng)12h，以轉(zhuǎn)接到新鮮 LB (+)培養(yǎng)基中，200rpm，37°C培養(yǎng)汕后，加入終濃度1. OmM的IPTG，200rpm, 25°C培養(yǎng)Mh。3、獲得TrxHis_hCD47的包涵體蛋白。離心收集細(xì)菌，200 μ 1/ml培養(yǎng)基PBS重懸 細(xì)菌，超聲裂菌，加入iTrit0n-XlOO,混勻，4°C靜置30分鐘，4°C離心收集上清和沉淀， SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，TrxHis-h⑶47蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中(圖5)。圖5為TrxHi s_hCD47融合蛋白表達(dá)的蛋白電泳圖。將質(zhì)粒pET3h (+)、 pET32a-hCD47分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，小體積培養(yǎng)后IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，然后取全 細(xì)菌裂解物、裂解上清(可溶性組分)和裂解沉淀(即包涵體)分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。 M 是分子量標(biāo)志(由上到下分別是 170KD，130KD, 100KD, 70KD, 55KD, 40KD, 35KD, 25KD, 15KD, 10KD)4、純化包涵體蛋白。pET32a(+)空載體蛋白TrxHis從細(xì)菌裂解上清中純化， TrxHis-hCD47以鎳離子螯合柱(Invitrogen ProBondTM)純化包涵體蛋白，所有純化步驟 以ftOBondTM純化手冊操作。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行 Western blot，見在TrxHis_hCD47可檢測到大小正確的蛋白條帶(圖6)。圖6為TrxHis_hCD47融合蛋白的純化及Wfestern blot檢測。從轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒 pET3h-h⑶47的轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的復(fù)性上清用鎳金屬螯合柱純化含有His標(biāo)簽的蛋白， 進(jìn)行SDS-PAGE分析。M道是蛋白分子量標(biāo)志。下圖是融合蛋白Western blot檢測結(jié)果，一 抗是抗Hi s標(biāo)簽抗體。5、蛋白活性測定將小鼠巨噬細(xì)胞系7以2 X IO5/孔的密度接種于12孔 板中，貼壁過夜。之后將Dio標(biāo)記的人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞以2X IO4/孔 的密度添加到預(yù)先接種有巨噬細(xì)胞的十二孔板中，同時添加CD47胞外段蛋白(6 μ g/ml)， Trx蛋白(6 μ g/ml)作為對照。處理組和對照組分別設(shè)三個復(fù)孔。蛋白作用2小時后熒光 顯微鏡下計數(shù)吞噬有Jurkat細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，分別計數(shù)十個視野，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué) 分析。(圖7、圖8)圖7為熒光顯微鏡下觀察對照組與處理組巨噬細(xì)胞對Jurkat細(xì)胞的吞噬情況，箭 頭所指為吞噬了 Jurkat細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。
圖8為熒光顯微鏡下計數(shù)吞入Jurkat細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，分別計數(shù)十個視野，之 后對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果，兩樣本t檢驗，P < 0. 05，有統(tǒng)計學(xué)意義。由以上可制得本發(fā)明這種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-h⑶47，它是由人 ⑶47蛋白胞外段和融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成；其中h⑶47蛋白胞外段是h⑶47第1-142
位氨基酸。所述的h⑶47第1-142位氨基酸包含負(fù)責(zé)與SIRP α受體結(jié)合的IgV樣結(jié)構(gòu)域；所 述的融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽是該可溶性融合蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol，并 由No2的核酸序列編碼所述的白血病干細(xì)胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-h⑶47具有No3的氨基酸序列， 并由No4的核酸序列編碼所述氨基末端融合TrxHis表達(dá)標(biāo)簽，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序 列編碼所述白血病干細(xì)胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-h⑶47是在大腸桿菌BL21中用低 溫誘導(dǎo)方法實現(xiàn)可溶性表達(dá)，并用針對His標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純 的 TrxHis-hCD47 蛋白。本發(fā)明的一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-h⑶47在體外 可以通過基因工程進(jìn)行大量生產(chǎn)，應(yīng)用于體內(nèi)時可與巨噬細(xì)胞上的抑制性受體 SIRP-α (signalregulatory protein alpha)結(jié)合，阻止白血病細(xì)胞及白血病干細(xì)胞上的 ⑶47與SIRP-α結(jié)合，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對白血病細(xì)胞及白血病干細(xì)胞的吞噬作用，對于 白血病的治療有著重要意義。
權(quán)利要求
1.一種白血病干細(xì)胞靶向的可溶性蛋白 χΗ4-Μ047，其特征是它是由人CD47胞外 段和融合的fTrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成；其中⑶47胞外段是指⑶47第1 142位氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白血病干細(xì)胞靶向的可溶性蛋白fTrxHis-hCD47，其特 征是所述的hCD47第1 142位氨基酸包含與SIRP α結(jié)合的IgV樣結(jié)構(gòu)域及上游序列； 所述的融合的fTrxHis表達(dá)標(biāo)簽是該可溶性蛋白的氨基末端，其中，氨基酸序列是Nol，并由 No2的核酸序列編碼Nol TrxHi s-hCD47的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygi rgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadimwplvaalllgsaccgsaqlIfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspne ngsefelrrgacgrtrappppplrsgcNo2 TrxHis-hCD47 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc tcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcaggg caaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactc tgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacg ctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggt atgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccat ggctgatatcatgtggcccctggtagcggcgctgttgctgggctcggcgtgctgcggatcagctcagctactatttaa 3.3.3.3. C 3.3.3.atctgtagaattcacgttttgtaatgacactgtcgtcattccatgctttgttactaatatggaggcacaaaac actactgaagtatacgtaaagtggaaatttaaaggaagagatatttacacctttgatggagctctaaacaagtccactgtccccac tgactttagtagtgcaaaaattgaagtctcacaattactaaaaggagatgcctctttgaagatggataagagtgatgctgtct cacacacaggaaactacacttgtgaagtaacagaattaaccagagaaggtgaaacgatcatcgagctaaaatatcgtgttgt ttcatggttttctccaaatgaaaatggatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccac caccact
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其特征 是所述的白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-h⑶47具有No3的氨基酸序列，并由No4 的核酸序列編碼No3 :h⑶47胞外段的氨基酸序列mwplvaalllgsaccgsaqlIfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgaln kstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspnen No4 :h⑶47胞外段的核酸序列atgtggcccctggtagcggcgctgttgctgggctcggcgtgctgcggatcagctcagctactatttaataaaa caaaatctgtagaattcacgttttgtaatgacactgtcgtcattccatgctttgttactaatatggaggcacaaaacactac tgaagtatacgtaaagtggaaatttaaaggaagagatatttacacctttgatggagctctaaacaagtccactgtccccactgac tttagtagtgcaaaaattgaagtctcacaattactaaaaggagatgcctctttgaagatggataagagtgatgctgtctcaca cacaggaaactacacttgtgaagtaacagaattaaccagagaaggtgaaacgatcatcgagctaaaatatcgtgttgtttea tggttttctcc3.3.3. 3.3.3. ο
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白 χΗ4-Μ047，其特征 是所述氨基末端融合fTrxHis表達(dá)標(biāo)簽，包含Νο5的氨基酸序列，并由Νο6的核酸序列編 碼Νο5 TrxHi s的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygir giptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmds pdlgtddddkamadi No6 TrxHis的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc tcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcaggg caaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactc tgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacg ctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccat ggctgatatc 。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白血病干細(xì)胞靶向的可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其 特征是所述白血病干細(xì)胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47是在大腸桿菌BL21中用低溫 誘導(dǎo)方法實現(xiàn)可溶性表達(dá)，并用針對His標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的 TrxHis-hCD47 蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白血病干細(xì)胞靶向的可溶性蛋白TrxHis-hCD47，它是由人CD47蛋白胞外段即第1~142位氨基酸和TrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成，表達(dá)載體是pET32a。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后采取25℃低溫誘導(dǎo)24h實現(xiàn)與TrxHis可溶性融合表達(dá)，用針對His標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的TrxHis-hCD47蛋白。TrxHis-hCD47在體外可通過基因工程進(jìn)行大量合成，應(yīng)用于體內(nèi)時可與巨噬細(xì)胞上的抑制性受體SIRP-α(signal regulatory protein alpha)結(jié)合，阻止白血病干細(xì)胞上的CD47與SIRP-α結(jié)合，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對白血病細(xì)胞及白血病干細(xì)胞的吞噬作用，對于白血病的治療有著重要意義。
文檔編號C12N15/62GK102070719SQ201010557999
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者嚴(yán)學(xué)倩, 梁英民, 韓驊 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)